(2)校准曲线:采用同位素内标法定量，利用Analyst软件以标准物与内标物的浓 度比为X轴，标准物与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，然后根据待测尿液样品中目标 物和内标物峰面积之比得到其在校准曲线上对应的待测物浓度和内标物浓度之比，结合已 知的内标物浓度可计算出待测尿液中目标物的浓度。对2种分析物在各自浓度范围内进行 线性拟合，得到的线性方程相关系数均在0.998以上，线性良好(表6)。同时，试剂盒也考察 了2种目标分析物的最低定量限LLOQ，以信噪比不低于10且RSD小于20 %的最小浓度点为最 低定量限LLOQ;定量限以上RSD小于15%，回归系数R2>0.98的最低浓度值和最高浓度值作 为检测方法的线性范围。各项参数均可满足人体尿液样品中8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷 的检测需求。
[0111] 表6 8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷线性范围、相关系数和最低定量限
[0112]
[0113] (3)精密度试验:取10个以上尿液样本混合均匀，以混合尿样为添加基质做添加回 收和精密度验证，按照高中低三个浓度分别添加标准品（8-羟基脱氧鸟苷：4.8ng/mL、 28 · 8ng/mL和57 · 6ng/mL; 8-羟基鸟苷：4 · 85ng/mL、29 · lng/mL、58 · 2ng/mL)，每个浓度样品平 行处理6次，求得批内精密度和回收率，试验结果见表7。每日处理高、中、低浓度样品各一 个，连续处理6天，求得批间精密度，试验结果见表8。
[0114] 表7批内精密度试验结果
[0115]
[0
[0117]表8批间精密度试验结果 [0118]
[0119] 4、讨论
[0120] 目前8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷两种生物标记物较常见的检测方法有高效液 相色谱电化学法(HPLC-ECD)，气相色谱串联质谱法(GC-MS)，液相色谱串联质谱法(LC-MS/ MS)，酶联免疫法等。其中酶联免疫法特异性较差，HPLC-ECD法较为复杂，GC-MS法需要衍生 化处理，且衍生化过程中存在的氧化作用可能引起8-羟基脱氧鸟苷含量人为增加。同以上 几种检测手段相比，LC-MS/MS对样本量需求较少，样品前处理相对较为简单，且质谱法具有 特异性强、灵敏度高的优点。
[0121 ]由于8-羟基脱氧鸟苷（lgP = -l · 7，pKa= 10 · 09，水溶性为14· 8mg/mL)同8-羟基鸟 苷两种物质均为极性较强的碱性化合物。要将这些极性较强的化合物从尿液样本基质中分 离出来比较困难。常规的液液萃取法萃取效率过低，不能满足检测要求。且常规的C18色谱 柱对两种物质保留性弱，不能有效的分离目标物，导致基质干扰效应较强，而且有研究表明 2_脱氧鸟苷(2-deoxyguanosine，2_dG)在电喷雾离子源(ESI)离子化的过程中会被氧化成 8_羟基脱氧鸟苷，因此要准确定量尿液中8-羟基脱氧鸟苷的含量，需要将2-脱氧鸟苷同8-羟基脱氧鸟苷用色谱分离开来。
[0122] 迄今为止，文献中有关LC-MS/MS法检测两种物质的报道多采用SPE固相萃取法对 尿液样本进行净化和富集。但固相萃取法步骤繁琐，对操作人员的操作技能要求高，费时费 力，检测通量低，且回收率和稳定性均有较大局限性。此外，固相萃取法对试剂和耗材消耗 量大，成本较高，不利于广泛的推广和应用。且现有的方法多采用常规的C18色谱柱对目标 物进行色谱分离，由于两种物质的反相保留效果差，因此往往需要通过采用高比例的水相 或增加色谱柱长度来增强保留作用，但持续的高比例水相会导致常规C18色谱柱填料塌陷 现象，影响分离效果。
[0123] 本发明正是基于以上所述现有技术的不足和缺陷之处开发了一种人体尿液中8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷快速前处理法和优异的色谱分离法，并结合串联四极杆质谱法 对两种物质进行定量分析。
[0124] 本发明采用直接稀释法同时检测8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷，只需要100μΙ尿 液样本，无须复杂的样品前处理过程，样品稀释后经极性内嵌的Polar-RP色谱柱分离，有效 的排除了基质干扰和离子化过程中的干扰，且不会产生柱塌陷现象，只需5min即可完成一 次分离和检测任务，较现有的方法通量提高较多，且回收率和稳定性良好(批内精密度在 3.63 %~6.39 %之间，批间精密度在3.88 %~9.35 %之间，批内和批间RSD均在10 %以内， 平均回收率在91.90%~116.76%之间），具有准确、简便、经济、高效等优点，适于临床检测 中推广应用。虽然采用直接稀释法方法的检出限会有所升高，但根据现有文献以及本试剂 盒批量抽检的101例人尿液检测结果显示8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的含量范围分别为 0~20.37ng/mL和0~24.99ng/mL，而本发明的的检出限分别为0.24ng/mL和0.485ng/mL，能 够满足人体尿液中两种物质的检测要求。
【主权项】
1. 高效液相色谱串联二级质谱技术检测尿液中8-?基脱氧鸟巧和8-?基鸟巧的试剂 盒，其特征在于，所述的试剂盒包括如下试剂： (1) 洗脱液： 洗脱液A: 0.1 % v/v甲酸水溶液； 洗脱液B:乙腊； (2) 标准品溶液:含8-径基脱氧鸟巧和8-径基鸟巧的空白人工尿液基质溶液； (3) 内标物工作液:含["C，1? ] -8-径基脱氧鸟巧的甲醇溶液； (4) 稀释液： 稀释液1:至白人工尿液基质； 稀释液2:甲醇； (5) 有机溶剂：甲醇； (6) 质控品：含有8-径基脱氧鸟巧和8-径基鸟巧的空白人工尿液基质溶液，分高中低Ξ 个浓度，分别为QCXH)、QC(M)、Q(XL); 其中，Q(XH)、QC(M)、QC(L)中8-?基脱氧鸟巧和8-?基鸟巧质控品对应浓度见表1; 表1 8-径基脱氧鸟巧和8-径基鸟巧质控品对应浓度(单位ng/mL)2. 根据权利要求1所述的高效液相色谱串联二级质谱技术检测尿液中8-径基脱氧鸟巧 和8-径基鸟巧的试剂盒，其特征在于，所述的标准品溶液包括混合标准液C2和混合标准液 C3;其中，所述的混合标准液C2为含浓度为96ng/mL的8-径基脱氧鸟巧和浓度为97ng/mL的 8-径基鸟巧的空白人工尿液基质溶液，所述的混合标准液C3为含浓度为9.6ng/mL的8-径基 脱氧鸟巧和浓度为9.化g/mL的8-径基鸟巧的空白人工尿液基质溶液。3. 根据权利要求1所述的高效液相色谱串联二级质谱技术检测尿液中8-径基脱氧鸟巧 和8-径基鸟巧的试剂盒，其特征在于，所述的内标物工作液为含浓度为0.991yg/mL的[1化 ，15化]-8-径基脱氧鸟巧的甲醇溶液。4. 根据权利要求1所述的高效液相色谱串联二级质谱技术检测尿液中8-径基脱氧鸟巧 和8-径基鸟巧的试剂盒，其特征在于，所述的空白人工尿液基质为含0.5586g/L二水合氯化 巧、0.6099g/L六水合氯化儀、4.2077g/L氯化钢、2.0596g/L硫酸钢、0.6470g/L巧樣酸钢二 水合物、0.020Ig/L草酸钢、2.5449g/L憐酸二氨钟、1.4388g/L氯化钟、0.9200g/L氯化锭、 2.4985g/L尿素和1.0520g/L肌酢的水溶液。5. 根据权利要求1所述的高效液相色谱串联二级质谱技术检测尿液中8-径基脱氧鸟巧 和8-径基鸟巧的试剂盒，其特征在于，所述的尿液为人或动物的尿液。6. 权利要求1所述的高效液相色谱串联二级质谱技术检测尿液中8-径基脱氧鸟巧和8- 径基鸟巧的试剂盒的制备方法，其特征在于， (1)洗脱液： 洗脱液A:配制0.1 % v/v甲酸水溶液； 洗脱液B:乙腊； (2) 标准品溶液： 分别准确称量5mg的8-径基脱氧鸟巧和8-径基鸟巧，于甲醇中溶解定容至lOmL，配制成 浓度分别为0.48mg/mL和0.485mg/mL的储备液A和B，-20°C保存;取储备液A和B各100化混合 后用甲醇稀释后定容至lOmL，配制成8-径基脱氧鸟巧浓度为4.祉g/mL，8-径基鸟巧浓度为 4.85yg/mL的混合标准液C1，-20°C保存;取10化L混合标准液C1用空白人工尿液基质稀释后 定容至5mL，配制得到8-径基脱氧鸟巧浓度为96ng/mL，8-^基鸟巧浓度为97ng/mL的混合标 准液C2;取5(Κ)化混合标准液C2用空白人工尿液基质稀释后定容至5mL，配制得到8-径基脱 氧鸟巧浓度为9.6ng/mL，8-径基鸟巧浓度为9.化g/mL的混合标准液C3; (3) 内标物工作液： 准确称量5mg的[13(：，15化]-8-径基脱氧鸟巧，用甲醇溶解定容至lOmL后得到浓度为 49.55yg/mL的内标物储备液，内标物储备液经甲醇稀释至0.99 lyg/mL得到内标物工作液D; 内标物储备液和内标物工作液D均于-20°C下保存； (4) 稀释液： 稀释液1:分别取0.5586g二水合氯化巧、0.6099g六水合氯化儀、4.2077g氯化钢、 2.0596g硫酸钢、0.6470g巧樣酸钢二水合物、0.020 Ig草酸钢、2.5449g憐酸二氨钟、1.4388g 氯化钟、0.9200g氯化锭、2.4985g尿素和1.0520g肌酢用水溶解并定容至1L; 稀释液2:甲醇； (5) 有机溶剂：甲醇； (6) 质控品：分别取10化、6化L、12化L步骤(2)中得到的混合标准品C1用空白人工尿液 基质定容至lOmL得到。7.权利要求1~5中任意一项所述的试剂盒在利用高效液相色谱串联二级质谱技术检 测尿液中8-径基脱氧鸟巧和8-径基鸟巧中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种高效液相色谱串联二级质谱技术检测尿液中8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的试剂盒，它包括洗脱液、标准品溶液、内标物工作液、稀释液、有机溶剂和质控品。与现有技术相比，本发明高效稳定，回收率和稳定性良好(批内精密度在3.63％～6.39％之间，批间精密度在3.88％～9.35％之间，批内和批间RSD均在10％以内，平均回收率在91.90％～116.76％之间)，具有准确、简便、经济、高效等优点，适于临床检测中推广应用。
【IPC分类】G01N30/02
【公开号】CN105548402
【申请号】CN201610005612
【发明人】张卫卫, 于嘉屏
【申请人】上海迪安医学检验所有限公司
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年1月6日