一种葡萄酒中双乙酰含量的测定方法
【专利摘要】本发明属于酒品检测技术领域，具体涉及一种葡萄酒中双乙酰含量的测定方法。本发明的方法，包括以下步骤：取葡萄酒样加热蒸馏，在容器中预先加入蒸馏水和1%的邻苯二胺溶液，用上述的容器收集蒸出液；混匀蒸出液和邻苯二胺及蒸馏水，得混合液，加入盐酸，充分混合后，测定其在335nm下的吸光值，在空白测定中，用蒸馏水代替蒸出液，根据测定得到的吸光值，查标准曲线得到相应的双乙酰含量。本发明以啤酒体系改进的邻苯二胺比色法作参照，建立适合于葡萄酒体系的双乙酰检测方法。应用此方法，分析葡萄酒发酵和陈酿过程中双乙酰含量的变化规律，为葡萄酒生产中双乙酰的有效控制提供参考，有效节约了企业的生产成本。
【专利说明】
-种葡萄酒中双乙醜含量的测定方法
技术领域
[0001] 本发明属于酒品检测技术领域，具体设及一种葡萄酒中双乙酷含量的测定方法。
【背景技术】
[0002] 双乙酷(2,3-扣*日11日山〇11日，(：边6〇2)是葡萄酒、啤酒等发酵酒的重要风味物质之一， 是乳酸菌苹果酸-乳酸发酵和酵母酒精发酵时产生的副产物。本发明设及一种葡萄酒中双 乙酷含量的测定方法，本发明W啤酒体系改进的邻苯二胺比色法作参照，拟建立适合于葡 萄酒体系的双乙酷检测方法，应用此方法，分析葡萄酒发酵和陈酿过程中双乙酷含量的变 化规律，为葡萄酒生产中双乙酷的有效控制提供参考。
[0003] 迄今为止，仅检索到一项专利"一种测定白酒中双乙酷含量的方法"，该专利运用 静态顶空进样技术和气相色谱-质谱化C-MS)联用技术，建立了快速测定白酒中双乙酷含量 的方法。此测定方法准确度和灵敏度较高，但对试验条件和仪器要求过高。
[0004] 因此，需要针对上述方法的缺陷进行改进，设计一种准确度和灵敏度较高且对实 验条件和仪器要求相对较低的方法。
【发明内容】
[0005] 为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种适用于葡萄酒体系双乙酷含量检测 的邻苯二胺比色法。本发明通过试验确定最佳的蒸馈时间；通过回收率试验确定双乙酷最 佳的测定浓度;通过精确度检验确定该方法有较高的重现性，精确度较高;通过试验确定酒 精度对双乙酷含量测定的影响。
[0006] 本发明的葡萄酒中双乙酷含量的测定方法，包括W下步骤： (1) 取葡萄酒样加热蒸馈，在容器中预先加入蒸馈水和1%的邻苯二胺溶液，用上述的容 器收集蒸出液，蒸馈时间不超过4分钟； (2) 混匀蒸出液和邻苯二胺及蒸馈水，得混合液，加入4mol化的盐酸，充分混合后，测定 其在335nm下的吸光值，在空白测定中，用蒸馈水代替蒸出液，根据测定得到的吸光值，查标 准曲线得到相应的双乙酷含量。
[0007] 优选的，本发明的葡萄酒中双乙酷含量的测定方法，包括W下步骤： (1) 量取葡萄酒样倒入蒸馈瓶中，电炉加热，用量筒收集蒸出液，所述的葡萄酒样品与 蒸出液的体积比为3-6:1，并在量筒中预先加入1 %邻苯二胺溶液和蒸馈水，蒸馈时间控制 在4min之内，所述的邻苯二胺溶液占葡萄酒样品体积的0.2-0.7%，蒸馈水体积占葡萄酒样 品的 3.5-5.5〇/〇; (2) 混匀蒸出液和邻苯二胺及蒸馈水，得混合液，加入4mol化的盐酸，所述的盐酸的加 入体积为混合液体积的1/18-1/12，充分混合，用比色皿测定其在335皿下的吸光值(OD值）； 在空白测定中，用蒸馈水代替蒸出物，根据测定所得的OD值，查标准曲线得到相应的双乙酷 含量。
[000引更优选的，一种葡萄酒中双乙酷含量的测定方法，包括W下步骤： (1) 量取葡萄酒样倒入蒸馈瓶中，电炉加热，用量筒收集蒸出液，所述的葡萄酒样品与 蒸出液的体积比为4:1，并在量筒中预先加入1 %邻苯二胺溶液和蒸馈水，蒸馈时间控制在 4min之内，所述的邻苯二胺溶液占葡萄酒样品体积的0.5%，蒸馈水体积占葡萄酒样品的 4.5%； (2) 混匀蒸出液和邻苯二胺及蒸馈水，得混合液，加入4mol化的盐酸，所述的盐酸的加 入体积为混合液体积的1/15，充分混合，用比色皿测定其在335nm下的吸光值(OD值）；在空 白测定中，用蒸馈水代替蒸出物，根据测定所得的OD值，查标准曲线得到相应的双乙酷含 量。
[0009] 优选的，葡萄酒中双乙酷含量的测定方法，包括W下步骤： (1) 量取IOOmL葡萄酒样倒入蒸馈瓶中，电炉加热，用50mL量筒收集25mL蒸出液，并在量 筒中预先加入〇.5mLl%邻苯二胺溶液和4.5mL蒸馈水，蒸馈时间控制在4min之内； (2) 混匀蒸出液和邻苯二胺及蒸馈水，得混合液，用吸管吸取IOmL混合液，放入干净试 管中，加入2血4mol化的盐酸，充分混合，用IOmm比色皿测定其在335nm下的吸光值;在空白 测定中，用25mL蒸馈水代替蒸出物，其它步骤不变。根据测定所得的OD值，查标准曲线得到 相应的双乙酷含量。
[0010] 上述的邻苯二胺溶液采用4mol/L盐酸所配制，具体的配制方法为： (1) 配制4mol/L盐酸:量取331.6毫升37%体积浓度的浓盐酸，加入到烧杯中，稀释，将稀 释后的溶液转移到1000毫升的容量瓶中，再用水洗烧杯1-2次，将洗液也转移到容量瓶中， 再加水至刻度，摇匀； (2) 配制1%邻苯二胺溶液:称取IOg邻苯二胺，加入到烧杯中，加4mol/L盐酸稀释，将稀 释后的溶液转移到1000毫升的容量瓶中，再用4mol/L盐酸洗烧杯1-2次，将洗液也转移到容 量瓶中，再加4mol/L盐酸至刻度，摇匀，得邻苯二胺溶液。此溶液当天配制当天使用，若配制 出来的溶液呈红色，应重新更换新试剂。
[0011] 邻苯二胺比色法的原理是双乙酷与邻苯二胺反应生成2,3-二甲基哇喔嘟，其盐酸 盐在335nm波长下有最大吸收峰，其吸光值大小与双乙酷含量成正比。但该法也存在一些不 足，如易受加热等外界干扰因素的影响，其准确度和灵敏度尚感不足;其二是只能测定双乙 酷和2,3-戊二酬的总量，而不能分别进行测定，因此测定结果往往偏高。虽然其他方法(如 气相色谱法)能或多或少的增加准确性和灵敏性，但对试验条件和仪器要求过高。本发明通 过改进的邻苯二胺比色法在保持基本原理的基础上，对试验条件和方法进行了优化，在不 提高成本的前提下，使试验更加准确和简捷。
[0012] 本发明W啤酒体系改进的邻苯二胺比色法作参照啤酒体系邻苯二胺比色法未考 虑蒸馈时间、回收率、精确度检验、酒精度对双乙酷含量测定的影响。本发明通过试验确定 最佳的蒸馈时间；通过回收率试验确定双乙酷最佳的测定浓度;通过精确度检验确定该方 法有较高的重现性，精确度较高;通过试验确定酒精度对双乙酷含量测定的影响，建立适合 于葡萄酒体系的双乙酷检测方法。
[0013] 本发明W啤酒体系改进的邻苯二胺比色法作参照，建立适合于葡萄酒体系的双乙 酷检测方法。应用此方法，分析葡萄酒发酵和陈酿过程中双乙酷含量的变化规律，为葡萄酒 生产中双乙酷的有效控制提供参考，有效节约了企业的生产成本。
【附图说明】
[0014] 图1双乙酷反应物吸收峰的检测； 图2双乙酷标准曲线。
【具体实施方式】
[0015] 实施例1 1、吸收峰检测 将葡萄酒样蒸馈，用紫外可见分光光度计测定馈出液与邻苯二胺盐酸反应产物(2,3- 二甲基哇喔嘟)在280-500nm波长处的OD值。
[0016] 对双乙酷与邻苯二胺盐酸反应产物进行波长扫描，从图1可W看到，反应产物只在 335nm处有最大吸光峰，因此可选择335nm作为邻苯二胺比色法测定双乙酷反应物的波长。
[0017] 2、标准曲线的制作 用蒸馈水配制浓度为Omg/L、1.2mg/L、2.4mg/L、4.8mg/L、9.6mg/L和 19.2mg/L的双乙酷 标准溶液各25mL，分别加入0.5mL邻苯二胺盐酸溶液和4.5mL蒸馈水，混合均匀，从中取IOmL 混合液并加入2mL 4mol/L盐酸溶液，于暗处分别放置20min后在335nm处测定其OD值。W双 乙酷浓度为横坐标，OD值为纵坐标，制作双乙酷标准曲线，3个独立重复。
[0018] 在此波长下，用双乙酷标准液制备标准曲线。如图2所示，在双乙酷浓度为0-19.2 mg/L范围内，双乙酷浓度与OD值呈极显著的直线相关，相关方程为：y=0.0850431228x+ 0.0156458333(r=0.9999)(其中X:双乙酷浓度;y: 335m 处溶液 OD 值） 即双乙酷含量与其反应物在335nm处的OD值大小有极显著的线性正相关关系。
[0019] 3、蒸馈时间的影响 分别取IOOmL酒样、1.2mg/L和19.2mg/L双乙酷标准液于蒸馈瓶中，用电炉加热蒸馈，分 步收集0-25血、第25-50mL和第50-75mL蒸出液，整个收集控制在10-12min内完成，分别测定 不同蒸馈时间的蒸出液与邻苯二胺盐酸溶液反应液在335nm下的OD值，3个独立重复。
[0020] 由于蒸馈过程中会有大量溶解氧进入到葡萄酒体系中，容易导致双乙酷前体物a- 乙酷乳酸通过非酶促氧化脱簇反应直接转化为双乙酷，最终影响测定结果的准确性，因此 有必要分析蒸馈时间对双乙酷测定的影响。从表1可W看出，由于双乙酷标准液（1.2mg/L和 19.2mg/L)中不含有双乙酷前体物，故双乙酷几乎在第1个25 mL就被完全蒸出了，加热时间 约4min。而对于葡萄酒样，第3个25血（即第50-75mL)组分中双乙酷含量明显高于第2个25mL 组分，运可能是由于a-乙酷乳酸的直接氧化脱簇造成的。因此，在试验中只收集第1个25mL 馈出液，可W减少双乙酷前体物转化带来的误差。
[0021] 表1不同蒸馈时间的馈出液中双乙酷反应物的〇D335nm值
[0022] 4、加标回收试验 分别取蒸馈水(对照)和浓度为1.2mg/L、9.6mg/L和19.2mg/L的双乙酷标准溶液各2mL， 加到盛有98mL葡萄酒酒样的蒸馈瓶中，其它步骤不变，分别测定对照和加标后的蒸出物双 乙酷含量，计算回收率，3个独立重复。
[0023] 向98mL酒样(含6.53 mg/L双乙酷）中分别加入1.2mg/L、9.6mg/L和1 9.2mg/L的标 准双乙酷溶液2mL，分别蒸馈，取第1个25mL蒸馈液进行检测。表2显示，向葡萄酒体系中加入 1.2mg/L或9.6mg/L双乙酷标准溶液时，蒸出液中双乙酷的回收率较高且较稳定，能满足试 验精度要求;但当加入19.2mg/L双乙酷标准液时，双乙酷的回收率变得不稳定，且同收率降 低。表明葡萄酒中双乙酷浓度超过一定值时，在此试验条件下双乙酷的蒸馈不完全。因此在 本方法中，对于双乙酷浓度在15mg/LW内的酒样可W直接蒸馈，浓度过高则需要对酒样进 行稀释处理。
[0024] 表2回收率试验
[0025] 5、精确度检验 分别取1.2mg/L、4.8mg/L和19.2mg/L双乙酷标准溶液和葡萄酒酒样，用邻苯二胺比色 法测定OD值，并利用标准曲线计算双乙酷含量，每处理3个重复，计算3组数据的标准差得到 精确度。
[00%]精确度是指对同一试验过程实施多次后所得到的数据之间的一致性程度，是一个 试验的重要指标。从表3可W看出，标准样的相对标准偏差在2%W内，而酒样的相对标准偏 差在5%W内，表明该方法有较高的重现性，精确度较高。
[0027]表3双乙酷标样与葡萄酒样的精确度
[002引6、酒精的影响 酒精是易挥发物质，所W馈出液中一定含有酒精。为检测酒精的影响，配制12%的酒精 溶液代替酒样进行蒸馈，并在335nm下测定馈出液与邻苯二胺盐酸反应物的OD值。
[0029] 通过试验测得12%的酒精溶液蒸出的蒸馈液在335nm处的吸光值近似为0,因此对 试验基本无影响，故测得的双乙酷含量不会受酒精的影响。
[0030] 应用紫外-可见分光光度计比色法测定葡萄酒中的双乙酷含量，在一定浓度范围 内，双乙酷浓度与其反应物在335nm处的吸光值呈极显著线性关系。该法精确度较高，不受 酒精干扰。为了排除酒中色素对测定的干扰，可先将酒样中的双乙酷蒸出，回收率达到90% W上。在该法中，蒸馈时间比较重要，应控制在4min之内，保证馈出液的量为25mL即可，如果 加热时间过长，双乙酷含量会增加，可能与双乙酷前体物。a-乙酷乳酸非酶促氧化生成双乙 酷有关，导致测定结果比实际偏高。
[0031] 在葡萄酒发酵过程中，随着酵母作用的加剧，双乙酷快速而大量积累，少量的双乙 酷可W增加葡萄酒香气的复杂性，对感官品质有着积极作用，但高浓度双乙酷则可能掩盖 葡萄酒的典型风味，给酒带来令人不快的"馈饭味"。应用本发明监测葡萄酒酒精和苹果酸- 乳酸发酵及陈酿过程中双乙酷含量的变化，对葡萄酒生产中双乙酷的监测和调控有着十分 重要的意义。本发明既增加了准确性和灵敏性，对试验条件要求不高，节约了生产成本，又 能够及时监测到葡萄酒发酵过程中双乙酷含量的变化，采取有效的措施控制双乙酷的含 量，本发明对葡萄酒的生产具有重大的指导意义。
【主权项】
1. 一种葡萄酒中双乙酰含量的测定方法，包括以下步骤： (1) 取葡萄酒样加热蒸馏，在容器中预先加入蒸馏水和1%的邻苯二胺溶液，用上述的容 器收集蒸出液，蒸馏时间不超过4分钟； (2) 混匀蒸出液和邻苯二胺及蒸馏水，得混合液，加入4mol/L的盐酸，充分混合后，测定 其在335nm下的吸光值，在空白测定中，用蒸馏水代替蒸出液，根据测定得到的吸光值，查标 准曲线得到相应的双乙酰含量。2. 如权利要求1所述的一种葡萄酒中双乙酰含量的测定方法，包括以下步骤： (1) 量取葡萄酒样倒入蒸馏瓶中，电炉加热，用量筒收集蒸出液，所述的葡萄酒样品与 蒸出液的体积比为3-6:1，并在量筒中预先加入1 %邻苯二胺溶液和蒸馏水，蒸馏时间控制 在4min之内，所述的邻苯二胺溶液占葡萄酒样品体积的0.2-0.7%，蒸馏水体积占葡萄酒样 品的3.5-5.5%; (2) 混匀蒸出液和邻苯二胺及蒸馏水，得混合液，加入4mol/L的盐酸，所述的盐酸的加 入体积为混合液体积的1/18-1/12，充分混合，用比色皿测定其在335nm下的吸光值(OD值）； 在空白测定中，用蒸馏水代替蒸出物，根据测定所得的OD值，查标准曲线得到相应的双乙酰 含量。3. 如权利要求1所述的一种葡萄酒中双乙酰含量的测定方法，包括以下步骤： (1) 量取葡萄酒样倒入蒸馏瓶中，电炉加热，用量筒收集蒸出液，所述的葡萄酒样品与 蒸出液的体积比为4:1，并在量筒中预先加入1 %邻苯二胺溶液和蒸馏水，蒸馏时间控制在 4min之内，所述的邻苯二胺溶液占葡萄酒样品体积的0.5%，蒸馏水体积占葡萄酒样品的 4.5%； (2) 混匀蒸出液和邻苯二胺及蒸馏水，得混合液，加入4mol/L的盐酸，所述的盐酸的加 入体积为混合液体积的1/15，充分混合，用比色皿测定其在335nm下的吸光值(0D值）；在空 白测定中，用蒸馏水代替蒸出物，根据测定所得的OD值，查标准曲线得到相应的双乙酰含 量。4. 如权利要求1所述的一种葡萄酒中双乙酰含量的测定方法，包括以下步骤： (1) 量取IOOmL葡萄酒样倒入蒸馏瓶中，电炉加热，用50mL量筒收集25mL蒸出液，并在量 筒中预先加入〇.5mLl%邻苯二胺溶液和4.5mL蒸馏水，蒸馏时间控制在4min之内； (2) 混匀蒸出液和邻苯二胺及蒸馏水，得混合液，用吸管吸取IOmL混合液，放入干净试 管中，加入2mL 4mol/L的盐酸，充分混合，用IOmm比色皿测定其在335nm下的吸光值;在空白 测定中，用25mL蒸馏水代替蒸出物，其它步骤不变； 根据测定所得的OD值，查标准曲线得到相应的双乙酰含量。5. 如权利要求1-4中任一项所述的一种葡萄酒中双乙酰含量的测定方法，其特征在于， 所述的邻苯二胺溶液采用4mol/L盐酸所配制，具体的配制方法为： (1) 配制4mol/L盐酸:量取331.6毫升37%体积浓度的浓盐酸，加入到烧杯中，稀释，将稀 释后的溶液转移到1 〇〇〇毫升的容量瓶中，再用水洗烧杯1 -2次，将洗液也转移到容量瓶中， 再加水至刻度，摇匀； (2) 配制1%邻苯二胺溶液:称取IOg邻苯二胺，加入到烧杯中，加4mol/L盐酸稀释，将稀 释后的溶液转移到1 〇〇〇毫升的容量瓶中，再用4moI/L盐酸洗烧杯1 -2次，将洗液也转移到容 量瓶中，再加4mol/L盐酸至刻度，摇匀，得邻苯二胺溶液。
【文档编号】G01N21/31GK105954219SQ201610540530
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年7月11日
【发明人】张顺涛, 李春丽, 贺丽娜, 马福荣, 李艳, 于 玲
【申请人】张顺涛