一种检测人类白细胞抗原hla-g的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学检测领域，具体涉及一种检测血清可溶性人类白细胞抗原G的方 法。
【背景技术】
[0002] 先兆子痫(preeclampsia，PE)是指在妊娠24周左右，在高血压、蛋白尿基础上，出 现头痛、眼花、恶心、呕吐、上腹不适等症状，又称妊娠高血压综合征。是妊娠期特有疾病，产 科四大重症之一。其发病率约为5-10%。严重危及母婴安全。对先兆子痫的早期筛查有助减 少对母婴危害。
[0003] 先兆子痫发病机理至今仍不是完全清楚。但是，现今医学界公认胎盘不正常植入 和不正常发育是先兆子痫的主要病因。因为分娩后，胎盘排除，先兆子痫的症状即可消失。
[0004] 胎盘不正常植入和不正常发育则与母亲的免疫功能相关。因为胎儿基因的一半来 自母亲，一半来自父亲。对母体免疫系统来讲，胎儿是一个同种、半异体。但在成功的妊娠， 母亲免疫系统并没有将其排斥清除。这种现象称之为母体对胎儿的免疫耐受。如果这种免 疫耐受机制失调，即可引起母亲的免疫排斥反应增强而导致胎盘着床浅，胎盘的滋养叶细 胞功能受损，胎盘缺血和胎盘代谢障碍。同时，胎盘源性血浆细胞毒性因子增加，从而使血 管内皮细胞损伤，全身小动脉痉挛，最终导致妊娠高血压综合征（Goldman-Wohl D，et al.Mol.Hum.Reprod.2000；6:88-95)〇
[0005] 人类白细胞G(HLA-G)是一种非经典的人类白细胞I类抗原(Geraghty DE et al·， Proc .Natl. Acad · Sci .U S A. 1987; 84:9145-149) jLA-G 的基因同经典 I 类白细胞抗原的基 因(HLA-A，-B和-C)均位于第6对染色体的短臂上;基因和表达的产物与经典I类白细胞抗原 有86 %雷同。但是，HLA-G与经典I类白细胞抗原相比，在正常生理情况下，HLA-G仅在胎盘的 绒毛膜滋养细胞有较高的表达(Kovats et al^Science 1990;248:220)。而HLA-A，-B和-C 在所有的有核细胞均有表达，但在胎盘的绒毛膜细胞经典I类白细胞抗原表达则是缺失的。 组织和细胞缺乏或降低经典I类白细胞抗原的表达，可以降低抗原提呈功能和免受细胞毒 性T淋巴细胞(CTL)攻击，但极容易受到自然杀伤细胞(NK)的攻击。HLA-G则具有抑制自然杀 伤细胞，细胞毒性T淋巴细胞和抗原提呈细胞(APC)的功能（LeMaoult J et al.，TiSSue Antigens. 2003;62:273)。因此，胎盘绒毛膜细胞经典I类白细胞抗原的表达的缺失和HLA-G 的高表达构成了母体对胎儿免疫耐受关键的环节。
[0006] 已有大量的研究证明先兆子痫患者的胎盘HLA-G mRNA和蛋白、以及血清中可溶性 HLA-G蛋白表达明显降低（Yie SM et al^Am.J.Obster.Gynecol.igUSS-SSgjOCMhO' Brin等人研究结果显示：先兆子痫患者HLA-G在胎盘绒毛外细胞滋养细胞簇上呈孤岛样缺 失(O'B rien M et al.，Hum. Ιπιπηιηο1·61:1126-1131，2000)。由于滋养细胞表达的HLA-G分 子在细胞侵入母胎蜕膜中起到保护作用，HLA-G表达的缺陷，使绒毛滋养细胞易受母体免疫 系统的攻击，让其侵蚀能力低下，侵入底蜕膜中的滋养细胞数量明显不足，侵蚀仅达子宫螺 旋动脉蜕膜段，不能有效地完成血管重建（Hunt JS，et al.，Hum.ReprocL9:729-735， 2003)。与正常妊娠相比，先兆子痫患者的胎盘种植较浅，血管内皮细胞受损和功能发生异 常。
[0007] 那么，检测血清HLA-G在预测先兆子痫的发生有无临床应用价值呢?Hackmon等人 比较先兆子痫患者与正常妊娠晚期孕妇的血清sHLA-G，发现前者血清sHLA-G的水平显著低 于后者（Hackmon R,et al .Am. J.Obster .Gynecol · 197: 255: el_e5，2007)。Rizzo等人检测 了 580例白人妊娠妇女，也发现在妊娠中期和晚期先兆子痫的病人血清sHLA-G显著低于正 常妊娠妇女（Rizzo R et al^Am.J.Reprod.ImmunoUSJSCUSSJOOghYie等人研究发 现妊娠高血压疾病的患者在早孕及中孕期其母血中的HLA-G表达即下降，与正常对照组差 异显著，可以通过在早孕期检测其母血中的HLA-G水平，预测其妊娠高血压疾病的发生(Yie SM et al.，厶111.]\(^8七61:.67116(3〇1.193:204-208,2005)。他们的研究进一步得到了 Ste inborn等人研究的证实。Ste inborn等人检测40位正常妇女，291位正常妊娠妇女和236 位先兆子痫的患者，发现血清sHLA-G水平在正常早孕时增高，然后随孕期而下降。但在先兆 子痫的患者在早孕及中孕期其母血中的HLA-G明显低于正常妊娠妇女。统计分析显示早孕 期检测其母血中的HLA-G水平能够预测其妊娠高血压疾病的发生（Steinborn et a.， Am· J · Reprod · Immunol · 57:277-86，2007)。国内也有研究发现先兆组与正常妊娠组血清中 的sHLA-G的水平差异有统计学意义(侯彩英等:现代生物医学进展.8:1905-1906，2008)。
[0008] 但是，上述的研究也均显示，血清中HLA-G的浓度个体差异较大。这些研究且仅仅 测定第一孕期（1-3个月），第二孕期(4-6各月）和第三孕期(6-9个月）。实验设计比较粗糙， 比较难以确定其临床判断值。
[0009] 此外，大量的研究证明：母亲血液中的促血管生长因子如胎盘生长因 （placental growth factor，PlGF),可溶性血管内皮细胞生长因子受体（soluble vascular endothelial growth factor receptor，sVEGFR)和可溶性血管内皮生长因子受体l，sFlt_ 1)，可溶性内皮糖蛋白（soluble endoglin)，抗血管紧张 II受体(angiotensin II type I receptor)在先兆子痫发生前一至两个星期出现变化。均有可能作为先兆子痫早期筛查的 指标（Baumann MU，et al.，Mol.Aspects Med 2007;28:227_244;Savaj S and Vaziri N. Iran J Kidney Dis.2012;6:334-338)。不过这些指标与先兆子痫病理过程中由于胎盘 不正常植入引起的后期血管变化相关，在第一孕期正常妊娠和先兆子痫患者并无区别；而 只能在第二孕期(24周）之后，在接近先兆子痫发病的时间，才能看到正常妊娠和病人之间 的区别;不能较早地预测疾病的发生。
[0010]申请号为200710075443.7的中国专利公开了一种含抗HLA-G的单克隆抗体的癌症 诊断试剂盒及其应用，其采用的两个抗HLA-G重链区域不同抗原表位的单抗(HGY和HGY-2)， 用夹心式酶联免疫方法，根据纯化的HLA-G蛋白标准，定量地确定血清或其他体液中HLA-G 的含量。但其灵敏度和准确性都不够理想。
【发明内容】
[0011 ]本发明目的是提供一种检测人类白细胞抗原HLA-G的方法，提高检测HLA-G的灵敏 度和准确性。
[0012] 本发明的技术方案为：
[0013] 一种检测人类白细胞抗原HLA-G的方法，采用HLA-G的重链的第85-185位氨基酸序 列的蛋白片段作为抗原制备单克隆抗体3C4,采用HLA-G的轻链的第1-50为氨基酸序列的蛋 白片段偶联KLH后作为抗原制备单克隆抗体3H1，然后将3C4和3H1作为酶联免疫检测试剂来 检测HLA-G，所述HLA-G的重链的第85-185位氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，HLA-G的轻链 的第1-50为氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0014]进一步地，制备抗体3C4的方法如下：
[0015] (1)采用重组蛋白的方法获得HLA-G的重链的第85-185位氨基酸序列的蛋白片段；
[0016] (2)将步骤（1)获得的蛋白片段作为抗原免疫小鼠，然后经细胞融合、筛选杂交瘤 细胞得到抗体3C4。
[0017] 进一步地，制备抗体3H1的方法如下：
[0018] (1)合成HLA-G的轻链的第1-50为氨基酸序列的蛋白片段并偶联KLH;
[0019] (2)将步骤(a)偶联KLH后的蛋白片段作为抗原免疫小鼠，然后经细胞融合、筛选杂 交瘤细胞得到抗体3H1。
[0020] 进一步地，将3C4和3H1作为酶联免疫检测试剂来检测HLA-G的方法如下：
[0021] (1)将抗体3C4包被在酶标板上，
[0022] (2)加入含有HLA-G的待测血浆或血清或细胞培养液，并设置阳性和阴性对照，振 荡后洗涤，
[0023] (3)加入生物素标记的抗体3H1，振荡后洗涤，
[0024] (4)加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶复合物，振荡后洗涤，
[0025] (5)加入显色液显色，
[0026] (6)加入终止液终止显色反应，
[0027] (7)检测光密度并与标准曲线对比。
[0028]本发明与现有技术相比具有如下优点：
[0029]本发明采用HLA-G的重链的特定蛋白片段作为抗原制备抗体3C4,采用HLA-G的轻 链的特定蛋白片段偶联KLH后作为抗原制备抗体3H1，然后将3C4和3H1作为酶联免疫检测试 剂来检测HLA-G，具有检测灵敏度高、特异性好，具有很好的可重复性和准确性，灵敏度达到 3ng/ml，准确性达到95.8 %，从而为检测HLA-G提供了一种新的方法。
【附图说明】
[0030] 图1、原核表达