表9所述。
[0171] 表9
[0172]
[0173]
[0174] 效果实施例1
[0175] 检出限的测定
[0176] 将实施例1中浓度为4yg/Kg混合标准工作溶液摇匀，进样10化，按实施例1中LC- MS/MS条件进行分析。信噪比S/N=3时，测得阿莫西林、青霉素 G和青霉素 V的检出限，W及信 噪比S/N=10时，测得阿莫西林、青霉素 G和青霉素 V的定量限如表10所示。
[0177] 表10
[017 引
[0179] 本发明阿莫西林、青霉素 G和青霉素 V的检测方法，其定量限和国家兽药最低残余 量(农业部第235公告)相比，可W满足国家兽药最高限量定量的要求。
[0180] 效果实施例2
[0181] 精密度的测定
[0182] 取6份实施例1中制备的30yg/Kg的混合标准工作溶液，作为样品液，每次进样10μ L，重复进样8次，按实施例1中LC-MS/MS的条件进行分析。具体测量结果如表11所示。测定阿 莫西林峰面积A，RSD为6.85 % (6份样品），表明精密度良好。
[0183] RSD为相对标准偏差(relative standard deviation),指标准偏差与计算结果算 术平均值的比值。
[0184] 表11
[0185]
[0186]
[0187]效果实施例3
[018引稳定性的测定
[0189] 将实施例1中制备的浓度为l(K)yg/Kg的混合标准工作溶液，连续进样8次，测定阿 莫西林的峰面积，外标法定量，计算其浓度，其结果如表12所示，RSD值为3.99%，表明检测 方法稳定性良好。
[0190] RSD为相对标准偏差(relative standard deviation),指标准偏差与计算结果算 术平均值的比值。
[0191] 表12
[0192]
[0193]
[0194] 效果实施例4
[01%]本效果实施例用于证明本发明预处理方法的准确性(测定其回收率），其结果如表 13所述。
[0196] 取Ξ组同样的普通原料牛乳，编号为1、2、3。其中，编号1为空白样品，不做任何处 理;编号2中的牛奶分别加入40yg/Kg的阿莫西林标准溶液lmL、4化g/Kg的青霉素 G标准溶液 ImL和40yg/Kg的青霉素 V标准溶液ΙιΛ;编号3中的牛奶分别加入20化g/Kg的阿莫西林标准 溶液lmL、2(K)yg/Kg的青霉素 G标准溶液ImL和2(K)yg/Kg的青霉素 V标准溶液ImL。将上述3组 分别进行如实施例2中的预处理，按照实施例1中LC-MS/MS条件进行分析，上述3组分别重复 进样5次，取平均值。计算其回收率，得到结果如表13所示。
[0197] 表13加标回收率实验结果
[019 引
[0199] 注明:N表示未检出。
【主权项】
1. 一种预处理方法，其特征在于，其包括以下步骤： (1) 将待测样品和乙腈的混合物，离心，收集上清液;所述的待测样品为不含固体颗粒 的乳制品； (2) 将所述上清液上样至已经活化的Oasis PRiME HLB固相萃取小柱，收集流出液，即 得预处理后的待测样品。2. 如权利要求1所述的预处理方法，其特征在于，所述的待测样品为原料乳和/或液态 乳制品； 所述的液态乳制品较佳地为高钙牛奶、高铁牛奶、低乳糖牛奶和低脂牛奶中的一种或 多种； 所述的原料乳较佳地为牛乳。3. 如权利要求1所述的预处理方法，其特征在于，步骤（1)中，所述的待测样品中，阿莫 西林的含量为4~1000yg/Kg，较佳地为10~500yg/Kg，更佳地为10~50yg/Kg;所述的待测 样品中，青霉素 G的含量为4~1000yg/Kg，较佳地为10~500yg/Kg，更佳地为10~50yg/Kg; 所述的待测样品中，青霉素 V的含量为5~1000yg/Kg，较佳地为10~500yg/Kg，更佳地为10 ~50yg/Kg; 步骤（1)中，所述乙腈的添加量为3~40mL/l~4g待测样品，较佳地为4~10mL/lg待测 样品； 步骤（1)中，在所述离心的操作之前，先将所述混合物进行漩涡震荡；所述的旋涡震荡 的时间较佳地为1~1 Omin; 步骤（1)中，所述混合物中还包含酸;所述酸较佳地为甲酸和/或乙酸;所述酸的添加量 为0.1~2%，较佳地为0.8~1.2%;上述百分比为所述酸占所述乙腈的体积百分比；较佳地 使用所述乙腈和酸进行两次离心操作； 步骤（1)中，所述的离心的转速为5000~15000rpm;所述的离心的时间为5~30min。4. 如权利要求1所述的预处理方法，其特征在于，步骤(1)中，将所述上清液先进行定容 后再进行步骤(2)的操作;所述定容的操作过程中，较佳地使用水或乙腈进行定容;所述定 容的终点较佳地为1 〇~2 5mL/g所述待测样品； 步骤(2)中，活化采用的溶剂种类为乙腈水溶液或甲醇水溶液;所述乙腈水溶液中，乙 腈占水的体积百分比较佳地为10~80%;所述甲醇水溶液中，甲醇占水的体积百分比较佳 地为10~80% ;所述乙腈水溶液或所述甲醇水溶液的用量较佳地为3~8mL; 步骤(2)中，所述上清液在所述固相萃取小柱中的流速为0.025~0.30mL/s。5. -种待测成分的检测方法，所述待测成分为阿莫西林、青霉素 G和青霉素 V中的一种 或多种，其特征在在于，其包括以下步骤： (1) 将如权利要求1~4任一项所述预处理后的待测样品去除溶剂，再用溶剂A溶解，过 滤，得进料样品;所述溶剂A为甲醇水溶液、乙腈水溶液或水； (2) 将步骤(1)中所述进料样品再进行高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱检测所述待 测成分，即可。6. 如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述去除溶剂的方法用20~ 50 °C氮气吹干； 步骤（1)中，所述乙腈水溶液中，乙腈占水的体积百分比为1~20%;所述甲醇水溶液 中，甲醇占水的体积百分比为1~20%; 步骤(1)中，所述溶剂A的用量为1~2mL/g所述待测样品； 步骤(1)中，所述的过滤采用孔径为〇. 22μπι或0.45μπι的有机微孔滤膜进行过滤。7. 如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)所述的高效液相色谱-电喷雾串 联二级质谱检测中，高效液相色谱法检测的色谱柱为十八硅烷键合硅胶色谱柱;所述的十 八硅烷键合硅胶色谱柱的规格较佳地为4.6_ X 250mm或4.6_ X 150mm。8. 如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)所述的高效液相色谱-电喷雾串 联二级质谱检测中，高效液相色谱法使用梯度洗脱的方法，流动相A为乙腈和甲酸的混合 液，流动相B为水和甲酸的混合液;所述流动相A中，所述甲酸的用量较佳地为流动相A总体 积的0.05~0.1 % ;述流动相B中，所述甲酸的用量较佳地为流动相B总体积的0.05~0.1 % ; 其中，较佳地，所述流动相A和所述流动相B的梯度洗脱条件如表2所示： 表2其中，百分比为各组分分别占流动相A和流动相B总体积的体积百分比。9. 如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)所述的高效液相色谱-电喷雾串 联二级质谱检测中，高效液相色谱法检测的柱温为25~35°C ; 步骤(2)所述的高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱检测中，所述的高效液相色谱法检 测的所述待测样品的流速为〇. 6~1.5mL/m i η; 步骤(2)所述的高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱检测中，所述阿莫西林的高效液相 色谱法检测的检测波长为228nm;所述青霉素 G的高效液相色谱法检测的检测波长为225nm; 所述青霉素 V的高效液相色谱法检测的检测波长为268nm; 步骤(2)所述的高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱检测中，高效液相色谱法检测的进 样体积为15~2 5yL。10. 如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)所述的高效液相色谱-电喷雾 串联二级质谱检测中，质谱检测的条件为： 定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压如表3所示： 表3离子源：电喷雾离子源； 扫描模式:正尚子模式； 毛细管电压:3500伏； 离子源温度120 °C; 去溶剂温度:550 °C; 检测方式:多反应监测。
【专利摘要】本发明公开了一种预处理方法及阿莫西林、青霉素G和青霉素V的检测方法。预处理方法包括以下步骤：①将待测样品和乙腈的混合物，离心，收集上清液；待测样品为不含固体颗粒的乳制品；②将上清液上样至已经活化的Oasis？PRiME？HLB固相萃取小柱，收集流出液即得。本发明的预处理方法快速、简单、经济、可靠，能够有效地提取出待测组分，去除复杂基质影响，有益于待测样品的快速检测。在保持较高提取率的同时，节约了有机溶剂的使用、排放和损失，有利于保护环境，节约了预处理步骤、时间和能耗，检测方法快速，简单，精密度高，准确性高，具有较强的应用价值。
【IPC分类】G01N30/02, G01N30/06
【公开号】CN105628808
【申请号】CN201510995920
【发明人】王渊龙, 游春苹, 刘振民
【申请人】光明乳业股份有限公司
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2015年12月25日