。
[0065]本实施方式的培养容器10优选以使固相化面11与非固相化面12不接触的形态保持而保存。
[0066]即，在以使固相化面11与非固相化面12接触的形态下、以1.6kg的载荷、37°C的条件将培养容器10保持2小时的情况下，如图2所示，约2成的抗体20从固相化面11转移至非固相化面12。在淋巴细胞活化后进行增殖时，这样地移动到非固相化面12的抗体20对淋巴细胞造成过量刺激，从而成为使增殖率降低的主要原因。因此，优选尽可能抑制抗体20从固相化面11向非固相化面12的移动。
[0067]因此，在保存本实施方式的培养容器10时，优选在培养容器10中封入规定量的气体来保持使固相化面11与非固相化面12不接触的形态。
[0068]具体地，所封入的气体的量优选每Icm2的培养容器10内的底面积为0.01?4ml。若使所封入的气体的量为这样的范围，则能够防止固相化面11与非固相化面12接触。
[0069]作为所封入的气体，没有特别限定，但优选设为不活泼气体，可以使用空气、氮气等。例如可以利用气体供给装置经由管13将这样的气体注入到培养容器10。
[0070]作为本实施方式的培养容器10的具体保存形态，如图3A所示，优选利用具有刚性的外装容器60来保持培养容器10的形状。在使用这样的外装容器60来保存培养容器10时，仅将少量的气体封入到培养容器10中，就能够以不使抗体20转移的方式保存培养容器10。
[0071]另外，如图3B所示，也优选用气体使培养容器10成为膨胀状态并利用包装容器70进行保存。这样一来，可以简易地包装多个培养容器10，从而以使抗体20不转移的方式进行保存。
[0072]如以上所说明的，本实施方式的培养容器10由透气性膜构成，仅在相对的容器内表面的一个面固相化有抗体20，具有固相化面11和非固相化面12。另外，封入到培养容器10中的淋巴细胞聚集到容器内的底部。
[0073]因此，在活化淋巴细胞时，以使固相化面11成为底面的方式使用培养容器10，在淋巴细胞增殖时，以使非固相化面12成为底面的方式使用培养容器10，由此可以防止抗体20对淋巴细胞的过量刺激，可以在单一的容器内高效地进行淋巴细胞的活化和增殖。其结果是，能够排除繁杂的转移、污染的风险。另外，从活化到增殖的工序转变为反转容器的简单操作，因此可以在不使用专用装置等的情况下简便地进行。
[0074]另外，通过在本实施方式的培养容器10中封入规定量的气体来保持使固相化面11与非固相化面12不接触的形态，由此能够在不降低过量刺激淋巴细胞的防止效果的情况下保存培养容器10。
[0075]此外，现有的淋巴细胞的活化中使用的烧瓶中，仅在底面固相化有抗CD3抗体，由此能够使淋巴细胞活化。然而，烧瓶无法以单一容器用于淋巴细胞活化后的增殖工序。其理由在于，烧瓶存在无法使单位面积的细胞数维持在适当密度的问题。即，为了使淋巴细胞在活化后进行增殖，需要扩大培养面积。若为本实施方式，则例如通过用夹子或辊将培养容器的一部分间隔，并配合着细胞的增殖移动或除去夹子或辊等，由此能够将培养面积扩大，但是由于烧瓶中无法进行这样的操作，因此虽然烧瓶能够用于淋巴细胞的活化，但不适于增殖。
[0076][淋巴细胞的培养方法(第一实施方式)]
[0077]然后，参照图4对本发明的淋巴细胞的培养方法的第一实施方式进行说明。如该图所示，本实施方式的淋巴细胞的培养方法具有(I)活化工序、和(2)增殖工序。
[0078](I)活化工序
[0079]本实施方式的淋巴细胞的培养方法中的活化工序为如下的工序:在培养容器10中封入淋巴细胞30和培养液40，以使固相化面11成为底面的方式配置培养容器10，使淋巴细胞30活化。
[0080]如上所述，固相化面11中固相化有抗体20，作为该抗体20，适合使用抗⑶3抗体。
[0081]淋巴细胞30的种类没有特别限制，可以将NK细胞、B细胞、T细胞和单核细胞等作为培养对象。
[0082 ]培养液40可以使用淋巴细胞30的培养中一般使用的培养液，例如可以适合地使用添加了白介素-2的培养液等。
[0083]该活化工序中，对于培养容器10内的淋巴细胞30而言，其受体分子CD3被固相化在固相化面11上的抗CD3抗体刺激，从而被活化。
[0084](2)增殖工序
[0085]本实施方式的淋巴细胞的培养方法中的增殖工序为如下的工序:将培养容器10反转，以使非固相化面12成为底面的方式配置培养容器10，使淋巴细胞30扩增。
[0086]通过这样地以使非固相化面12成为底面的方式配置培养容器10，由此能够在培养容器10内的非固相化面12侧培养淋巴细胞30。
[0087]由此，能够在不受到来自于固相化在固相化面11上的抗CD3抗体的刺激的情况下使淋巴细胞30增殖。因此，能够防止淋巴细胞30受到来自抗CD3抗体的过量刺激时产生的增殖效率降低。
[0088][淋巴细胞的培养方法(第二实施方式)]
[0089]然后，参照图5对本发明的淋巴细胞的培养方法的第二实施方式进行说明。如该图所示，本实施方式的淋巴细胞的培养方法具有(I)活化工序、(2)第一增殖工序、(3)容积扩大工序和(4)第二增殖工序。
[0090]即，本实施方式的淋巴细胞的培养方法在增殖工序的过程中具有容积扩大工序，由此，与第一实施方式相比能够进一步提高淋巴细胞的增殖效率。因此，本实施方式中，将增殖工序细分为上述(2)?(4)的3个工序并进行说明。关于其他方面，可以与第一实施方式相同。
[0091](I)活化工序
[0092]本实施方式的淋巴细胞的培养方法中的活化工序中，首先使用间隔构件50将培养容器10隔开，由此将其区分为培养部10-1和能够扩大部10-2。
[0093]培养部10-1为封入淋巴细胞30和培养液40、并进行淋巴细胞30的活化的室。
[0094]能够扩大部10-2为未封入有淋巴细胞30和培养液40的室，作为用于伴随淋巴细胞30的增殖将培养部10-1扩大的空间使用。
[0095]淋巴细胞30和培养液40无法通过培养部10-1与能够扩大部10-2之间。
[0096]在此，细胞一般具有如下性质:在培养初期若不具有一定以上的细胞密度，则难以进行增殖。因此，优选以使培养部10-1的容积在培养初期小，然后增大的方式进行调整。
[0097]另外，图5中示出如下的工序:使用夹子作为间隔构件50隔开培养容器10，然后除去该夹子使培养容器10内的整体成为培养部10-1，但培养容器10的间隔方法并不限定于此。例如，也可以使用辊作为间隔构件50，来使培养部10-1能够连续地变更，也能够将培养部10-1多次变更为任意大小。
[0098]然后，在培养容器10中的培养部10-1中封入淋巴细胞30和培养液40，以使培养部10-1中的固相化面11成为底面的方式配置培养容器10，使淋巴细胞30活化。
[0099]该活化工序中，培养部10-1内的淋巴细胞30被固相化在固相化面11上的抗⑶3抗体活化。
[0100](2)第一增殖工序
[0101]然后，将培养容器10反转，以使非固相化面12成为底面的方式配置培养容器10，使淋巴细胞30扩增。
[0102]S卩，以使非固相化面12成为底面的方式配置培养容器10，由此能够在培养部10-1中的非固相化面12侧培养淋巴细胞30，从而能够在不受到来自固相化于固相化面11的抗CD3抗体的刺激的情况下使淋巴细胞30增殖。因此，能够在单一的容器内使淋巴细胞高效地增殖。
[0103](3)容积扩大工序
[0104]容积扩大工序为如下的工序:通过移动或除去间隔构件50，由此将培养部10-1的容积扩大。
[0105]由此，能够根据所增殖的淋巴细胞30的细胞数来调整培养部10-1的容积。因此，能够更进一步地提高淋巴细胞30的增殖效率。
[0106](4)第二增殖工序
[0107]第二增殖工序为如下的工序:在将培养容器10中的培养部10-1扩大的状态下连续进行淋巴细胞30的培养。此时，培养容器10为以使非固相化面12成为底面的方式配置的状
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[0108]由此，能够在不受到来自于固相化在固相化面11上的抗CD3抗体的刺激的情况下使淋巴细胞30增殖，并且能够防止由于培养部10-1内的淋巴细胞30的密度过高造成淋巴细胞30的增殖效率降低的情况。
[0109]此外，也能够使用多个夹子、辊作为间隔构件50并多次重复(3)和(4)，从而阶段性进行培养部10-1的容积扩大。
[0110]如以上所说明的，根据本发明的实施方式所涉及的淋巴细胞的培养方法，可以使用本发明的实施方式所涉及的培养容器10，以使固相化面11成为底面的方式配置来进行淋巴细胞30的活化，然后，以使非固相化面12成为底面的方式配置来进行淋巴细胞30的增殖。
[0111]因此，能够防止淋巴细胞30受到来自抗体20的过量刺激，能够在单一的容器内高效地进行淋巴细胞30的活化和增殖。
[0112]另外，能够根据所增殖的淋巴细胞30的细胞数来调整培养容器10中的培养部10-1的容积，能够更进一步地提高淋巴细胞30的增殖效率。
[0113]然后，对本发明的培养容器的制造方法、和固相化装置的一个实施方式详细地进行说明。
[0114][培养容器的制造方法]
[0115]本实施方式的培养容器的制造方法的特征在于，为固相化有蛋白质的培养容器的制造方法，在培养容器中注入溶解有所述蛋白质的液滴(drop)，使液滴移动到培养容器的内表面上的一部分或全部。
[0116]首先，参照图9对本实施方式的培养容器的制造方法中的、能够使蛋白质高效地固相化于培养容器的内表面的原理进行说明。
[0117]静置溶解有蛋白质的溶液时，蛋白质具有吸附于该溶液的气液界面的性质(BUNSEKI KAGAKU Vo 1.59，N0.6.PP.437-445 (2010))。因此，本实施方式的培养容器的制造方法中，使溶解有蛋白质的液滴在基材上移动，并使集中在气液界面的蛋白质分子积极地与基材接触。
[0118]这样地，在容器内滚动液滴，使气液界面在容器内移动，由此在气体、液体、材料的界线上，蛋白质吸附于基材。蛋白质吸附于基材时，液滴中的蛋白质吸附于新生的气液界面。而且，液滴在容器内表面上移动时，通过蛋白质浓度高的气液界面与容器内表面的接触，蛋白质以高概率吸附到容器内表面。
[0119]由此，根据本实施方式的培养容器的制造方法，能够使蛋白质高效地固相化于容器内表面。
[0120]另外，例如在使蛋白质仅固相化于容器底面的情况下，也能够防止蛋白质向容器顶面的吸附所致的蛋白质的损失。
[0121]本实施方式中，培养容器是指细胞培养中使用的整个容器，包括细胞活化和/或细胞增殖中使用的容器。
[0122]本实施方式中的培养容器的形态没有特别限制，可以适当地使用由软包装材料构成的袋状的培养袋、玻璃或聚苯乙烯制的烧瓶等。
[0123]例如，可以适当地使用在容器内表面具有相对的容器壁的培养袋，使蛋白质固相化于该培养袋的内表面的一面或两面中的一部分或全部，从而可以制造本实施方式中的培养容器。
[0124]具体地，如图10所示，可以使培养袋100中的相对的内表面的一个面为固相化有蛋白质200的固相化面110(图10的容器内底面)，使培养袋内表面的另一个面为未固相化有蛋白质200的非固相化面120(图10的容器内顶面)。
[0125]此外，培养袋100具备管130，经由该管130，可以向培养袋100内导入溶解有蛋白质的液滴和气体，或者将它们除去。该图的例中，培养袋100具有2根管130，但也可以具有I根或3根以上。
[0126]另外，培养袋100优选使用具有细胞培养所需要的透气性的膜来形成。作为这样的培养袋100的材料，可以适当地使用聚乙烯和聚丙烯等聚烯烃类树脂。
[0127]本实施方式中，作为固相化于培养袋100的蛋白质200，没有特别限制，例如可以使用抗CD3抗体等抗体、或者纤连蛋白、胶原、层粘连蛋白等细胞粘附性蛋白。抗CD3抗体适合用于使淋巴细胞活化。另外，细胞粘附性蛋白适合用于使粘附性细胞高效地粘附到培养基材上。
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