基于原子力显微镜的启动子体外强度表征的新方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体是一种基于原子力显微镜(atomicforcemicroscopy,afm)的启动子体外强度表征的方法。

背景技术：

在基因表达过程中，启动子是一个重要的顺式调控元件(cis-actingelement)。通过改变启动子强度，调控关键基因的转录水平，精细调节代谢流量的分配，从而实现在追求产物最大积累效率的同时减少细胞代谢负担，成为工业微生物领域的研发热点。近年来，随着代谢工程及合成生物学的发展，以启动子为代表的代谢调控元件的标准化、模块化处理是一大趋势，因此需要高效、精确定量表征启动子活性的策略。

目前通过报告基因的表达量来评价启动子活性是比较常用的策略。然而这种分析方法操作繁琐、周期长、易受到菌体生长阶段和生理状态的干扰，最终的表达量还受到其他多重元件的调控，并不能直接体现启动子的调控效果，并且造成不同表达系统之间启动子强度数据无法直接比较的问题。加之受到检测方法的限制，导致定量分析效率低，准确度不高，制约了启动子元件化，标准化的发展。此外，emsa、体外转录等方法也为我们提供了体外表征启动子活性的选择，但由于其准确度低，操作复杂，需要标记等缺点，并未受到广泛使用。

启动子是调控基因转录的重要顺式元件，rnap通过其σ亚基识别并结合在启动子核心区域的-10以及-35区的保守序列，从而启动转录。启动子与rnap特异性结合是启动转录的第一步，也是最关键的一步，它们的结合强度决定了转录水平的高低。从分子交互作用的角度考察启动子与rnap的识别机制，可以为启动子强度的精准量化表征提供新的策略。因此，开发基于分子交互作用的启动子精确定量表征方法具有重大意义，同时可行性较强。利用afm力谱分析，以原核生物启动子为例，并人工设计关键位点突变的一系列启动子，在体外从多角度分析启动子与rnap间的交互作用，采集包括结合概率，交互作用力等量化参数。得到的交互作用参数与利用体内报告基因(cat)表达量表征得到的启动子强度进行关联、验证，进而构建基于体外交互作用分析的启动子强度初步筛选方法，为可精准调控启动子元件研究提供新策略。而现有技术中没有通过采用原子力显微镜直接测量启动子与rna聚合酶之间的相互作用力，实现体外基于afm力谱分析启动子强度的研究目前仍相对缺乏。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种基于原子力显微镜(atomicforcemicroscopy,afm)力谱的启动子体外强度表征的方法。通过采集得到1000多条启动子-rna聚合酶力-距离曲线，对这些曲线进行统计得到交互作用力值及结合概率。利用r语言结合力、结合概率的参数与传统的启动子强度表征策略-通过报告基因表达量进行相关性分析，证明了该方法的可行性，并具有检测时间短、效率高、步骤少等优点。实现了体外基于afm力谱分析启动子强度的新方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

首先在液体环境中采集得到1000多条启动子-rna聚合酶力-距离曲线，设定10-40nm的解离距离内出现的交互作用力为待采集的特异性交互作用力。接着对这些曲线进行统计得到特异性作用力分布图，分析得到交互作用力值及结合概率。最后通过r语言对所有体外参数与报告基因(cat)表达量进行相关性分析，证明了该方法的可行性。包括以下步骤：

1.启动子-rna聚合酶力-距离曲线采集的具体方法是：在液体环境中采用afm的接触模式测定了t7启动子与t7rnap间的交互作用力，并且选择sp6启动子为对照。

2.待采集的特异性交互作用力的具体方法是：设定10-40nm的解离距离内出现的交互作用力为待采集的特异性交互作用力。即在力-距离曲线中，小于10nm距离内出现的交互作用为非特异性事件，不收集数据；而出现在10-40nm之间的交互作用事件会被记录下参数，进行后续的统计分析。

3.获得特异性交互作用力的具体方法是：通过对上述的这些曲线进行统计得到特异性作用力分布图，t7启动子与t7rnap间的交互作用力大小主要集中在100-500pn的范围内，概率分布图满足高斯分布，通过统计分析得到启动子与聚合酶的作用力的大小(结合力分布峰值)即为交互作用力值。

4.获得结合概率的具体方法是：存在典型交互作用事件的曲线的数量占样本总量的比例即为结合概率。

5.相关性分析的具体方法是：利用r语言计算pearson相关性系数。而pearson相关性系数是通过cor()函数可以计算的。相关系数计算的参数可化简为：cor(x,use＝,method＝)，其中x为数据框，use为数据的处理方式，method为指定相关系数类型。计算出来的相关性系数值越接近于1说明相关度越大。

6.显著性检验的具体方法是：相关关系计算出来后，需要对其进行统计显著性检验。一般利用cor.test()函数对单个pearson关系系数进行检验，简化后为：cor.test(x,y,alternative＝,method＝)，其中的x及y为要检验相关性的变量，alternative取值为two.side，method用来指定要计算的相关类型。当计算出来的p值小于或等于0.05时说明相关性具有显著性水平且具有意义。

本发明的有益效果是：本发明建立了一种基于原子力显微镜的启动子体外强度表征的新方法。首先在液体环境中采集得到1000多条启动子-rna聚合酶力-距离曲线，设定10-40nm的解离距离内出现的交互作用力为待采集的特异性交互作用力。接着对这些曲线进行统计得到特异性作用力分布图，分析得到交互作用力值及结合概率。最后通过r语言对所有体外参数与报告基因(cat)表达量进行相关性分析，证明了该方法的可行性，并具有检测时间短、效率高、步骤少等优点。本发明，对启动子与rna聚合酶的识别、结合行为进行了全面的体外交互作用分析，并从多角度验证了基于afm力谱分析是一种体外、高效、定量表征启动子活性的方法具备较强的有效性和可行性。其结果为精准调控启动子元件研究提供新策略。

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。

图1是基于afm力谱分析的t7启动子与t7rna聚合酶的交互作用图：(a)t7/rnap及sp6/rnap间测得的作用力频率分布图；(b)t7及sp6启动子与t7rnap之间的结合概率。

图2是突变的t7启动子与t7rna聚合酶之间的交互作用图：(a)t7-10t/rnap间测得的作用力频率分布图；(b)t7-10c/rnap间测得的作用力频率分布图；(c)t7-11t/rnap间测得的作用力频率分布图；(d)t7-10t、t7-10c及t7-11t启动子与t7rnap之间的结合概率。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明进一步说明。

实施例1

发明中afm探针为金涂覆悬臂探针，原子力显微镜来源于布鲁克dimensionicon扫描探针显微镜。测体外相互作用所用的启动子序列如下：

t7-f：taatacgactcactatagggagatttttt-shc6

t7-r：aaaaaatctccctatagtgagtcgtatta

t7-10c-f：taatacgcctcactatagggagatttttt-shc6

t7-10c-r：aaaaaactccctatagtgaggcgtatta

t7-10t-f：aatacgtctcactatagggagatttttt-shc6

t7-10t-r：aaaaaatctccctatagtgagtacgtatta

t7-11t-f：taatactactcactatagggagatttttt-shc6

t7-11t-r：aaaaaatctccctatagtgagtagtatta

sp6-f：atttaggtgacactatagaagaatttttt-shc6

sp6-r：aaaaaattcttctatagtgtcacctaaat

其中，下划线序列为柔性连接序列，以增加固定化后启动子与蛋白之间的接触概率；shc6为巯基末端，用于下一步的afm金镀层探针表面固定；

实施例2

基于原子力显微镜的t7及突变启动子体外强度的测定

一、t7启动子与rna聚合酶交互作用的测定：

1、在智能模式下得到对rna聚合酶进行扫描，在得到蛋白在表面的位置信息后，对各个蛋白分子进行10个力曲线的采集。

2、设定探针对基底表面施加400pn的力并停留在基底单分子蛋白表面3s，以保证启动子和蛋白质有足够时间特异性结合。

3、采集到的1000多条力曲线中所得到特异性作用力出现的分布图(图1)，这一统计结果显示，t7启动子与t7rnap间的交互作用力大小主要集中在100-500pn的范围内，概率分布图满足高斯分布，通过统计分析得到启动子与聚合酶的作用力的大小(结合力分布峰值)为307.2±6.7pn。

4、在对照实验中，测定了sp6启动子(不与t7ranp特异性识别)修饰的针尖与t7rnap修饰的基底间的交互作用力，得到了作用力出现的分布图(图1(a))及两者之间的结合概率(存在典型交互作用事件的曲线的数量占样本总量的比例)(图1(b))，可以看出sp6启动子与t7rnap的结合事件发生的概率显著减少，仅为实验组的12.0％，并且其结合力分布并无明显的正态分布特征。该结果进一步证实了t7启动子与t7rnap之间的交互作用为特异性的识别与结合。

二、定点突变的t7启动子与t7rna聚合酶间的交互作用：

1、将t7启动子-10位点的a碱基改为c碱基得到t7-10c启动子，将-10位点的a碱基改为t碱基得到t7-10t启动子，同样将-11位点的g碱基改为t碱基将得到t7-11t启动子。

2、图2为通过采集到的1000条力曲线中所得到特异性作用力出现的分布图，这一统计结果显示，t7-10c、t7-10t及t7-11t启动子修饰的针尖与t7rnap修饰的基底间的交互作用力的大小主要集中在200-500pn的范围内，概率分布图满足高斯分布，通过统计分析得到t7-10c、t7-10t及t7-11t启动子与t7rnap的作用力的大小(结合力分布峰值)分别为246.6±6.5pn、245.8±7.2pn、206.1±6.6pn得到了理论上的中等强度和弱启动子。从两者之间的结合概率(图2(d))可以得到t7-11t/t7rnap之间结合概率与t7/t7rnap及t7-10c(10t)/t7rnap相比也明显减少，即强启动子与rna聚合酶发生结合的事件更频繁。

三、启动子/rna聚合酶体外交互作用参数与启动子强度的相关性分析：

通过afm力谱分析，得到了多重启动子与rnap体外交互作用参数。这些参数以及通过体内表征启动子强度的报告基因(cat)的相对酶活汇总见表1。这些参数是否都能体现启动子的启动活性，需要进行甄别工作。因此，对这些体外交互作用参数与报告基因的相对酶活进行相关性分析，得到与启动子强度显著性相关的参数，排除相关性不显著的参数。首先通过spss软件对四个参数分别进行shapiro-wilk进行检测，发现相对酶活、交互作用力、结合概率的sig.值分别是0.261、0.585、0.698均大于0.05，说明每个参数的样本数据是正态性的，具备相关性分析的前提条件。然后利用r语言计算pearson相关性系数，发现交互作用力、结合概率与相对酶活的相关性系数分别为0.89、0.91。计算得到相关关系后，继续利用r语言对它们进行显著性检验，p值分别为0.05、0.04。综上结果，得到体外交互作用力、结合概率与相对酶活(表征启动子强度)呈现显著的正向相关关系。进而说明该方法具有准确和定量性。

获得的t7启动子相关参数的汇总表

四、afm力谱表征启动子强度方法与传统方法(cat酶活表征启动子强度)比较：

cat酶活表征启动子方法测定的结果与细胞生理条件息息相关、受其他调控原件的干扰、不直接，不同系统间不好比较等缺点，而afm力谱表征启动子强度方法很好的避免了这些缺点。在得到启动子强度所需时间方面：afm力谱法仅需要20几个小时，而cat酶活法最快需要3天，由此可见afm力谱法大大增加了测定效率。同样在实验步骤数方面：afm力谱法仅需要4步，而cat酶活法需要十几步，由此可见afm力谱法更加简便。

本实例采用原子力显微镜技术，本发明建立了一种基于原子力显微镜的启动子体外强度表征的新方法。首先在液体环境中采集得到1000多条启动子-rna聚合酶力-距离曲线，设定10-40nm的解离距离内出现的交互作用力为待采集的特异性交互作用力。接着对这些曲线进行统计得到特异性作用力分布图，分析得到交互作用力值及结合概率。最后通过r语言对所有体外参数与报告基因(cat)表达量进行相关性分析，证明了该方法的可行性，并具有检测时间短、效率高、步骤少等优点。本发明，对启动子与rna聚合酶的识别、结合行为进行了全面的体外交互作用分析，并从多角度验证了基于afm力谱分析是一种体外、高效、定量表征启动子活性的方法具备较强的有效性和可行性。其结果为精准调控启动子元件研究提供新策略。

上述虽然结合具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。