检测设备的制造方法
【专利说明】
[0001] 本申请基于并要求2012年4月3日提交的编号为61/619, 784的美国临时申请的 权益，所述文献在此引入作为参考。
技术领域
[0002] 本申请的实施例总体上涉及例如在核酸测序过程中用于样品的流体操作和光学 检测的设备和方法。
【背景技术】
[0003] 我们的基因组为预测我们的许多固有倾向性（如我们的偏好、才能、对疾病的易 感性和对治疗药物的反应性）提供了蓝图。人类个体的基因组包含超过30亿个核苷酸的 序列。只是那些核苷酸的一小部分的差异赋予许多我们独特的特性。研究团体在查明构成 蓝图的特征以及利用所述特征更完整地理解在每个蓝图中信息如何与人类健康相关方面 正取得令人印象深刻的进步。然而，我们的理解还远远不完整，并且这正在阻碍信息从研究 实验室到临床的转化，希望有一天我们每一个人将拥有我们自己的个人基因组的备份，使 得我们能够和我们的医生一同坐下来针对健康的生活方式或适当的治疗过程确定合适的 选择。
[0004] 目前的瓶颈是产量和规模的问题。查明任何给定个体的蓝图的基本组成部分是确 定其基因组中的30亿个核苷酸的精确序列。可以使用各种技术来做到这一点，但是那些技 术通常花费许多天以及成千上万美元来完成。此外，任何个体的基因组序列的临床相关性 是将其基因组序列的独特特征（即，他们的基因型）和与已知特性（即，表型）相关的参考 基因组进行比较的问题。当人们考虑到参考基因组是基于基因型和表型的相关性而创建 时，规模和产量的问题就变得明显，所述相关性由通常使用数以千计的个体以便在统计上 有效的研究学习得出。因此，针对成千上万的个体可以对几十亿的核苷酸进行最终测序， 以识别任何临床相关的基因型和表型的相关性。进一步被疾病、药物反应以及其他临床相 关特性的数目成倍扩展，对非常便宜和快速的测序技术的需要变得更加明显。
[0005] 需要减少测序成本来驱使科研人员进行大规模的基因相关性研究，并且使得在用 于做出改变个体患者的生活的决定的治疗的临床环境中可进行测序。 【实用新型内容】
[0006] 本文所述的本申请的实施例满足上述需要并且还提供其他的优点。
[0007] 本申请提供一种检测设备，其包括：（a)包括多个显微荧光计的支架（carriage)， 其中显微荧光计中的每一个具有被配置用于宽视场影像检测的物镜，其中多个显微荧光计 被定位成同时获取在公共平面内的多个宽视场影像，并且其中宽视场影像中的每一个来自 公共平面的不同区域；(b)平移平台，其被配置成在平行于公共平面的至少一个方向上移 动支架；以及（c)样品平台，其被配置成保持基板在公共平面内。
[0008] 所述显微荧光计中的每一个还可包括专用自动聚焦模块。
[0009] 所述自动聚焦模块可包括检测器和驱动器，其中所述驱动器可被配置成改变所述 显微荧光计相对于所述公共平面的焦点，并且其中所述检测器可被配置成引导所述驱动器 的运动。
[0010] 所述检测器还可被配置成获取所述宽视场影像。
[0011] 所述检测器还可被配置成向位于所述支架外部的处理单元输出影像数据。
[0012] 所述检测器可专用于所述自动聚焦模块并且其中所述显微荧光计可包括第二检 测器，该第二检测器可被配置成向位于所述支架外部的处理单元输出影像数据。
[0013] 用于所述设备的第一显微荧光计的所述自动聚焦模块可被配置成整合来自用于 所述设备的第二显微荧光计的自动聚焦模块的数据，由此所述自动聚焦模炔基于所述第 一显微荧光计的焦点位置和所述第二显微荧光计的焦点位置改变所述第一显微荧光计的 焦点。
[0014] 所述显微荧光计中的每一个还可包括分束器和检测器，其中所述分束器可被定位 成将来自激励辐射源的激励辐射引导至所述物镜以及将来自所述物镜的发射辐射引导至 所述检测器。
[0015] 所述显微荧光计中的每一个还可包括所述激励辐射源。
[0016] 所述激励辐射源可将所述激励辐射引导至所述多个显微荧光计中的单个显微荧 光计的物镜，由此每个显微荧光计可包括单独的激励辐射源。
[0017] 所述支架还可包括与所述激励辐射源热接触的散热器。
[0018] 所述散热器可与所述支架中的单一辐射源热接触。
[0019] 所述散热器可与所述支架中的多个辐射源热接触。
[0020] 所述激励辐射源可将所述激励辐射引导至所述多个显微荧光计中的两个或更多 个显微荧光计的物镜，由此两个或更多个显微荧光计可共享激励辐射源。
[0021] 所述显微荧光计中的每一个还可包括至少两个激励辐射源。
[0022] 所述激励辐射源可包括LED。
[0023] 所述显微荧光计中的每一个的物镜可具有0. 2和0. 5之间的数值孔径。
[0024] 所述显微荧光计中的每一个可被配置成以足以区分相隔小于50微米的特征的分 辨率进行检测。
[0025] 所述显微荧光计中的每一个的宽视场影像可具有至少Imm2的面积。
[0026] 所述支架可阻止所述显微荧光计之间的横向移动。
[0027] 所述显微荧光计可与所述支架共同模制。
[0028] 所述支架可包括至少四个显微荧光计，其中所述至少四个显微荧光计的物镜可被 布置成至少两排。
[0029] 所述至少四个显微荧光计的物镜可以成六边形堆积排列。
[0030] 所述基板可包括至少四个平行通道，并且其中所述物镜中的每一个可被定位成 对所述四个平行通道中的唯一的一个通道进行成像。
[0031] 所述物镜中的每一个可被定位成对所述唯一的一个通道的部分进行成像。
[0032] 所述支架可包括至少六个显微荧光计，其中所述至少六个显微荧光计的物镜可被 布置成至少两排，并且其中所述至少六个显微荧光计的物镜可成六边形堆积排列。
[0033] 所述基板可包括至少六个平行通道，并且其中所述物镜中的每一个可被定位成对 所述六个平行通道中的唯一的一个通道的至少一部分进行成像。
[0034] 所述显微荧光计中的每一个还可包括激励辐射源、分束器和检测器，其中所述分 束器可被定位成将来自所述激励辐射源的激励辐射引导至所述物镜以及将来自所述物镜 的发射辐射引导至所述检测器，其中所述激励辐射和发射辐射可在相互正交的方向上被引 导。
[0035] 所述至少四个显微荧光计的所述激励辐射源可被布置在与所述公共平面相对的 所述支架的第一侧上，其中所述检测器中的至少两个可被布置在与所述第一侧正交并且与 所述公共平面正交的所述支架的第二侧上，并且其中所述检测器中的至少两个可被布置在 与所述第一侧正交并且与所述公共平面正交的所述支架的第三侧上。
[0036] 所述至少四个显微荧光计的所述检测器可被布置在与所述公共平面相对的所述 支架的第一侧上，其中所述激励辐射源中的至少两个可被布置在与所述第一侧正交并且与 所述公共平面正交的所述支架的第二侧上，并且其中所述激励辐射源中的至少两个可被布 置在与所述第一侧正交并且与所述公共平面正交的所述支架的第三侧上。
[0037] 所述支架可包括至少四个显微荧光计，其中所述至少四个显微荧光计的物镜可被 布置成单排。
[0038] 所述基板可包括至少四个平行通道，并且其中所述物镜中的每一个可被定位成对 所述四个平行通道中的唯一的一个通道进行成像。
[0039] 所述物镜中的每一个可被定位成对所述唯一的一个通道的一部分进行成像。
[0040] 本申请还提供一种对基板进行成像的方法，包括以下步骤：（a)提供在表面上包 括荧光特征的基板；(b)使用多个显微荧光计获取表面的第一部分的多个宽视场影像，其 中显微荧光计中的每一个从表面的不同位置获取宽视场影像，其中所述多个显微荧光计被 固定到支架；以及（C)在平行于表面的方向上平移支架并且针对表面的第二部分重复（b)。 该方法可以使用本文其他地方所述的设备中的任何一种，但是无需在所有实施例中受此限 制。
[0041] 还提供了流体卡盘（fluidics cartridge)，其包括：（a)具有光学透明表面、入口 和出口的流动池；和（b)由光学不透明且不可透过含水液体的材料制成的壳体，其中所述 壳体保持：（i)样品贮存器；（ii)样品贮存器和流动池的入口之间的流体线路；（iii)经由 流动池的入口与流动池流体连通的多个试剂贮存器；（iv)至少一个阀，其被配置成协调贮 存器和流动池的入口之间的流体连通；以及（V)至少一个压力源，其被配置成将液体从样 品贮存器或试剂贮存器经由流动池的入口移动到流动池，其中光学透明窗口中断壳体并且 入口端口中断壳体，其中入口端口与样品贮存器流体连通，并且其中光学透明表面被定位 在窗口中。
[0042] 本申请还提供了一种测序方法，其包括以下步骤：（a)提供一种具有以下各项的 流体卡盘：（i)具有光学透明表面的流动池，（ii)核酸样品，（iii)用于测序反应的多个试 剂，以及（iv)用于将试剂输送到流动池的流体系统；(b)提供一种具有以下各项的检测设 备：（i)多个显微荧光计，其中显微荧光计中的每一个包括被配置用于在X和y维度上在影 像平面中的宽视场影像检测的物镜，以及（ii)样品平台；(c)将流体卡盘输送到样品平台， 其中光学透明表面被置于影像平面中；以及（d)在流体卡盘中执行核酸测序过程的流体操 作以及在检测设备中执行核酸测序过程的检测操作，其中（i)通过流体系统将试剂输送到 流动池，以及（ii)通过多个显微荧光计检测核酸特征。
【附图说明】
[0043] 图1示出了可用于核酸测序的光电检测装置（左）和流体卡盘（右）。
[0044] 图2示出了用于具有正交激励和发射光束路径的单个显微荧光计的光学布局。
[0045] 图3示出了用于显微荧光计的光学布局。
[0046] 图4示出了与具有两个通道的流动池相关的四个显微荧光计的排列。
[0047] 图5示出了可以被用在显微荧光计中的自动聚焦设备。
[0048] 图6A示出了流动池中的四个通道的排列（左）和单排物镜的线性排列（右）的 顶视图。
[0049] 图6B示出了具有八个通道的流动池（左）和四个一排的两排共八个物镜的排列 的顶视图。
[0050] 图7示出了流动池中六个通道的排列（左）和两排物镜的六边形堆积排列（右） 的顶视图。
[0051] 图8示出了检测设备的八个显微荧光计的排列的透视图。
[0052] 图9示出了检测设备的八个显微荧光计的排列的底部平面图。
[0053] 图10示出了具有平行激励和发射光束路径的单个显微荧光计的光学布局。
[0054] 图11示出了检测设备的Y平台的顶部透视图。
[0055] 图12示出了检测设备的Y平台的底部透视图。
[0056] 图13示出了支持八个显微荧光计的排列的Y平台的顶部透视图。
[0057] 图14示出了检测设备的电气框图。
[0058] 图15示出了带有流动池的流体卡盘的分解图。
[0059] 图16示出了流体卡盘的流体学图。
[0060] 图17示出了四个样品注射旋转阀。
[0061] 图18示出了使用单向流动和两个阀的试剂重用系统的流体学图。
[0062] 图19示出了使用往返流动和单个阀的试剂重用系统的流体学图。
【具体实施方式】
[0063] 本申请提供用于平坦区域（如在基板表面上存在的那些平坦区域）的高分辨率检 测的方法和设备。一种特别有用的应用是存在于表面上的生物样品的基于光学的成像。例 如，本文所述的方法和设备可用于获取存在于核酸阵列（如用于核酸测序应用中的那些核 酸阵列）中的核酸特征的影像。可以使用利用光学可检测的样品和/或试剂的多种核酸测 序技术。这些技术特别好地适用于本申请的方法和设备，并因此强调针对本申请的特定实 施例的各种优点。出于说明的目的以下阐述了这些优点中的一些，并且尽管例举了核酸测 序应用，但是这些优点也可被扩展到其他应用。
[0064] 关于本文所述的实例中的一些，许多核酸测序技术的显著特征是（1)多色检测的 使用（例如，通常使用四种不同的荧光团，一个荧光团用于存在于核酸中的不同核苷酸类 型A、C、G和T(或U)中的每一个），⑵来自核酸样品的大量的不同片段（例如，来自基因 组样品、RNA样品或其衍生物的片段）在阵列的表面上的分布以及（3)阵列的流体处理和 成像的重复循环。本文所公开的方法和设备的实施例特别可用于核酸测序，因为它们可以 提供具有多种颜色和多处重复的阵列表面的高分辨率成像的能力。例如，本文所述的实施 例允许在几百、几十或者甚至单位数微米范围内的分辨率下获取表面的影像。同样地，可以 分辨具有最近相邻的平均中心至中心间距低于100微米、50微米、10微米、5微米或更小的 核酸特征。在特定的实施例中，可以获取表面的宽视场影像，包括例如覆盖阵列的Imm2或更 大的面积的影像。可以同时或顺序地获取具有多种颜色的影像，例如，以识别唯一与不同的 核苷酸类型相关联的荧光标记。此外，可以针对测序技术的多个循环顺序地获取影像。可 以从每个循环可靠地比较来自阵列的给定区域的影像以确定针对阵列上的每一个核酸特 征检测到的颜色变化的序列。颜色变化的序列可以依次用于推断在每个特征中核酸片段的 序列。
[0065] 在特定的实施例中，本申请的设备包括一个或多个显微荧光计。显微荧光计中 的每一个可以包括激励辐射源、检测器以及物镜，以形成读取头的集成子单元。在每一 个显微荧光计中可以存在其他光学部件。例如，可以存在分束器以提供紧凑的落射荧光 (印ifluorescent)检测配置，由此分束器被定位成将来自激励辐射源的激励辐射引导至物 镜以及将来自物镜的发射辐射引导至检测器。
[0066] 使用集成显微荧光计设计的优点在于：例如在扫描操作中，可以方便地移动显微 荧光计，以允许比显微荧光计的视场大的基板的成像。在特定的实施例中，几个显微荧光计 可以结合以形成读取头。下文阐述了用于读取头的结合的各种配置，并且可加以选择以适 用于待成像的基板的特殊格式，同时对于整个读取头保持相对紧凑的尺寸。在本申请的几 个实施例中，读取头相对较小的尺寸和较轻的质量导致相对低的惯性，使得读取头在被移 动之后迅速地停止，从而有利于快速扫描核酸阵列或其他基板。在一些情况下，显微荧光计 可以被固定到支架，使得它们在分析应用（如核酸测序运行）的过程中在至少一些维度上 不可独立地移动。例如，多个显微荧光计可以是永久固定的，使得它们在X和y维度上（其 中X或y中的至少一个是扫描的方向）相对于彼此不可独立地移动。然而，可以在z维度上 独立地驱动显微荧光计，以提供独立的聚焦控制。本申请的设备的几个不同显微荧光计之 间的自由度的减少提供了免于在设备的运输、操作和使用过程中造成的对准损失的保护。
[0067] 在一些实施例中，存在于读取头或支架中的多个显微荧光计中的每一个可具有专 用自动聚焦模块。因此，每个显微荧光计可以独立地聚焦。在一些实施例中，在读取头中的 特定自动聚焦模块，尽管专用于特定的显微荧光计的驱动，但仍然可以从读取头中的至少 一个其他自动聚焦模块接收信息，并且来自特定自动聚焦模块以及来自至少一个其他自动 聚焦模块的信息可用于确定适当的驱动以实现特定显微荧光计的期望聚焦。这样，对于任 何给定的显微荧光计的聚焦可以利用存在于相同的读取头或支架中的两个或多于两个显 微焚光计之间的一致来确定。
[0068] 在特定的实施例中，可以以卡盘格式提供将以本文所述的方法或设备进行检测的 样品。例如，卡盘可包括沿着用来处理基板以进行检测的其他流体部件的待检测的基板。 以核酸测序应用为更具体的实例，卡盘可包括能够向检测装置呈现核酸特征阵列的流动 池，以及可选地用于保持测序试剂的贮存器、用于保持样品制备试剂的贮存器、用于保持测 序过程中产生的废物产品的贮存器中的一个或多个，和/或能够将流体移动通过流动池的 栗、阀和其他部件。流体卡盘同样可提供方便和紧凑的格式的优点，以便用于核酸测序的样 品和试剂的存储和处理。
[0069] 在特定的实施例中，流体卡盘可被配置成允许一种或多种试剂的重复使用。例如， 流体卡盘可被配置成将试剂输送到流动池，然后从流动池移除试剂，并且然后重新将试剂 引入流动池。重复使用试剂的优点是减少浪费以及降低利用昂贵的试剂和/或以高浓度 (或以高的量）被输送的试剂的过程的成本。
[0070] 本申请的流体卡盘可以提供模块化的优点，由此可以在第一模块（即流体卡盘） 中对不同的样品进行流体处理，所述第一模块与第二模块（例如，显微荧光计、读取头或检 测设备）光学连通。流体卡盘可以包含足够整个流体处理过程（例如，核酸测序过程）的 一个或多个样品、试剂和流体器件，并且流体卡盘可以被输送到检测设备。一旦流体和检测 过程完成，可以将流体卡盘移除，使得检测设备准备进行另一个过程。由于流体模块和检测 模块是可分离的，本系统允许评估多个不同的样品，同时避免样品之间的交叉污染的危险。 通过避免光学部件的不必要的维修、净化或处理，这为其中检测部件相对昂贵并且技术上 很难组装的实施例提供了优点，其中当流体部件和光学部件不是模块化的时候可能需要所 述的维修、净化或处理。
[0071] 图1示出了示例性的光学扫描装置1，其利用通过本文所述的几个实施例提供的 集成光电子学和基于卡盘的流体学的优点。示例性装置1包括壳体2,该壳体2包含各种固 定部件，例如包括光学部件、计算部件、电源、风扇等。例如，存在于壳体2的正面上的屏幕 3用作图形用户接口，其可以提供各种类型的信息，如工作状态、正在进行的分析过程（例 如，测序运行）的状态、到达或来自装置1的数据传送的状态、用法说明、警告等。卡盘座4 也存在于壳体2的正面上。如图所示，卡盘座4可被配置成具有保护门5的狭槽。在该实 例中，存在在卡盘座的框架上为指示灯形式的状态指示器6,并且其可被配置成指示装置 1中卡盘的存在或不存在。例如，指示灯6可以从开改变为关或从一种颜色改变为另一种颜 色以指示卡盘的存在或不存在。在该实例中，电源控制按钮7存在于壳体2的正面上，识别 标记8 (如生产商或器械的名称）也存在于壳体2的正面上。
[0072] 图1中还示出了示例性的流体卡盘10,其可用于向装置1提供样品和试剂。流体 卡盘10包括壳体11，该壳体11保护各种流体部件，如贮存器、流体连接件、栗、阀等。流动 池12被集成到流体卡盘中与壳体内的试剂流体连通的