br>[0248]在漂浮培养用烧瓶800(Sumimoto Bakelite，聚苯乙稀制，底面积225cm2)中装入溶解有50口8的抗003抗体(1;[]^61171 B1tec株式会社制)的磷酸缓冲液(Japan LifeTechnologies株式会社制)10ml，使抗体溶液遍布整个底面，在26°C静置5分钟。由此，使抗体吸附于烧瓶的底面，制造抗体固相化烧瓶。比较例6的抗体固相化烧瓶的抗CD3抗体的浓度为 21.8ng/cm20
[0249]如图19所示，实施例5、比较例5和比较例6中，烧瓶的单位面积的抗体吸附效率分别为 13%、12%、10%。
[0250]S卩，如比较例5所示，现有的基于静置的抗体的固相化方法中，在固相化时间为60分钟的条件下，吸附效率为12%，与此相对，如实施例5所示，本实施方式的培养容器的制造方法中，能够在固相化时间为5分钟的条件下使吸附效率为13%。
[0251]因此可知，根据本实施方式的培养容器的制造方法，即使在将蛋白质固相化于烧瓶的情况下，也能够以比现有方法更短的时间将同等量的蛋白质固相化。
[0252][实验5:纤连蛋白固相化培养袋的制造]
[0253](实施例6)
[0254]与实施例3同样地制作IlcmX 22.5cm(约225cm2)的袋。
[0255]然后，在该袋中封入空气约600ml，并且接着以液滴的状态封入溶解有50yg来自于人血浆的纤连蛋白(日本西格玛奥德里奇合同会社制)的磷酸缓冲液(Japan LifeTechnologies 株式会社制)1ml。
[0256]然后，在26°C的条件下手动摇动袋I分钟，使磷酸缓冲液的液滴以1m/分钟的速度在袋内的底面上移动，使抗体吸附于袋内的底面，制造纤连蛋白固相化培养袋。
[0257]实施例6的培养容器中，仅在其内侧的一面(底面)固相化有纤连蛋白。关于实施例6的培养容器的固相化浓度的测定结果，纤连蛋白的吸附浓度为53.6ng/cm2。
[0258](比较例7)
[0259]与实施例3同样地制作IlcmX 22.5cm(约225cm2)的袋。
[0260]然后，在不在该袋中封入空气的情况下封入溶解有50yg来自于人血浆的纤连蛋白(日本西格玛奥德里奇合同会社制)的磷酸缓冲液(Japan Life Technologies株式会社制)10ml，使磷酸缓冲液的液滴与袋内的上下两面接触，在26°C静置60分钟。然后，用磷酸缓冲液40ml进行3次袋内的清洗，制造纤连蛋白固相化培养袋。
[0261]比较例7的培养容器在其内侧的两面固相化有纤连蛋白。关于比较例7的培养容器的固相化浓度的测定结果，纤连蛋白的吸附浓度为30.7ng/cm2。
[0262]如图21所示，实施例6和比较例7中，培养容器的单位面积的抗体吸附效率分别为24%、14%。
[0263]S卩，使用纤连蛋白作为蛋白质的情况下，根据本实施方式的培养容器的制造方法，能够以比现有方法高70%以上的吸附效率将纤连蛋白固相化于培养容器。
[0264]因此可知，根据本实施方式的培养容器的制造方法，即使是抗体以外的蛋白质，也能够在短时间内将其高效地固相化于培养容器。
[0265][实验6:使用了固相化装置的抗体固相化培养袋的制造]
[0266](实施例7)
[0267]与实施例3同样地制作8cmX 20cm(约160cm2)的袋。
[0268]然后，将该袋载置于固相化装置中的保持构件，使用挤压部，以使底面为半圆筒状的方式进行固定。然后，封入空气约280ml，并且接着以液滴的状态封入溶解有1yg抗CD3抗体(Miltenyi B1tec株式会社制)的磷酸缓冲液(Japan Life Technologies株式会社制)
2mlo
[0269]然后，如图13所示，将固相化装置中的装载台在Y轴方向上倾斜-50°(以X轴方向为中心轴进行旋转移动)，使液滴达到培养袋内的端部，然后在X轴方向上以-10°?10°的范围旋转装载台(以Y轴方向为中心轴进行旋转移动)，使液滴在X轴方向上移动，使其从培养袋内的左端至右端左右地往复移动。
[0270]然后，在Y轴方向上使装载台旋转10°，使液滴稍微向背面侧移动，然后再次在X轴方向上在-10°?10°的范围旋转装载台，使液滴在X轴方向上移动，使其从培养袋内的左端至右端左右地往复移动。
[0271]重复以上的动作直至Y轴方向的旋转角(X轴旋转角)达到50°，使液滴在培养袋的整个底面移动。将其作为I个循环，进行4个循环(固相化时间为3.5分钟，温度26°C)，测定固相化量。
[0272]实施例7的培养容器中，仅在其内侧的一面(底面)固相化有抗CD3抗体。关于实施例7的培养容器的固相化浓度的测定结果是，抗CD3抗体的吸附浓度为30.lng/cm2。
[0273]因此，实施例7的培养容器中，单位面积的抗体吸附效率(吸附浓度X16 O c m2 /1000ngX 100)为48%。这与比较例3的培养容器的该吸附效率12%相比，达至1」4倍。
[0274]可见，通过使用本实施方式的固相化装置来制造培养容器，由此能够在短时间内得到显示出以往无法实现水平的高吸附效率的培养容器。
[0275]本发明并不限定于以上的实施方式或实施例，自然可以在本发明的范围内实施各种变更。
[0276]例如，能够将培养容器的大小、淋巴细胞的种类、培养基和蛋白质的种类等适当变更为与实施例不同的情况。
[0277]产业上可利用性
[0278]本发明能够适当地用于通过使用单一的培养容器，来在排除活化后细胞的更换的繁杂性、污染风险的同时，大量培养淋巴细胞的情况。另外，本发明能够适当地用于在短时间内高效地制造在内表面固相化有蛋白质的培养容器。
[0279]符号说明
[0280]10 培养容器
[0281]11 固相化面
[0282]12 非固相化面
[0283]13管
[0284]20抗体
[0285]30淋巴细胞
[0286]40培养液
[0287]50间隔构件
[0288]60外装容器
[0289]70包装容器
[0290]100培养袋
[0291]HO固相化面
[0292]120非固相化面
[0293]130管
[0294]200蛋白质
[0295]300固相化装置
[0296]310X轴方向移动用支承台
[0297]320支承柱
[0298]330X轴方向移动用伺服电动机
[0299]340X轴方向移动用齿轮箱
[0300]350Y轴原点限度检测传感器
[0301]360Y轴方向移动用支承台
[0302]370Y轴方向移动用伺服电动机
[0303]380Y轴方向移动用齿轮箱
[0304]390X轴原点限度检测传感器
[0305]400基台
[0306]500保持构件
[0307]510主体部
[0308]510-1凹部
[0309]520上盖部
[0310]530挤压部
【主权项】
1.一种培养容器，其特征在于， 其为用于培养淋巴细胞的培养容器， 包含透气性膜， 仅在相对的容器内表面的一个面固相化有抗体，具有固相化面和非固相化面， 所述固相化面中，以10?300ng/cm2的浓度固相化有抗CD3抗体。2.如权利要求1所述的培养容器，其特征在于， 以所述固相化面与所述非固相化面不接触的形态保持。3.如权利要求2所述的培养容器，其特征在于， 每Icm2的容器内底面积封入有0.01?4ml的气体。4.一种淋巴细胞的培养方法，其特征在于， 其为使用了权利要求1?3中任一项所述的培养容器的淋巴细胞的培养方法，具有: 活化工序，在所述培养容器中封入淋巴细胞和培养液，以使所述培养容器中的所述固相化面成为底面的方式配置所述培养容器，使淋巴细胞活化，和 增殖工序，将所述培养容器反转，以使所述培养容器中的所述非固相化面成为底面的方式配置所述培养容器，使淋巴细胞扩增。5.如权利要求4所述的淋巴细胞的培养方法，其特征在于， 所述活化工序中，通过用间隔构件隔开所述培养容器，由此在所述培养容器内形成培养部，在该培养部中封入淋巴细胞和培养液， 作为所述增殖工序，具有: 第一增殖工序，将所述培养容器反转，以使所述培养容器中的所述非固相化面成为底面的方式配置所述培养容器，使淋巴细胞扩增， 容积扩大工序，移动或除去所述间隔构件从而将所述培养部的容积扩大，和 第二增殖工序，将所述培养部的容积扩大后，使淋巴细胞扩增。6.一种培养容器的制造方法，其特征在于， 其为固相化有蛋白质的培养容器的制造方法， 在所述培养容器中注入溶解有所述蛋白质的液滴， 使所述液滴移动到所述培养容器的内表面上的一部分或全部。7.如权利要求6所述的培养容器的制造方法，其特征在于，具有: 在由软包装材料形成的所述培养容器中封入气体的工序， 在封入了气体的所述培养容器中注入溶解有所述蛋白质的液滴的工序，和 使所述液滴移动到所述培养容器的内表面上的一部分或全部的工序。8.如权利要求6或7所述的培养容器的制造方法，其特征在于， 使所述液滴进行移动的区域仅为所述培养容器的内表面中相对的容器壁中的一方。9.如权利要求6?8中任一项所述的培养容器的制造方法，其特征在于， 以每I cm2的所述培养容器内的底面积为0.1?4ml的范围将所述气体封入所述培养容器。10.如权利要求6?9中任一项所述的培养容器的制造方法，其特征在于， 所述蛋白质为抗体或细胞粘附性蛋白。11.如权利要求1O所述的培养容器的制造方法，其特征在于， 所述抗体为抗CD3抗体。12.如权利要求1O所述的培养容器的制造方法，其特征在于， 所述细胞粘附性蛋白选自纤连蛋白、胶原、层粘连蛋白。13.—种固相化装置，其特征在于， 其为将蛋白质固相化于培养容器的内表面的固相化装置，具备: 装载台，载置溶解有所述蛋白质的液滴和培养容器，和 驱动单元，移动所述装载台，使所述培养容器内的所述液滴在所述培养容器的内表面上移动。14.如权利要求13所述的固相化装置，其特征在于， 作为所述驱动单元，具备: 长边方向移动用驱动单元，使所述装载台以短边方向为中心轴旋转运动，使所述液滴在所述培养容器的内表面上沿长边方向移动，和 短边方向移动用驱动单元，使所述装载台以长边方向为中心轴旋转运动，使所述液滴在所述培养容器的内表面上沿短边方向移动。15.如权利要求13或14所述的固相化装置，其特征在于， 具备保持构件，所述保持构件用于以使所述培养容器的底面形成半圆筒形状的方式保持所述培养容器，所述保持构件具有半圆筒形状的凹部， 所述保持构件被固定于所述装载台，或者与所述装载台一体地形成。16.如权利要求15所述的固相化装置，其特征在于， 所述保持构件以使所述保持构件的半圆筒形状的中心轴的方向与所述装载台的长边方向为相同方向的方式被固定于所述装载台，或者所述保持构件与所述装载台一体地形成。17.如权利要求15或16所述的固相化装置，其特征在于， 所述保持构件具备挤压部， 所述挤压部用于以使所述培养容器的底面形成半圆筒形状的方式挤压所述培养容器。
【专利摘要】一种培养容器，其特征在于，为用于培养淋巴细胞的培养容器，包含透气性膜，仅在相对的容器内表面的一个面固相化有抗体，具有固相化面和非固相化面，固相化面中，以10～300ng/cm2的浓度固相化有抗CD3抗体。在该培养容器中封入淋巴细胞和培养液，以使培养容器中的固相化面成为底面的方式配置培养容器，使淋巴细胞活化，然后将培养容器反转，以使培养容器中的非固相化面成为底面的方式配置培养容器，使淋巴细胞扩增。另外，这样的固相化有蛋白质的培养容器通过在培养容器中注入溶解有蛋白质的液滴，并使液滴移动到培养容器的内表面上的一部分或全部来制造。
【IPC分类】C12N5/078, C12M3/00
【公开号】CN105658784
【申请号】
【发明人】户谷贵彦, 田中乡史, 蓝原武志, 石崎庸一
【申请人】东洋制罐集团控股株式会社
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2014年12月16日