神经损伤治疗用移植材料的制造方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种利用牙髓干细胞而制造神经损伤治疗用移植材料的方法等。
【背景技术】
[0002] 脊髓是末梢组织与脑之间传导运动、知觉信息的通路，如果受到损伤，则会导致运 动麻痹或知觉障碍等严重的肢体障碍。不仅是有效的治疗方法，就连部分功能重建都非常 困难。近年来，其研究在世界上积极开展着，但至今仍未研发出治疗的根本方法。
[0003] 我国（日本）约有10万人脊髓损伤患者，每年新增的损伤患者达5000人左右。集 中在20岁前后和60岁前后，主要是壮年层为中心，在驾车或运动中因事故而受到损伤、或 老年人因受到轻微撞击而脊椎骨折等引起。一旦失去的身体功能难以恢复，患者从那以后 生活会受到很多限制。
[0004] 近年来，有研究指出移植人牙髓干细胞，显著恢复伴随大鼠脊髓损伤的运动障碍 (非专利文献1)，但是要求重复再现性更好、能够获得高恢复效果的神经损伤的治疗方法。
[0005] 现有技术文献
[0006] 非专利文献
[0007] 非专利文献 I :Sakai K.等人，J Clin Invest 122:80-90
【发明内容】
[0008] 技术问题
[0009] 本发明的目的在于提供对于因神经损伤而引起的功能障碍具有高恢复效果的移 植材料的、有效且重复再现性良好的制造方法。
[0010] 技术方案
[0011] 本发明的发明者们为了解决上述课题做了反复研究，其结果确认出如果在现有的 培养基中以较高浓度加入FGF2,培养牙髓干细胞，将培养物移植于脊髓损伤模型，则与现有 的方法比较，运动功能的恢复效果得到显著提高，进一步地，如果使用表现出特定的基因表 达模式的牙髓干细胞，则能够获得再现性良好的恢复效果，由此完成了本发明。
[0012] BP，本发明涉及以下[1]~[27]。
[0013] [1] -种神经损伤治疗用移植材料的制造方法，该方法包括步骤：在实质不含碱 性成纤维细胞生长因子（FGF2)以外的生长因子的培养基中，培养牙髓干细胞。
[0014] [2]如上述[1]所述的方法，所述实质不含碱性成纤维细胞生长因子（FGF2)以外 的生长因子的培养基，是在含有血清的基本培养基中，作为生长因子只添加碱性成纤维细 胞生长因子（FGF2)的培养基。
[0015] [3]如上述[2]所述的方法，所述培养基中的血清浓度小于15重量％。
[0016] [4]如上述[1]所述的方法，所述实质不含碱性成纤维细胞生长因子（FGF2)以外 的生长因子的培养基，是在作为培养间充质干细胞的培养基而市售的培养基中，作为生长 因子仅添加碱性成纤维细胞生长因子（FGF2)的培养基。
[0017] [5]如上述[1]至[4]中任意一项所述的方法，所述培养基中的FGF2浓度为5ng/ ml以上。
[0018] [6]如上述[5]所述的方法，所述培养基中的FGF2浓度为7ng/ml以上。
[0019] [7]如上述[1]至[6]中任意一项所述的方法，作为所述牙髓干细胞而使用以下细 胞：与牙髓干细胞的基因的表达量的平均比较，表1的基因群中10%以上的种类的基因表 达量高5倍以上的牙髓干细胞。
[0020] [8]如上述[1]至[7]中任意一项所述的方法，作为所述牙髓干细胞而使用以下 细胞：与牙髓干细胞的基因的表达量的平均比较，从由MY01G、RBMY2FP、FILIP1、Clorf64、 TNFRSF8、C2orf48、AGTRl、Dydc2、Znf708、Dct、Slcl5al、Zhddc22、Adam20、Gnaol、Csn2、 Semg2、Dnahl、Ctagla、Lrrcl9、Lipg以及Cbln2构成的群中选择的至少一种基因的表达量 高5倍以上的牙髓干细胞。
[0021] [9]如上述[1]至[8]中任意一项所述的方法，作为所述牙髓干细胞而使用以下细 胞：与牙髓干细胞的基因的表达量的平均比较，表2的基因群中10%以上的种类的基因表 达量低5倍以上的牙髓干细胞。
[0022] [10]如上述[1]至[9]中任意一项所述的方法，作为所述牙髓干细胞而使用以下 细胞：与牙髓干细胞的基因的表达量的平均比较，从由Gafa3、Lmfl、Faml3a、Gknl、Gprll2、 Sultlc4、Slc35f4、Gsttl、Gpr27、Pdia2、RIIADl、GSTTl、SLC2A2 以及 HTATSF1P2 构成的群 中选择的至少一种基因的表达量低5倍以上的牙髓干细胞。
[0023] [11]如上述[1]至[6]中任意一项所述的方法，作为所述牙髓干细胞，从两种以上 的牙髓干细胞的细胞群中选择使用以下细胞群：表1的基因群中10%以上的种类的基因表 达量与其他细胞群比较高5倍以上的牙髓干细胞的细胞群。
[0024] [12]如上述[1]至[6]、以及[11]中任意一项所述的方法，作为所述牙髓干细胞， 从两种以上的牙髓干细胞的细胞群中选择使用以下细胞：从由MY01G、RBMY2FP、FILIP1、 Clorf64、TNFRSF8、C2orf48、AGTRl、Dydc2、Znf708、Dct、SIc15al、Zhddc22、Adam20、Gnao1、 Csn2、Semg2、Dnahl、Ctagla、Lrrcl9、Lipg以及Cbln2构成的群中选择的至少一种基因的 表达量，与其他细胞群比较高5倍以上的牙髓干细胞。
[0025] [13]如上述[1]至[6]以及[11]至[12]中任意一项所述的方法，作为所述牙髓 干细胞，从两种以上的牙髓干细胞的细胞群中选择使用以下细胞：表2的基因群中10%以 上的种类的基因表达量与其他细胞群比较低5倍以上的牙髓干细胞。
[0026] [14]如上述[1]至[6]以及[11]至[13]中任意一项所述的方法，作为所述牙 髓干细胞，从两种以上的牙髓干细胞的细胞群中选择使用以下细胞：从由Gafa3、LmfU Faml3a、Gknl、Gprll2、Sultlc4、Slc35f4、Gsttl、Gpr27、Pdia2、RIIADl、GSTTl、SLC2A2 以 及HTATSF1P2构成的群中选择的至少一种基因的表达量，与其他细胞群比较低5倍以上的 牙髓干细胞。
[0027] [15]如上述[1]至[14]中任意一项所述的方法，所述神经损伤包括：脊髓损伤、 脑梗塞、脑内出血、蛛网膜下腔出血、脊髓出血、椎间盘突出症导致的神经压迫损伤、坐骨神 经痛、或糖尿病引起的末梢神经损伤。
[0028] [16] -种神经损伤治疗用移植材料，包括：牙髓干细胞以及实质不含碱性成纤维 细胞生长因子（FGF2)以外的生长因子的培养基。
[0029] [17]如上述[16]所述的神经损伤治疗用移植材料，所述实质不含碱性成纤维细 胞生长因子（FGF2)以外的生长因子的培养基，是在含有血清的基本培养基中，作为生长因 子只添加碱性成纤维细胞生长因子（FGF2)的培养基。
[0030] [18]如上述[17]所述的治疗用移植材料，所述实质不含碱性成纤维细胞生长因 子（FGF2)以外的生长因子的培养基，是在作为培养间充质干细胞的培养基而市售的培养 基中，作为生长因子仅添加碱性成纤维细胞生长因子（FGF2)的培养基。
[0031] [19]如上述[16]至[18]中任意一项所述的治疗用移植材料，所述牙髓干细胞是 与牙髓干细胞的基因的表达量的平均比较，表1的基因群中10%以上的种类的基因表达量 高5倍以上的牙髓干细胞。
[0032] [20]如上述[16]至[19]中任意一项所述的治疗用移植材料，所述牙髓干细胞 使用以下细胞：与牙髓干细胞的基因的表达量的平均比较，从由MY01G、RBMY2FP、FILIP1、 Clorf64、TNFRSF8、C2orf48、AGTRl、Dydc2、Znf708、Dct、SIc15al、Zhddc22、Adam20、Gnao1、 Csn2、Semg2、Dnahl、Ctagla、Lrrcl9、Lipg以及Cbln2构成的群中选择的至少一种基因的 表达量高5倍以上的牙髓干细胞。
[0033] [21]如上述[16]至[20]中任意一项所述的治疗用移植材料，所述牙髓干细胞使 用以下细胞：与牙髓干细胞的基因的表达量的平均比较，表2的基因群中10%以上的种类 的基因表达量低5倍以上的牙髓干细胞。
[0034] [22]如上述[16]至[21]中任意一项所述的治疗用移植材料，所述牙髓干细胞使 用以下细胞：与牙髓干细胞的基因的表达量的平均比较，从由Gafa3、Lmfl、Faml3a、GknU Gprll2、Sultlc4、Slc35f4、Gsttl、Gpr27、Pdia2、RIIADl、GSTTl、SLC2A2 以及 HTATSF1P2 构 成的群中选择的至少一种基因的表达量低5倍以上的牙髓干细胞。
[0035] [23]如上述[16]至[22]中任意一项所述的治疗用移植材料，所述神经损伤包括： 脊髓损伤、脑梗塞、脑内出血、蛛网膜下腔出血、脊髓出血、椎间盘突出症导致的神经压迫损 伤、坐骨神经痛、或糖尿病引起的末梢神经损伤。
[0036] [24] -种神经损伤的治疗方法，包括工序：将根据上述[1]至[15]中任意一项所 述的方法制造的神经损伤治疗用移植材料、或上述[16]至[23]中任意一项所述的治疗用 移植材料，移植于神经损伤部位。
[0037] [25]如上述[24]所述的方法，所述神经损伤包括：脊髓损伤、脑梗塞、脑内出血、 蛛网膜下腔出血、脊髓出血、椎间盘突出症导致的神经压迫损伤、坐骨神经痛、或糖尿病引 起的末梢神经损伤。
[0038] [26] -种用于制造神经损伤治疗用移植材料的试剂盒，包括：培养基和FGF2。
[0039] [27] -种方法，从牙髓干细胞的多个细胞群中选择神经损伤治疗用移植材料的材 料，该方法选择具有以下（i)至（iv)中的至少一种特性的牙髓干细胞：
[0040] ⑴表1的基因群中10%以上的种类的基因表达量，比其他细胞群，高5倍以上；
[0041] (ii)从由 MY01G、RBMY2FP、FILIP1、Clorf64、TNFRSF8、C2orf48、AGTR1、Dydc2、 Znf708、Dct、Slcl5al、Zhddc22、Adam20、Gnaol、Csn2、Semg2、Dnahl、Ctagla、Lrrcl9、Lipg 以及Cbln2构成的群中选择的至少一种基因的表达量，比其他细胞群，高5倍以上；
[0042] (iii)表2的基因群中10%以上的种类的基因表达量，比其他细胞群，低5倍以 上；
[0043] (iv)从由 Gafa3、Lmfl、Faml3a、Gknl、Gprll2、Sultlc4、Slc35f4、Gsttl、Gpr27、 Pdia2、RIIAD1、GSTT1、SLC2A2以及HTATSF1P2构成的群中选择的至少一种基因的表达量， 比其他细胞群，低5倍以上。
[0044] 有益效果
[0045] 本发明所涉及的神经损伤治疗用移植材料，能够通过以下简便的方法而得到：在 培养牙髓干细胞时，在培养基中加入FGF2。通过移植该移植材料，能够获得高运动功能的恢 复效果。
[0046] 牙髓干细胞是能够从年幼、年轻的人大量获得的废弃物，还可以长期冷冻保存，因 此容易获得，如果使用来源于患者自己的牙髓干细胞，则还不容易发生移植时的免疫排斥 问题。并且，因为是组织干细胞，所以增殖会受限制，与多功能干细胞比较，认为癌变问题也 较少。
【附图说明】
[0047] 图1示出将实质不含FGF2以外的生长因子的培养基中培养的移植材料（DP31F)、 根据现有方法的移植材料（DP310)以及对照移植材料（control :对照）移植于大鼠脊髓全 切模型，根据BBB评分检测运动功能的恢复的结果。
[0048] 图2示出将实质不含FGF2的培养基中培养的移植材料（DP31S)、实质不含FGF2以 外的生长因子的培养基中培养的移植材料（DP31F)以及对照移植材料（对照）移植于大鼠 脊髓全切模型，根据BBB评分检测运动功能的恢复的结果。
[0049] 图3示出将实质不含FGF2以外的生长因子的培养基中培养的移植材料（DP31F、 DP74F、DP264F)移植于大鼠脊髓全切模型，根据BBB评分检测运动功能的恢复的结果。
【具体实施方式】
[0050] [神经损伤治疗用移植材料的制造方法]
[0051] 本发明所涉及的用于治疗神经损伤的移植材料的制造方法的一种方式，包括工 序：在实质不含有FGF2以外的生长因子的培养基中，培养牙髓干细胞。
[0052]