专利名称：用于植物纤维表征和鉴定的方法
技术领域：
本发明涉及用于分离生物大分子的方法，这些生物大分子包括来自成熟植物纤维 (如棉纤维)的肽、蛋白质、以及核酸。在该生物大分子的分离之前，这些植物纤维可能已 经加工成纱线，这些纱线随后可以被织造或针织成织物或成品服装。由于这些分离的大分 子含有编码在它们的构造单元的序列中的信息，根据当前描述的方法从植物纤维分离出的 这些大分子可以方便地用于表征该植物纤维或鉴定该植物纤维的起源或来源。使用植物纤 维的历史来源，所生成的信息可以用在例如用于特殊植物纤维的个性特征保护(identity preservation)程序、植物纤维起源的证明中或者甚至用在育种系谱的重建中。
背景技术：
植物纤维形成对于在经济上重要的产品如纸、绳索(绳和索)以及纺织品的一个 来源。一种纤维被植物学地定义为一种长的窄的尖端细的细胞，其在成熟时是无活力的和 中空的、具有大部份由纤维素和通常的木质素组成的硬的厚的细胞壁。在双子叶茎(亚麻、 黄麻、大麻、苎麻)的韧皮部(内部树皮)中发现软纤维或韧皮纤维。在单子叶植物的(剑 麻、马尼拉麻、菠萝)叶脉管束中发现硬纤维或叶纤维。表面纤维由种子类(棉花)、叶类或 果实类(椰子纤维)的表面长成。棉花提供了许多用于纺织工业的高质量纤维并且在通过经典方法或通过遗传上 改变棉株的基因组获得具有适于工业要求的特征的棉纤维方面已经投入了较多的努力。棉纤维作为一个种子毛状体，更确切地说在开花期或正好在开花期之前从胚 珠的外珠被的表皮开始的单个细胞而起源。棉纤维的形态学发育已经很好地被文件证 明(Basra and Malik, 1984, Int Rev of Cytology 89 65-113 ；Graves and Stewart, 1988, supra ；Ramsey and Berlin, 1976, American Journal of Botany 63(6) :868_876 ; Ruanand Chourey，1998，Plant Physiology 118 399-406 ；Ruan et al.2000, Aust. J. PlantPhysiol. 27 795-800 ；Stewart, 1975，Am. J. Bot. 62，723-730)。棉纤维，特别是来 自陆地棉的棉纤维，经历了四个重叠的发育阶段纤维细胞开始、延长、次生胞壁生物合成、 以及成熟。纤维细胞开始是一种快速的过程。在开花期之后白色毛绒纤维立即开始发育并 且持续至约3个开花后天数(DPA)，此后纤维细胞延长(直到约10至约17DPA)。取决于生长 条件，次生胞壁生物合成开始并且持续至约25至40DPA，随后是一个直到约45至约60DPA 的成熟过程。该次生胞壁合成以及成熟期通常被视为“纤维强度建立期”。仅仅约25%至 30%的表皮细胞分化成商业上重要的棉绒纤维(Kim和Triplett，2001)。大多数细胞不分 化成纤维或发育成短纤维或绒毛。在纤维延长以及次生壁代谢期间，纤维细胞快速延长、合 成次生壁成分、并且显示出急剧的细胞、分子以及生理学变化。纤维延长是与快速的细胞生 长禾口膨胀(Seagull, 1991. In Biosynthesis and biodegradation of cellulose (Haigler, C. H. &ffeimer, P. J.，eds)pp. 1432163，MarcelDekker, New York)以及大量的细胞代谢物以 及细胞壁成分如纤维素的恒定合成相结合的。在成熟的棉纤维中约95%的干重是纤维素 (Pfluger 禾口 Zambryski，2001，Curr Biol 11 :R436-R439 ；Ruan et al.，2001，PlantCell 13:47-63)。非赛璐珞成分(non-celluloid component)对于纤维细胞发育也是重要的(Hayashi and Delmer,1988,Carbohydr. Res. 181 273-277 ；Huwyler et al. ,1979,Planta 146 635-642 ；Meinert and Delmer,1977, Plant Physiol 59 1088-1097 ；Peng et al., 2002, Science 295 147-150)。与其他的植物细胞比较，棉纤维在次生壁中不含有木质素但 是具有推测地与快速的细胞生长和膨胀相关的大空泡(Basra andMalik, 1984, supra ；Kim and Triplett,2001, Plant Physiology 127 1361-1366 ；Mauney,1984, supra ；Ruan and Chourey,1998, supra ；Ruan et al. ,2000, supra ；Van 't Hof,1999,American Journal of Botany 86 :776_779)。发育的棉纤维是活的细胞并且因此含有生物大分子如肽、蛋白质以及核酸(如 DNA和RNA)。相比之下，成熟的纤维是无活力的中空的细胞，主要由纤维素组成。通常公认 的是纤维细胞特别是棉纤维细胞不再含有可提取的核酸或蛋白质。基于这样的惰性，棉拭 子被用作一种医学物质的涂抹器以及在法律学调查中用于(最通常地)从内颊取得DNA样
P
ΡΠ O此外，植物纤维在它们的在工业中的使用(尤其是在它们的在纺织工业中的使 用)之前经受了广泛的加工。关于棉花，从在大田中的粗纤维加工成出售的成品服装包括 很多步骤，这些步骤取决于所希望的终产品而变化很大。通常可以将在这些过程中的不同 的可能步骤分成机械和化学步骤。收获以及轧棉的过程可以使纤维经受热损伤和机械损伤。在轧棉期间没有施用化 学药品。如果它含有大于8%的水分，在该轧棉期间通常利用热量来干燥棉花。通常周密地 调节加热以避免纤维损伤。在采摘和轧棉期间可以发生机械损伤。这种机械损伤将会影响 一个非常低％的总纤维。在纺纱期间，这些过程步骤主要是机械性的。在该纺纱过程中去除了短纤维(未 成熟的和/或机械损伤的纤维)以及杂质。当用于针织的纱线是用一种润滑剂处理过并 且用于织造的纱线的约一半是用胶料处理过时，在朝向纺纱过程的终点进行了加工中的第 一化学处理。最通常地用蜡作为润滑剂处理用于针织的棉纱以便促进纱线通过针织设备移 动。合成润滑剂也是可供使用的但是蜡仍然被认为是最常见的处理。对在完成的织物(经 编织物)中将用作纵向股的用于织造的纱线进行上浆(还被称为浆纱)。侧面的(充填) 纱线未经上浆处理。用于上浆的普通材料是淀粉。还将聚乙烯醇用于上浆并且淀粉与聚乙 烯醇的混合物是常见的。还可以将添加剂如粘合剂、保湿剂、软化剂、湿润剂、消泡剂以及其 他辅助剂添加至该上浆处理。针织和织造两者都是不涉及化学或热应用的机械过程。在针织和织造结束时，用 于最终处理的制备所生成的织物的步骤涉及化学药品(并且在一些情况下涉及高温)的应 用。该最终处理步骤的制备过程目标在于去除杂质，这些杂质将干扰贯穿染色、印制或其他 的最终处理步骤的加工。主要地，必须从针织的织物去除蜡(擦洗)并且必须从织造的织 物去除浆料(脱浆)。可以在这个步骤中去除其他的杂质包括籽壳、果胶以及其他的化学药 品。用于脱浆的化学药品包括用于去除淀粉的酶类以及用于去除聚乙烯醇的苏打、灰或洗 涤剂。擦洗是用将溶解蜡或使用的其他的润滑剂的有机溶剂进行的。在擦洗或脱浆之后， 通常使用氯漂白剂或过氧化物漂白剂对织物进行漂白。漂白的目标在于去除任何剩余的 非纤维材料、残留浆料的水解、氧化、以及去除以及改善染料的吸收度。用过氧化物进行漂 白可以涉及在接近沸水温度的蒸汽或水浴，并且该漂白浴可以含有添加剂如稳定剂和掩蔽剂。用氯的漂白是在较低的温度(40至50摄氏度)下进行的并且相比于用过氧化物纤维 素降解是较少的。如果是用氯进行漂白的，还需要脱氯剂处理。在一些织物上用一个受控 制的火焰进行烧毛以便清理织物表面并且去除或减少起球。可以将光增亮剂添加至作为白 色的未染色产品待售的织物或服装。典型地将阴离子有机光增亮剂用于棉花上。若干化合 物是可供使用的并且一些可以在漂白期间加入。丝光处理是一个可以施用于棉纱或织物的过程，用于改善染料的吸收或对其的反 应以及其他的化学最终处理、改善断裂强度、改善尺寸稳定性、改善平滑性和光泽以及掩盖 不成熟的棉纤维。它是一个涉及用NaOH处理、洗涤、酸洗、漂洗以及干燥的过程。最常见的最终处理是染色。它可以在纱线、织物或服装阶段进行。用于棉花的染 料是很多的并且有许多不同的类型。最常见的用于棉花的染料产品是靛蓝，但是它仅仅代 表4%的染色的织物。染色可以作为一种连续过程或分批过程完成。虽然用于染色的化学 药品是很多的，该过程通常涉及在染缸中接近沸腾的高温的使用，在其中该织物、纱线或服 装可以被浸没持续延长的时间。印制是用于对纺织品添加颜色或图样的另外的主要工艺。 印制主要涉及用于对织物或服装的表面施用着色墨的一个机械过程。染色和印制两者都涉 及在过程结束时应用化学固定剂。另一个常见的最终处理(特别是在染色之后)是侵蚀性洗烫 (aggressivelaundering)。这将会包括洗涤剂以及其他的清洁剂的使用以便从完成的织物 或服装去除残留的最终处理物质。可以对织物、纱线或服装施用许多其他的机械和化学最终处理步骤(涉及化学药 品和处理过程的很多选项)。单独的软化剂可以是三个不同类型并且每一类型可以涉及若 干不同的化学药品。尽管以上将粗棉纤维转化成目标使用的纺织产品的综述是高度广义的，将清楚的 是本领域的人员不会期望能够在许多通常涉及的化学和热处理步骤之后从纱线、纺织品或 成品服装产品提取肽、蛋白质或核酸。对于在工业中能够追踪织物纤维尤其是成熟的和/或加工的植物纤维的来源和/ 或起源存在着一种需要。这样的植物纤维的来源和/或起源的鉴定可能对于保证从特殊 种质生产的具有特定质量的纤维的生产和加工的证明过程是重要的，如FiberMax 证明 禾呈序(FiberMax Certification Program) (www, certifiedfibermax. com)。在成熟的 和/或加工的纤维中追踪来源和/或起源的能力还允许具有特殊特征的植物纤维(例如在 W02006/136351中描述的具有提高的化学反应性或可染性的纤维)的鉴定。现有的证明程序是基于一种特异种质的纤维作物(如棉花)的种子购买的种子零 售商或栽培者的记载以及注册的栽培者的生产的纤维的鉴定(在经过永久USDA棉包识别 码的棉花的情况下)。如果从含有与纤维的来源植物相关的生物信息的成熟的和/或加工的植物纤维 提取生物大分子(如肽类、蛋白质类、核酸类、DNA或RNA)将是可能的话，则追踪植物纤维 尤其是成熟的和/或加工的纤维的来源和/或起源的能力将会大大提高。这样，将会使现 有的证明程序的审核变成可能。此外，在供应链中的一个后期像例如在纺织者、织布者或零 售消费者水平(优于纤维的栽培者或供应商)鉴定纤维将会变成可能。农业研究机构，USDA和Applied DNA Sciences—起工作以研发一种基于DNA植入技术的标签系统用于追踪US来源的棉花和纺织品成分。(htpp//seedquest. com/News/releases/2004/February/7829. htm)。因此能够从植物纤维如棉纤维尤其是从成熟的和/或加工的纤维、纺织品、纱线 或服装中提取天然发生的生物大分子以及进一步能够从此类植物纤维导出植物来源相关 信息将会是有利的。通过允许从植物纤维如棉纤维尤其是从成熟的和/或加工的纤维、纺织品、纱线 或服装中提取天然生物大分子以及进一步能够从此类植物纤维导出植物来源相关信息，在 以下不同的实施方案、实例、图形以及权利要求书中描述的方法提供了一个对于上述问题 的方案。发明概述在一个实施方案中，本发明提供了用于表征成熟的植物纤维或加工的植物纤维例 如一种种子纤维或棉纤维的一种方法，该方法包括以下步骤从所述植物纤维分离天然发 生在所述植物纤维中的除多糖或木质素以外的一种生物大分子；并且表征编码在所述生物 大分子的单体的序列中的信息。在本发明的另一个实施方案中，本发明提供了用于鉴定成熟的植物纤维或加工的 植物纤维例如一种种子纤维或棉纤维的一种方法，该方法包括以下步骤从所述植物纤维 分离天然发生在所述植物纤维中的除多糖或木质素以外的一种生物大分子；并且使所述生 物大分子经受对所述植物纤维特异的检测分析。在一个实施方案中，该生物大分子可以是一种多肽、蛋白质、核酸、DNA、RNA、单链 RNA或双链RNA。在另一个实施方案中，该检测分析可以是一种基于聚合酶链反应的检测分析、一 种基于抗体的检测分析、或一种基于核酸杂交的检测分析。在又另一个实施方案中，该检测分析可以检测呈现于该产生纤维的植物的基因组 中的嵌合基因的存在或缺乏。该嵌合基因可以包括选自N-乙酰葡糖胺转移酶、草胺膦乙酰 转移酶(phosphinotricinacetyltransferase)、EPSPS、羟基苯丙酮酸双氧化酶(hydroxy phenylpyruvatedioxygenase)、苏云金杆菌晶体蛋白的一种杀虫部分、聚(ADP核糖)聚合 酶、聚(ADP核糖)葡萄糖水解酶、蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶、葡聚糖酶、纤维素合成酶、 甲壳酶、扩张蛋白(expansin)、胼胝质合成酶、激酶、烟酰胺酶、烟酰酸磷酸核糖基转移酶、
SljP-IIifSl(nicotinic acid mononucleotide adenyl transferase) 酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶(nicotinamide adenine dinucleotide synthetase)或烟酰 胺磷酸核糖基转移酶(nicotine amide phosphorybosyltransferase)的一个编码区或部 分或其反义部分。该检测分析还可以是一种转化事件特异性检测分析。在本发明的又另一个实施方案中，该检测分析可以检测呈现于该产生纤维的植物 的基因组中的特异等位基因的存在或缺乏。在本发明的又另一个实施方案中，从其中分离生物大分子的纤维是存在于纱线、 织物、组织或成品服装中的。本发明进一步提供了用于分析产生纤维的植物的基因组的方法，该方法包括以下 步骤从所述植物的成熟的或加工的纤维分离核酸，所述核酸是在所述植物纤维中天然发 生的；并且使所述核酸经受一个基因组分析方案。该方法可以应用于旧的成熟的纤维或旧的纱线、织物或成品服装。本发明的又一个实施方案是一种从成熟的植物纤维或加工的植物纤维分离核酸 如DNA的方法，该方法包括以下步骤将所述植物纤维在一种含有洗涤剂、蛋白酶、以及盐 的缓冲液中孵育持续一个延长的时间，优选持续一个4至100小时的时期；以及根据标准核 酸分离方法加工所述裂解缓冲液并且分离所述DNA。在本发明的另一个实施方案中，提供了一种从纺织的或针织的织物分离核酸如 DNA的方法，该方法包括以下步骤解开所述织物的线；将所述线在一种含有洗涤剂、蛋白 酶、以及盐的缓冲液中孵育持续一个延长的时间，优选持续一个4至100小时的时期；以及 根据标准核酸分离方法加工所述裂解缓冲液并且分离所述核酸。在本发明的又一个实施方案中，提供了一种从收获的成熟的植物纤维分离核酸如 DNA的方法，该方法包括以下步骤从该收获的成熟的植物纤维去除叶和茎废料；将所述植 物纤维在一种含有洗涤剂、蛋白酶、以及盐的缓冲液中孵育持续一个延长的时间，优选持续 一个4至100小时的时期；以及根据标准核酸分离方法加工所述裂解缓冲液并且分离所述核酸。本发明还提供了根据本发明在证明贸易的植物纤维的个性特征的过程中的一种 方法的使用。本发明进一步提供了确定在成熟的植物纤维或加工的植物纤维的一种混合物中 的不同植物纤维的相对量的一种方法，该方法包括以下步骤从所述植物纤维的混合物分 离天然发生在所述植物纤维中的除多糖或木质素以外的一种生物大分子；使所述生物大分 子经受对每一种所述植物纤维特异的检测分析；并且确定每一种纤维的相对量。在本发明的另一个实施方案中，提供了证明贸易的棉纤维的个性特征的一种方 法，所述方法包括通过注册的栽培者记载被鉴定的棉花种子的购买，所述棉花种子包括特 异的基因组构成并且产生一个特殊牌子的棉纤维；从所述被鉴定的棉花种子登记由所述注 册的栽培者生产的粗棉纤维包作为所述特殊牌子的棉纤维；通过与所述种子购买记载交互 核对证实所述棉包；优选主要地向磨机提供所述注册的棉包以便从所述牌子的棉纤维(特 别专有地从所述牌子的棉纤维)生产纱线、织物或服装；并且使用一种如在此描述的方案 以一个或多个步骤审核所述牌子的棉纤维的个性特征。附图简要说明
图1 在从成熟的棉纤维材料(陆地棉FM966)分离的核酸模板上的GhGlucl的 PCR扩增。泳道1 分子量标记；泳道2 来自纯化的纤维的模板DNA(ly 1)；泳道3 来自未 纯化的含有叶废料的纤维的模板DNA(Iyl)；泳道4:仅仅来自叶废料的模板DNA(Iyl)； 泳道5 来自纯化的纤维的模板DNA(5y 1)；泳道6 来自未纯化的含有叶废料的纤维的模 板DNA (5 μ 1)；泳道7 仅仅来自叶废料的的模板DNA (5 μ 1)；泳道8 无模板对照；泳道9 阳性对照_从FiberMax966 (FM966)植物材料分离的基因组DNA。图2 在从成熟的棉纤维材料(陆地棉FM966)棉纤维材料以及从4年大的海岛棉 (Gossypium barbadense)Pima Y5棉纤维材料分离的核酸模板上的GhGlucl的PCR扩增。 泳道1 分子量标记；泳道2-3 来自FM966纯化的不含有叶废料的纤维的模板DNA(5 μ 1)； 泳道4-5 来自FM966未纯化的含有叶废料的纤维的模板DNA (5 μ 1)；泳道6 来自不含有纤 维材料的FM966叶废料的模板DNA (5 μ 1)；泳道7_8 来自不含有叶废料的Pima Υ5纯化的
8纤维的模板DNA (5 μ 1)；泳道9 无模板对照；泳道10 阳性对照-从FiberMax966植物材料 分离的基因组DNA。图3 在通过不同的方案分离的核酸模板上的GhGlucl的PCR扩增。泳道1 分 子量标记；泳道2 通过DNeasy Plant Mini Kit分离的模板DNA (5 μ 1)；泳道3 通过 DNeasy Plant Mini Kit分离的模板DNA(1 μ 1)；泳道4 通过DNeasy Plant Mini Kit 分离的模板DNA(1 μ 1)；泳道5 通过DNeasy PlantMini Kit分离的模板DNA(5 μ 1)； 泳道 6 通过1Wizard Genomic DNAPurification Kit 分离的模板 DNA(1 μ 1)；泳道 7: 通过 Wizard Genomic DNAPurification Kit 分离的模板 DNA (5 μ 1)；泳道 8 通过 Wizard Genomic DNAPurification Kit 分离的模板 DNA (1 μ 1)；泳道 9 通过Wizard Genomic DNAPurification Kit分离的模板DNA(5 μ 1)；泳道10 通过CTAB程序分离的模 板DNA(1 μ 1)；泳道11 通过CTAB程序分离的模板DNA(5 μ 1)；泳道12 无模板对照；泳道 13 阳性对照-从FiberMax966植物材料分离的基因组DNA。图4 在棉布分离的核酸模板上的GhGlucl的PCR扩增。泳道1和8 分子量标 记；泳道2:来自棉布(在孵育)的模板DNA(Iyl)；泳道3 来自棉布(30’孵育)的模板 ΝΑ(1μ 1)；泳道4:来自棉布(在孵育)的模板DNA (5 μ 1)；泳道5:来自棉布(30’孵育) 的模板DNA (5 μ 1)；泳道6 无模板对照；泳道7 阳性对照-从FiberMax966植物材料分离 的基因组材料。图5 在从具有不同的织法(针织或机织)的棉衬衫分离的核酸模板上的GhGlucl 的PCR扩增。泳道1 分子量标记；泳道2 来自机织棉衬衫的模板DNA，在孵育，(1μ 1)；泳 道3:来自机织棉衬衫的模板DNA，在孵育，(5μ1)；泳道4:来自机织棉衬衫的模板DNA，在 孵育，( μ )；泳道5:来自机织棉衬衫的模板DNA，在孵育，(5μ1)；泳道6:来自针织棉衬 衫的模板DNA，在孵育，( μ )；泳道7:来自针织棉衬衫的模板DNA，在孵育，(5 μ 1)；泳道 8:来自针织棉衬衫的模板DNA，在孵育，(Ιμ )；泳道9:来自针织棉衬衫的模板DNA，在孵 育，(5μ 1)；泳道10 来自机织棉衬衫的模板DNA，6天孵育，(1μ 1)；泳道11 来自机织棉衬 衫的模板DNA，6天孵育，(5μ 1)；泳道12 来自机织棉衬衫的模板DNA，6天孵育，(1 μ 1)；泳 道13 来自机织棉衬衫的模板DNA，6天孵育，(5μ 1)；泳道14 来自针织棉衬衫的模板DNA， 6天孵育，(Iyl)；泳道15:来自针织棉衬衫的模板DNA，6天孵育，(5 μ 1)；泳道16:来自 针织棉衬衫的模板DNA，6天孵育，(Ιμ )；泳道17:来自针织棉衬衫的模板DNA，6天孵育， (5μ 1)；泳道18 无模板对照；泳道19 阳性对照-从FiberMax966植物材料分离的基因组 DNA。图6 在从成熟的转基因棉纤维材料(含有一种嵌合N-乙酰葡糖胺转移酶编码基 因)分离的核酸模板上的NodC的PCR扩增。泳道1 来自转基因纤维材料的模板DNA，复本 1(1 μ 1)；泳道2:来自转基因纤维材料的模板DNA，复本1(5 μ 1)；泳道3:来自转基因纤维 材料的模板DNA，复本2(1μ1)；泳道4:来自转基因纤维材料的模板DNA，复本2(5 μ 1)；泳 道5 无模板对照；泳道6 阳性对照-从转基因棉珠材料分离的基因组DNA ；泳道7 分子量 标记。图7 在来自陆地棉以及来自海岛棉的GhGluclA亚基因组等位基因之间进行鉴别 的端点Taqman分析的图示。使从Pima(海岛棉)或FM966 (陆地棉)植株(叶)材料制备 的基因组DNA样品(或者处于纯的形式或处于不同比率(75/25、50/50以及25/75)的混合物)经受TaqMan检测分析。X轴表明陆地棉Glucl等位基因的存在，而Y轴表明海岛棉 Glucl等位基因的存在。在该混合的DNA样品中，该Taqman分析允许不同比率的等位基因 两者的检测。图8 在来自陆地棉以及来自海岛棉给光型纤维以及马球衬衫纺织品的GhGluclA 亚基因组等位基因之间进行鉴别的端点Taqman分析的图示。从Pima(海岛棉)或FM966 (陆 地棉)植株(叶)材料制备的基因组DNA样品(或者处于纯的形式或者处于50/50比率 的混合物)作为对照样品。使从纤维材料(FM966包)或从纺织品材料(马球衬衫)制备 的核酸经受TaqMan检测分析。X轴表明陆地棉Glucl等位基因的存在，而Y轴表明海岛棉 Glucl等位基因的存在。在该分析中，仅仅检测到陆地棉等位基因，表明所有的纤维材料以 及所有的纺织品材料仅仅含有陆地棉型纤维。本发明的实施方案的详细说明当前描述的方法是基于这样的意外的发现，S卩，从成熟的和/或加工的植物纤维 尤其是从种子纤维如棉纤维提取生物大分子(除多糖以外)如肽、蛋白质以及核酸是可能 的。而且，该分离的DNA被证明具有足够的品质以便对于进一步的加工是有用的，该加工允 许使用例如检测分析如基于聚合酶链反应的扩增对这些纤维进行表征。因此，在一个第一实施方案中，本发明提供了用于成熟的植物纤维或加工的植物 纤维的一种方法，该方法包括以下步骤从所述植物纤维分离天然发生在所述植物纤维中 的除多糖或木质素以外的一种生物大分子；并且表征编码在所述生物大分子的单体的序列 中的信息。如在此所使用，一种“成熟的植物纤维”是一种已经完成它的发育周期的纤维并且 被认为是一种无活力的细胞的残余物。具体而言，一种成熟的植物纤维是将其从产生该植 物纤维的纤维作物收获之后的一种植物纤维。对于棉花例如，一种成熟的纤维将会被认为 是当它们在收获时采摘的棉球中存在的纤维。将会清楚的是一种成熟的植物纤维包括所有 的经纤维工业加工的植物纤维。如在此使用的一种“加工的植物纤维”是一种当从植物作物收获时的成熟的植物 纤维，其已经经历了另外的机械、热和/或化学处理，包括上蜡、染色(dying)、梳理、纺纱、 织造、上浆、丝光处理等(参见背景部分)。如在此使用的“植物纤维“是一种植物源的长窄的尖端细的细胞，其在成熟时是无 活力的和中空的、具有大部份由纤维素和木质素组成的硬的厚的细胞壁。如在此所使用的“种子纤维”是由种子表面生长的纤维，如棉花。如在此使用的 “棉花”包括陆地棉或海岛棉，包括“棉花祖先植物”如亚洲棉(Gossypiumarboretum)、草棉 (Gossypium herbaceum)以及雷蒙德氏棉(Gossypiumraimondii)以及长萼棉(Gossypium longicalyx)。一种“天然发生在一种植物纤维细胞中的生物大分子“是一种不是外源性地添加 至所述植物纤维的生物大分子(例如将一种分子如一种外来的DNA分子、肽、或蛋白质通过 孵育或注射以便标记该植物纤维)，并且包括所有的大分子，即具有一种信息内容的聚合性 质的分子。该信息内容将通常被编码在构造单元或单体的序列中。生物大分子的实例是一 种多肽、蛋白质、核酸(如DNA或RNA)，它们是单链的或双链的。如在此使用的“表征一种生物大分子”表示解码该生物大分子的信息内容。这可以通过使该生物大分子经受一系列的分析来方便地进行，包括确定组成该大分子的单体的 序列，而且使该生物大分子经受一种或多种特异的检测分析。如在此使用的“检测分析”是靶向于发现在一种生物大分子中的单体的特异序列
的一种方法或方案。这可以包括基于多聚酶链反应的扩增的检测分析、抗体检测或核酸杂 、-父。已经证明了具体的提取方法(虽然对提取的生物大分子的质量具有影响)对于能 够从植物纤维提取这样的生物大分子的能力不是关键的。尽管如此，已经乎意料地发现从成熟的和/或加工的植物纤维分离的该生物大分 子(尤其是它的核酸部分)的质量和/或数量可以是很好地通过若干措施来实现。例如可以有利的是使该有待分析的植物纤维留在一种含有洗涤剂以及可能其他 的组分的裂解缓冲液中持续一个延长的时间。具体而言，已经发现在一种裂解缓冲液中孵 育成熟的和/或加工的植物纤维持续一个至少30分钟(但是更优选持续一个至少4小时 长达120小时)的时期将提高回收的生物大分子尤其是其核酸部分的得率。还已经确定的是，在生物大分子的分离之前从植物纤维如收获的和/或碾轧的棉 纤维仔细地去除杂质(包括叶残余物、树脂以及其他的废料)大大地改善了该分离的核酸 的质量，尤其是改善了关于该分离的核酸的进一步分析和可加工性。可以有利地使用本发明的方法以便鉴定从含有转化事件或转化事件的组合的植 物得到的棉纤维，在美国，这可能是对美国农业部(USDA)的动植物卫生监督局(APHIS)的 非规管状态(non-regulated status)的请求的主题，(无论这样的请求是否批准或者仍然 待决定)，包括以下事件
权利要求
1.一种用于表征成熟的植物纤维或加工的植物纤维的方法，该方法包括以下步骤a.从所述植物纤维分离天然发生在所述植物纤维中的除多糖或木质素以外的一种生 物大分子；以及b.表征编码在所述生物大分子的单体的序列中的信息。
2.一种用于鉴定成熟的植物纤维或加工的植物纤维的方法，该方法包括以下步骤a.从所述植物纤维分离天然发生在所述植物纤维中除多糖或木质素以外的一种生物 大分子；以及使所述生物大分子经受对所述植物纤维特异的一种检测分析。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述植物纤维是一种种子纤维。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述植物纤维是一种棉纤维。
5.如权利要求2至4的任一项所述的方法，其中所述生物大分子是选自下组，其组成 为多肽、蛋白质、核酸、DNA、RNA、单链RNA、以及双链RNA。
6.如权利要求2至5的任一项所述的方法，其中所述检测分析是一种基于聚合酶链反 应的检测分析。
7.如权利要求2至5的任一项所述的方法，其中所述检测分析是一种基于抗体的检测 分析。
8.如权利要求2至5的任一项所述的方法，其中所述检测分析是一种基于核酸杂交的 检测分析。
9.如权利要求2至8的任一项所述的方法，其中所述检测分析检测存在于产生这些纤 维的植物的基因组中的嵌合基因的存在或缺乏。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述嵌合基因包括选自N-乙酰葡糖胺转移酶、草 胺膦乙酰转移酶、EPSPS、羟基苯丙酮酸双氧化酶、苏云金杆菌晶体蛋白的一种杀虫部分、聚 (ADP核糖)聚合酶、聚(ADP核糖)葡萄糖水解酶、蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶、葡聚糖酶、 纤维素合成酶、甲壳酶、扩张蛋白、胼胝质合成酶、激酶、烟酰胺酶、烟酰酸磷酸核糖基转移 酶、烟酸单核苷酸腺嘌呤转移酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶或烟酰胺磷酸核糖基转移 酶的一个编码区或部分或其反义部分。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述检测分析是一种事件特异性检测分析。
12.如权利要求2至8的任一项所述的方法，其中所述检测分析检测存在于产生这些纤 维的植物的基因组中的特异等位基因的存在或缺乏。
13.如权利要求2至12的任一项所述的方法，其中所述纤维存在于纱线、织物、组织或 成品服装中。
14.一种用于分析产生纤维的植物的基因组的方法，该方法包括以下步骤a.从所述植物的成熟的或加工的纤维分离核酸，所述核酸是天然发生在所述植物纤维 中的；以及b.使所述核酸经受一种基因组分析方案。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述核酸是选自下组，其组成为DNA、RNA、单链 RNA以及双链RNA。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述核酸是DNA。
17.如权利要求16所述的方法，其中在使所述核酸经受一种基因组分析方案之前使所述分离的DNA经受一个全基因组扩增步骤。
18.如权利要求14至17的任一项所述的方法，其中所述方法应用于成熟的纤维或旧的 纱线、织物或成品服装上。
19.一种用于从成熟的植物纤维或加工的植物纤维分离核酸的方法，该方法包括以下 步骤a.从收获的成熟的植物纤维去除叶和茎废料；并且b.在一种含有洗涤剂、蛋白酶以及盐类的裂解缓冲液中孵育所述植物纤维持续一个延 长的时间，优选4到100小时的一段时期；以及c.根据标准核酸分离方法加工所述裂解缓冲液并且分离所述DNA。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述核酸是DNA。
21.一种用于从机织的或针织的织物分离核酸的方法，该方法包括以下步骤a.解开所述织物的线；b.在一种含有洗涤剂、蛋白酶以及盐类的裂解缓冲液中孵育所述线持续一个延长的时 间、优选4到100小时的一段时期；以及c.根据标准核酸分离方法加工所述裂解缓冲液并且分离所述核酸。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述核酸是DNA。
23.根据权利要求1至18的任一项所述一种方法在证明贸易的植物纤维的个性特征的 一个过程中的用途。
24.一种用于确定在成熟的或加工的植物纤维的一种混合物中不同植物纤维的相对量 的方法，该方法包括以下步骤a.从所述植物纤维的混合物分离天然发生在所述植物纤维中的除多糖或木质素以外 的一种生物大分子；b.使所述生物大分子经受对所述植物纤维的每一种特异的检测分析；以及c.确定这些纤维各自的相对含量。
25.—种证明贸易的棉纤维的个性特征的方法，所述方法包括a.通过注册的栽培者记载被鉴定的棉花种子的购买，所述棉花种子包括特异的基因组 构成并且产生一个特殊牌子的棉纤维；b.从所述被鉴定的棉花种子登记由所述注册的栽培者生产的粗棉纤维包作为所述特 殊牌子的棉纤维；c.通过与所述种子购买记载交互核对证实所述包；d.优选主要地向磨机提供所述注册的包以便从所述牌子的棉纤维特别专有地从所述 牌子的棉纤维生产纱线、织物或服装；e.使用根据权利要求1至18的任一项所述的方法在一个或多个步骤中审核所述牌子 的棉纤维的个性特征。
全文摘要
提供了用于分离生物大分子的方法，这些生物大分子包括来自成熟的植物纤维(如棉纤维)以及来自纺织品的肽、蛋白质、以及核酸。该生物大分子可用于表征该植物纤维(生产植物的来源、起源、基因组构成等等)。
文档编号C12Q1/68GK102112629SQ200980130323
公开日2011年6月29日 申请日期2009年8月6日 优先权日2008年8月8日
发明者A·阿廖利, S·恩格勒恩 申请人:拜尔生物科学公司