预处理方法及阿莫西林、青霉素g和青霉素v的检测方法

预处理方法及阿莫西林、青霉素g和青霉素v的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种预处理方法及阿莫西林、青霉素 G和青霉素 V的检测方法。
【背景技术】
[0002] 阿莫西林、青霉素 G和青霉素 V是畜牧业最常用的兽药，都属于β-内酷胺类抗生素， 是青霉素类广谱抗生素。阿莫西林，又名安莫西林或安默西林，其杀菌作用强，穿透细胞膜 的能力强，是目前应用较为广泛的口服青霉素之一。青霉素 G又被称为盘尼西林、青霉素钢、 节青霉素钢、青霉素钟或节青霉素钟等。青霉素 G是抗菌素的一种，是从青霉菌培养液中提 制的分子中含有青霉烧、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗 生素，对多数革兰阳性菌、革兰阴性球菌、个别革兰阴性杆菌(如嗜血杆菌属）、螺旋体和放 线菌均有抗菌活性，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。青霉素 V抗菌谱与青霉素 G相同， 但对产β内酷胺酶的菌株无抗菌作用，比如金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌等。青霉 素 V与青霉素 G相比，对大多数敏感菌株的活性弱2~5倍。青霉素 V的作用机制也是抑制细菌 细胞壁的合成，使细菌迅速破裂而溶解。
[0003] 牛奶是一种大众日常的消费品，随着人们对食品安全要求日益提高，牛奶的安全 质量问题也越来越为人们重视。但从我国国内养殖环境来看，在我国大部分地区，特别是广 大农村地区的养殖动物和生产饲料过程中，仍存在超量或超范围使用抗生素、不严格执行 药物配伍禁忌或停药期规定的情况，甚至会存在使用违禁抗生素等现象。因食物链传递，牛 奶中大量残留的抗生素会对人体造成危害。另外，从乳制品加工的角度来看，原料乳中残留 的抗生素会严重影响干酪、黄油和发酵乳的起酵或后期风味的形成。
[0004] 现有技术中，原料乳和/或液态乳制品中残留的阿莫西林、青霉素 G和青霉素 V含量 的检测方法主要有高效液相色谱法化PLC)、液相色谱-质谱化PLC-MS/MS)和酶联免疫方法 等；其预处理多采用液液萃取和固相萃取等方法，国标方法预处理方法采用3步固相萃取 法。目前现有的固相萃取预处理方法主要包括:活化、上样、淋洗和收集流出液，其中，淋洗 和收集流出液所占时间占前处理所需时间的80%左右。故现有的固相萃取预处理方法存在 的问题是操作步骤多、耗时长、有机溶剂使用量大W及不利于环保的缺陷。该现象亟待解 决。

【发明内容】

[0005] 本发明所要解决的技术问题是克服了现有技术对原料乳和/或液态乳制品中残留 的阿莫西林、青霉素 G和青霉素 V中的一种或多种的含量进行检测前，其固相萃取预处理方 法操作步骤多、耗时长W及有机溶剂使用量大的缺陷，提供了一种预处理方法及阿莫西林、 青霉素 G和青霉素 V的检测方法。本发明的预处理方法快速、简单、经济、可靠，能够有效地提 取出待测组分，去除复杂基质影响，有益于待测样品的快速检测。而且在保持较高提取率的 同时，节约了有机溶剂的使用、排放和损失，有利于保护环境，节约了预处理步骤、时间和能 耗，具有较强的应用价值。本发明的检测方法可用于检测阿莫西林、青霉素 G和青霉素 V中的 一种或多种，且检测方法快速，简单，精密度高，准确性高。
[0006] 本发明通过W下技术方案解决上述技术问题。
[0007] 本发明提供了一种预处理方法，其包括W下步骤：
[0008] (1)将待测样品和乙腊的混合物，离屯、，收集上清液;所述的待测样品为不含固体 颗粒的乳制品；
[0009] (2)将所述上清液上样至已经活化的Oasis PRiME HLB固相萃取小柱，收集流出 液，即得预处理后的待测样品。
[0010] 步骤(1)中，所述的待测样品较佳地为原料乳和/或液态乳制品。
[0011] 其中，所述的液态乳制品为本领域常规的液态乳制品，较佳地为高巧牛奶、高铁牛 奶、低乳糖牛奶和低脂牛奶中的一种或多种，更佳地为高巧牛奶、低乳糖牛奶和高铁牛奶中 的一种或多种。
[0012] 其中，所述的原料乳为本领域常规的原料乳，较佳地为牛乳。除所述待测组分外， 所述牛乳的成分及含量一般如表1所示：
[0013] 表1
[0014]
[0015] 其中，百分比为各组分相对于牛乳的质量百分比。
[0016] 步骤(1)中，所述的待测样品可能含有阿莫西林、青霉素 G和青霉素 V中的一种或多 种。该些组分可能是由于养殖动物和生产饲料过程中，超量或超范围使用抗生素、不严格执 行药物配伍禁忌或停药期规定或使用违禁抗生素等现象造成的。
[0017] 步骤（1)中，所述的待测样品中，阿莫西林的含量较佳地为4~1000yg/Kg，更佳地 为10~5(K)yg/Kg，最佳地为10~50yg/Kg。所述的待测样品中，青霉素 G的含量较佳地为4~ 1000yg/Kg，更佳地为10~500yg/Kg，最佳地为10~50yg/Kg。所述的待测样品中，青霉素 V的 含量较佳地为5~1000yg/Kg，更佳地为10~500yg/Kg，最佳地为10~50yg/Kg。
[0018] 步骤（1)中，所述乙腊的添加量为本领域常规的添加量，较佳地为3~40mL/l~4g 待测样品，更佳地为4~lOmL/lg待测样品。
[0019] 步骤(1)中，较佳地，在所述离屯、的操作之前，先将所述混合物进行縱满震荡。所述 旋满震荡的方法和条件为本领域常规的方法和条件，所述的旋满震荡的时间较佳地为1~ lOmin，更佳地为5min。所述縱满震荡的溫度本领域常规，一般为室溫。所述旋满震荡是为了 利于提取，使乙腊进一步提取所述待测成分。
[0020] 步骤(1)中，较佳地，所述混合物中还包含酸。所述酸为本领域常规的酸，较佳地为 甲酸和/或乙酸。所述酸的添加量为本领域常规，较佳地为ο. 1~2%，更佳地为ο. 8~1.2 %， 最佳地为1%;上述百分比为所述酸占所述乙腊的体积百分比。添加所述酸后，所述待测样 品中所述阿莫西林、所述青霉素 G或所述青霉素 V的提取率至少能提高10% W上。
[0021] 步骤（1)中，根据本领域常识，可使用乙腊和酸进行多次离屯、操作，较佳地使用乙 腊和酸进行两次离屯、操作。所述酸的种类和用量如前所述。根据本领域常识，将多次离屯、后 所得上清液进行合并。
[0022] 步骤(1)中，所述的离屯、的方法和条件为本领域常规的方法和条件。所述的离屯、的 转速较佳地为5000~1500化pm。所述的离屯、的时间较佳地为5~30min。
[0023] 步骤(1)中，较佳地，将所述上清液先进行定容后再进行步骤(2)的操作。所述定容 的操作过程中，较佳地使用水或乙腊进行定容，更佳地使用乙腊进行定容。所述定容的终点 较佳地为10~25mL/g所述待测样品，更佳地为lOmL/g所述待测样品。所述定容的目的是为 了使后续进行测试时，用量基本相同。
[0024] 步骤(2)中，所述Oasis P化ME化B固相萃取小柱较佳地为沃特世科技(上海)有限 公司市售产品。
[0025] 步骤(2)中，所述活化的操作和条件为本领域常规的操作和条件。活化采用的溶剂 种类较佳地为乙腊水溶液或甲醇水溶液。所述乙腊水溶液中，乙腊占水的体积百分比较佳 地为10~80%，更佳地为60%。所述甲醇水溶液中，甲醇占水的体积百分比较佳地为10~ 80 %，更佳地为60 %。所述乙腊水溶液或所述甲醇水溶液的用量为本领域常规，较佳地为3 ~8mL，更佳地为4mL。
[0026] 步骤(2)中，所述上清液在所述固相萃取小柱中的流速为本领域常规的流速，较佳 地为0.025 ~0.30mL/s，更佳地为 0.05mL/s。
[0027] 本发明还提供一种待测成分的检测方法，所述待测成分为阿莫西林、青霉素 G和青 霉素 V中的一种或多种，其包括W下步骤：
[0028] (1)将所述预处理后的待测样品去除溶剂，再用溶剂A溶解，过滤，得进料样品；所 述溶剂A为甲醇水溶液、乙腊水溶液或水；
[0029] (2)将步骤（1)中所述进料样品再进行高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱化C- MS/MS)检测所述待测成分，即可。
[0030] 步骤(1)中，所述去除溶剂的方法和条件为本领域常规，较佳地用20~50°C氮气吹 干，更佳地为用25°C氮气吹干。
[0031] 步骤(1)中，所述乙腊水溶液中，乙腊占水的体积百分比较佳地为1~20%，更佳地 为6%。所述甲醇水溶液中，甲醇占水的体积百分比较佳地为1~20%，更佳地为6%。
[0032] 步骤（1)中，所述溶剂A的用量较佳地为1~2mL/g所述待测样品，更佳地为ImL/g所 述待测样品。
[0033] 步骤(1)中，所述的过滤的方法为采用有机微孔滤膜进行过滤，较佳地采用孔径为 0.22WI1或0.45WI1的有机微孔滤膜进行过滤。根据本领域常识，所述的过滤为微滤。
[0034] 步骤(2)中，所述的高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱化C-MS/MS)检测的条件和 方法为本领域常规的条件和方法。
[0035] 步骤(2)所述的高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱检测中，高效液相色谱法检测 的色谱柱较佳地为十八硅烷键合硅胶色谱柱(Water Xselect Ci8 column)。所述的十八娃 烧键合硅胶色谱柱的规格较佳地为4