培养容器、淋巴细胞的培养方法、培养容器的制造方法和固相化装置的制造方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及细胞的培养技术，特别涉及用于培养淋巴细胞的培养容器、和淋巴细胞的培养方法、固相化有蛋白质的培养容器的制造方法和固相化装置。
【背景技术】
[0002]近年来，在医药品的生产、基因治疗、再生医疗、免疫疗法等领域中，要求在人工环境下高效地大量培养细胞和组织、微生物等。
[0003]这样的状况下，在包含透气性膜的培养袋中封入细胞和培养液，在封闭系统中大量培养细胞。
[0004]但是，为了使淋巴细胞增殖，最初需要使淋巴细胞活化。因此，在固相化有抗CD3抗体的基材上使淋巴细胞活化，之后将活化的淋巴细胞封入培养袋进行增殖。
[0005]此时，一般如图8所示，为了使淋巴细胞活化而使用在底面固相化有抗CD3抗体的烧瓶，在淋巴细胞被活化后，转移至培养袋中，进行淋巴细胞的培养。这样操作的理由是，由于淋巴细胞具有如下的性质:为了进行增殖，需要抗CD3抗体所致的刺激，另一方面，若持续受到抗CD3抗体所致的刺激，则会变得难以进行增殖。因此，在淋巴细胞活化后，需要在没有固相化有抗CD3抗体的容器中进行培养。
[0006]作为用于使淋巴细胞活化的培养容器，例如可举出专利文献I所述的封闭系统细胞培养容器等。该封闭系统细胞培养容器在容器内的整个面上固相化有抗CD3抗体(0048段、0057段)，能够高效地使淋巴细胞活化。
[0007]另外，如上所述，淋巴细胞的活化一般使用抗CD3抗体来进行。即，在固相化有抗CD3抗体的容器内进行淋巴细胞的活化，然后将活化了的淋巴细胞封入未固相化有抗CD3抗体的培养袋内进行淋巴细胞的增殖。
[0008]因此，在活化淋巴细胞之前，在用于活化淋巴细胞的容器内需要固相化(涂布)抗CD3抗体。
[0009]作为现有的固相化的方法，一般地说为:在含有抗CD3抗体的溶液中浸渍烧瓶内的底面并将其静置后，除去该溶液，由此进行抗CD3抗体的固相化。
[0010]具体地，例如专利文献2中记载了:在烧瓶内的底面均匀地浸渍抗CD3抗体，在冰箱中保存过夜后，去除抗CD3抗体，制备抗体固相化烧瓶(0035?0036段、图1)。
[0011]另外，专利文献I中记载了:将溶解有抗CD3抗体的溶解液封入容器的收容部，静置规定时间，由此将抗CD3抗体固相化到容器的膜表面(0015段、图1)。
[0012]专利文献1:日本特开2007-175028号公报
[0013]专利文献2:日本专利第4399710号公报
【发明内容】
[0014]发明要解决的课题
[0015]然而，在仅使用专利文献I中记载的封闭系统细胞培养容器进行淋巴细胞培养的情况下，在淋巴细胞活化后也会持续受到抗CD3抗体所致的刺激，因此淋巴细胞受到过量刺激而使增殖受到抑制。因此，为了大量高效地培养淋巴细胞，期望使用该封闭系统细胞培养容器作为活化专用容器，在另外的培养容器中进行细胞的增殖。
[0016]因此，该现有技术在要大量高效地培养淋巴细胞的情况下，存在转移活化了的细胞的繁杂性、产生污染风险的问题。
[0017]因此，本发明人等经过广泛深入的研究开发了一种用于培养淋巴细胞的培养容器，其包含透气性膜，仅在相对的容器内表面的一个面固相化有抗CD3抗体，，具有固相化面和非固相化面。而且，以使固相化面成为底面的方式配置培养容器进行淋巴细胞的活化，然后以使非固相化面成为底面的方式配置培养容器进行淋巴细胞的增殖，由此能够成功地在单一的容器内高效地进行淋巴细胞的活化和增殖。
[0018]S卩，本发明的目的在于提供能够通过单一的培养容器高效地进行淋巴细胞的活化和增殖的培养容器、和淋巴细胞的培养方法。
[0019]另外，专利文献1、2中记载的现有固相化方法中存在如下的问题:为了使抗体充分地固相化而需要很长的静置时间。
[0020]进一步，现有方法中存在如下的问题:由于大部分抗体未吸附到容器内而残留在溶液中，因此必须使用量大于固相化量的抗体。例如如后所述存在如下的问题:在将通过现有方法封入有抗体的容器静置I小时的情况下，吸附到容器内的抗体为10%左右，其余约90%未固相化于容器而被废弃。
[0021 ]在此，抗体等蛋白质不耐热，若在高温条件下使其进行吸附，则其功能丧失，因此是不易固相化于容器的材料。另一方面，期望使用少量蛋白质在短时间内实现必要量的固相化。另外，抗体一般而言是高价的，因此期望降低无端废弃的量。
[0022]因此，本发明人等经过广泛深入的研究发现，通过将蛋白质溶液的液滴与气体一起封入到容器内、并使该液滴在容器内表面上移动，由此可将集中在液滴的气液界面的蛋白质分子高效地吸附于容器，从而完成了本发明。
[0023]S卩，本发明的目的在于提供一种培养容器的制造方法，在要将蛋白质固相化于容器内表面时，将蛋白质溶液的液滴与气体一起封入到容器内、并使该液滴在容器内表面上移动，由此将蛋白质高效地固相化于容器。本发明的目的还在于提供用于进行上述方法的固相化装置。
[0024]解决课题的方法
[0025]为了达成上述目的，本发明的培养容器为用于培养淋巴细胞的培养容器，包含透气性膜，仅在相对的容器内表面的一个面固相化有抗体，具有固相化面和非固相化面，上述固相化面中，以10?300ng/cm2的浓度固相化有抗⑶3抗体。
[0026]另外，本发明的淋巴细胞的培养方法为使用了上述培养容器的淋巴细胞的培养方法，是具有如下工序的方法:活化工序，在上述培养容器中封入淋巴细胞和培养液，以使上述培养容器中的上述固相化面成为底面的方式配置上述培养容器，使淋巴细胞活化;和增殖工序，将上述培养容器反转，以使上述培养容器中的上述非固相化面成为底面的方式配置上述培养容器，使淋巴细胞扩增。
[0027]另外，本发明的培养容器的制造方法为固相化有蛋白质的培养容器的制造方法，是如下的方法:在上述培养容器中注入溶解有上述蛋白质的液滴，使上述液滴移动到上述培养容器的内表面上的一部分或全部。
[0028]另外，本发明的固相化装置为将蛋白质固相化于培养容器的内表面的固相化装置，其构成在于具备:装载台，载置溶解有蛋白质的液滴和培养容器；以及驱动单元，移动装载台，使培养容器内的液滴在培养容器的内表面上移动。
[0029]发明效果
[0030]根据本发明，能够仅通过单一的培养容器在不使用专用的培养装置等的情况下高效地进行淋巴细胞的活化和增殖。因此，能够排除更换的繁杂性、并排除污染的风险，所述更换是用于防止抗体所致的对淋巴细胞的过量刺激的操作。另外，根据本发明，能够提供将蛋白质高效地固相化于容器的培养容器的制造方法、和用于进行该方法的固相化装置。
【附图说明】
[0031]图1为示出本发明的实施方式所涉及的培养容器的图。
[0032]图2为示出将本发明的实施方式所涉及的培养容器在使容器内表面贴合的状态下保存时的抗体的移动结果的图表的图。
[0033]图3A为示出本发明的实施方式所涉及的培养容器的保存形态的图。
[0034]图3B为示出本发明的实施方式所涉及的培养容器的保存形态的图。
[0035]图4为示出本发明的第一实施方式所涉及的淋巴细胞的培养方法的图。
[0036]图5为示出本发明的第二实施方式所涉及的淋巴细胞的培养方法的图。
[0037]图6为示出本发明的实施方式所涉及的培养容器、和淋巴细胞的培养方法的实施例和比较例的示意图。
[0038]图7为示出本发明的实施方式所涉及的培养容器、和淋巴细胞的培养方法的实施例和比较例的实验结果的图表的图。
[0039]图8为示出现有的淋巴细胞的培养方法的图。
[0040]图9为用于说明本发明的实施方式所涉及的培养容器的制造方法中的固相化的原理的图。
[0041]图10为示出通过本发明的实施方式所涉及的培养容器的制造方法而得到的抗体固相化培养袋的图。
[0042]图11为示出本发明的实施方式所涉及的固相化装置的图(俯视图)。
[0043]图12为示出本发明的实施方式所涉及的固相化装置的图(主视图)。
[0044]图13为示出利用本发明的实施方式所涉及的固相化装置的固相化的样子的图。
[0045]图14为示出本发明的实施方式所涉及的固相化装置中的保持单元的图(主视图和侧视图)。
[0046]图15为示出本发明的实施方式所涉及的固相化装置中的保持单元的使用形态的图。
[0047]图16为示出本发明的实施方式所涉及的培养容器(抗体固相化培养袋)的制造方法的实施例和比较例的示意图。
[0048]图17为示出本发明的实施方式所涉及的培养容器(抗体固相化培养袋)的制造方法的实施例和比较例的实验结果的图表的图。
[0049]图18为示出本发明的实施方式所涉及的培养容器(抗体固相化烧瓶)的制造方法的实施例和比较例的示意图。
[0050]图19为示出本发明的实施方式所涉及的培养容器(抗体固相化烧瓶)的制造方法的实施例和比较例的实验结果的图表的图。
[0051]图20为示出本发明的实施方式所涉及的培养容器(纤连蛋白固相化培养袋)的制造方法的实施例和比较例的示意图。
[0052]图21为示出本发明的实施方式所涉及的培养容器(纤连蛋白固相化培养袋)的制造方法的实施例和比较例的实验结果的图表的图。
【具体实施方式】
[0053]以下对本发明的培养容器、和淋巴细胞的培养方法的实施方式详细地进行说明。首先，参照图1对本发明的培养容器的一个实施方式进行说明。该图中示出将培养容器载置于装载台(未图示)后从上方观察的简图、和从侧面观察的简图。
[0054][培养容器]
[0055]如图1所示，本发明的实施方式所涉及的培养容器10具有上下相对的容器壁。而且，容器内表面的一面成为固相化有抗体20的固相化面11(图1的容器内的底面)。另外，容器内表面的另一面成为未固相化有抗体20的非固相化面12(图1的容器内的顶面)。此外，培养容器10具备管13，由此进行淋巴细胞和培养液向培养容器10内的封入、和所培养的淋巴细胞和培养液的回收。该图的例中，培养容器1具有I根管13，但也可以具有2根以上。
[0056]关于培养容器10，使用具有细胞培养所需要的透气性的膜，并形成为袋状(口袋型)。作为这样的培养容器10的材料，可以适当地使用聚乙烯、聚丙烯等聚烯烃类树脂。
[0057]作为固相化于固相化面11的抗体20，优选使用抗CD3抗体。淋巴细胞可以被抗CD3抗体活化并进行增殖。
[0058]固相化面11中的抗体20的固相化浓度优选设为10?300ng/cm2，更优选设为10?40ng/cm2。
[0059]这是因为，若使抗体20的固相化浓度为lOng/cm2以上，则能够有效地使淋巴细胞活化，然后能够高效地使淋巴细胞增殖。另外是因为，即使使抗体20的固相化浓度大于40ng/cm2，在淋巴细胞的增殖效率方面也没有显著的差异，且过量使用抗体会导致容器成本的增大。
[0060]固相化面11中的抗⑶3抗体的最密填充浓度为300ng/cm2，若为该浓度范围之内，则能够充分地使淋巴细胞活化，然后高效地使淋巴细胞增殖。另一方面，若抗CD3抗体的固相化浓度超过300ng/cm2，则抗CD3抗体漂浮在培养容器10内的培养液中，有时对淋巴细胞造成过量的刺激，因此不优选。
[0061 ]本实施方式的培养容器10例如可以如下所示地进行制造。
[0062]首先，使用塑料挤出成形装置将低密度聚乙烯挤出成形，形成膜。然后，使用脉冲热封机由该膜制造袋状的培养容器10。如图1所示，培养容器10以装有管13的方式进行制造。
[0063]然后，将培养容器10载置于装载台，封入规定量的气体，并且接着封入溶解有抗体20的缓冲液。然后，通过摇动培养容器10等方式，使缓冲液的液滴在培养容器10内的底面上移动，使缓冲液中含有的抗体20附着到培养容器10内的底面上。由此，使抗体20仅附着于培养容器10内的底面，形成固相化面11。此时，培养容器10内的顶面以未附着有抗体20的非固相化面12的形式形成。
[0064]然后，对本实施方式的培养容器10的保存形态进行说明