(Thermo Fisher Scientific株式会社制)测定剥离液中的抗体量，并用其除以固相化面积，由此算出吸附浓度。
[0184]实施例1的培养容器中，仅在其内侧的一面固相化有抗CD3抗体。
[0185]关于实施例1的培养容器的固相化浓度的测定结果是，固相化面中的抗CD3抗体的浓度为40ng/cm2o
[0186](实施例2)
[0187]与实施例1同样地制作IlcmX 22.5cm(约225cm2)的袋。
[0188]然后，在该袋中封入空气约600ml，并且接着封入溶解有5yg的抗CD3抗体(Miltenyi B1tec株式会社制)的磷酸缓冲液(Japan Life Technologies株式会社制)1ml。此外进行与实施例1同样的处理，制造实施例2的培养容器。
[0189]实施例2的培养容器中，仅在其内侧的一面固相化有抗CD3抗体。
[0190]关于实施例2的培养容器的固相化浓度的测定结果，固相化面中的抗CD3抗体的浓度为 llng/cm2。
[0191](比较例I)
[0192]与实施例1同样地制作IlcmX 22.5cm(约225cm2)的袋。[Ο193] 然后，在该袋中封入溶解有50yg的抗CD3抗体(Miltenyi B1tec株式会社制)的磷酸缓冲液(Japan Life Technologies株式会社制)1ml，使磷酸缓冲液的液滴与袋内的上下两面接触，在26 °C静置60分钟。然后，用磷酸缓冲液40ml进行3次袋内的清洗，制造比较例I的培养容器。
[0194]比较例I的培养容器在其内侧的两面固相化有抗⑶3抗体。
[0195]关于比较例I的培养容器的固相化浓度的测定结果，容器内表面的抗CD3抗体的浓度为 25ng/cm2。
[0196](比较例2)
[0197]与实施例1同样地制作IlcmX 22.5cm(约225cm2)的袋。
[0198]然后，在该袋中封入空气约600ml，并且接着封入溶解有5yg的抗CD3抗体(Miltenyi B1tec株式会社制)的磷酸缓冲液(Japan Life Technologies株式会社制)10ml。此时，以使磷酸缓冲液的液滴仅与袋内表面的一面(固相化面)接触的方式进行。
[0199]然后，在26°C的条件下手动摇动袋I分钟，使磷酸缓冲液的液滴以1m/分钟的速度在袋内的底面上移动，在袋内形成固相化面。进一步，用磷酸缓冲液1ml进行3次袋内的清洗，制造比较例2的培养容器。
[0200]比较例2的培养容器中，仅在其内侧的一面固相化有抗⑶3抗体。
[0201]关于比较例2的培养容器的固相化浓度的测定结果，固相化面中的抗CD3抗体的浓度为 8ng/cm2。
[0202][实验2:淋巴细胞的培养]
[0203](活化工序)
[0204]对于由实验I的实施例1、2和比较例1、2得到的培养容器，使用夹子分别以使培养部为5cmX IIcm的方式进行划分。
[0205]然后，将人末梢血单核细胞(Cell Applicat1ns株式会社制)5.8 X 14个悬浮于加入有10%小牛血清(Japan Life Technologies株式会社制)的ALyS505N_7培养基(株式会社细胞科学研究所制)，将4ml封入培养容器。然后，直接在37°C静置75小时，进行淋巴细胞的活化工序。
[0206]此时，实施例1、2和比较例2以使培养容器的固相化面朝下的方式进行。此外，如上所述，比较例I的培养容器中在其内侧的上下两面固相化有同量的抗CD3抗体，没有上下的区别，即没有固相化面与非固相化面的区别。
[0207](增殖工序)
[0208]在结束了活化工序的培养容器中追加上述培养基4ml，将培养容器上下反转，直接在37°C静置26小时，进行淋巴细胞的增殖(第二实施方式中的第一增殖工序)。
[0209]然后，去掉夹子，将培养容器培养部的容积扩大(第二实施方式中的容积扩大工序)，追加上述培养基20ml，直接在37°C静置62小时，继续进行淋巴细胞的增殖(第二实施方式中的第二增殖工序)。
[0210]在距离培养开始的上述各操作的时刻(75小时后、75+26( = 101)小时后、75+26+62(=163)小时后)、以及去掉夹子后的18小时后(75+26+18( = 119))，计数各培养容器中的淋巴细胞数目。其结果如图7所示。
[0211]如图7所示，仅在培养容器内的一面分别固相化有40ng/cm2、Ilng/cm2的抗⑶3抗体的实施例1、2中，在增殖工序中能够使淋巴细胞显著增殖。此时，在固相化浓度为40ng/cm2的情况(实施例1)与llng/cm2的情况(实施例2)之间，在增殖效率方面没有看到显著的差升。
[0212]另一方面，在培养容器内的两面固相化有抗CD3抗体的比较例I中，与实施例1、2相比，可知增殖工序中的淋巴细胞的增殖效率大幅降低。
[0213]另外，与实施例2相比稍微减少了所固相化的抗CD3抗体的浓度的比较例2中，在增殖工序中几乎无法使淋巴细胞增殖。由此可知，优选使固相化于培养容器的固相化面的抗⑶3抗体的浓度为约lOng/cm2以上。
[0214]然后，参照图16?图21对本发明的实施方式所涉及的培养容器的制造方法的实施例和比较例进行说明。图16、18、20为示出实施例和比较例的示意图，图17、19、21为示出实施例和比较例的实验结果的图表的图。
[0215][实验3:抗体固相化培养袋的制造]
[0216](实施例3)
[0217]使用LaboPlasto Mill(株式会社东洋精机制作所制)作为塑料挤出成形装置，将低密度聚乙烯挤出成形，成形出厚度ΙΟΟμπι的膜。然后，使用脉冲热封机，用该膜制作IlcmX
22.5cm(约225cm2)的袋，对该袋进行γ射线灭菌后供于实验。
[0218]然后，将该袋载置于装载台后封入空气约600ml，并且接着以液滴的状态封入溶解有50yg的抗CD3抗体(Mi I teny i B i o tec株式会社制)的磷酸缓冲液(Japan LifeTechnologies株式会社制)10ml。此时，以使该磷酸缓冲液的液滴仅与袋内表面的底面接触的方式进行。
[0219]然后，在26°C的条件下手动摇动袋I分钟，使磷酸缓冲液的液滴以1m/分钟的速度在袋内的底面上移动，使抗体吸附于袋内的底面，制造抗体固相化培养袋。
[0220]固相化浓度的测定以下述方式进行。
[0221 ]首先，除去培养容器内的液滴，使固相化面与包含I %十二烷基硫酸钠(日本西格玛奥德里奇合同会社制)的磷酸缓冲液(同上)500μ1接触，静置30分钟后，用Present Mixer(Tietech株式会社制)施加强振动，剥离所吸附的抗体。使用Micro BCATM Protein AssayKit(Thermo Fisher Scientific株式会社制)测定剥离液中的抗体量，并用其除以固相化面积，由此算出单位面积的蛋白质吸附量(以下称为吸附浓度)。
[0222]实施例3的培养容器中，仅在其内侧的一面(底面)固相化有抗CD3抗体。关于实施例3的培养容器的固相化浓度的测定结果，抗CD3抗体的吸附浓度为41.5ng/cm2。
[0223](实施例4)
[0224]与实施例3同样地制作IlcmX 22.5cm(约225cm2)的袋。
[0225]然后，在该袋中封入空气约600ml，并且接着以液滴的状态封入溶解有50yg的抗⑶3抗体(Miltenyi B1tec株式会社制)的磷酸缓冲液(Japan Life Technologies株式会社制)1ml ο
[0226]然后，在26°C的条件下手动摇动袋2.5分钟，使磷酸缓冲液的液滴以1m/分钟的速度在袋内的底面上移动，使抗体吸附于袋内的底面。然后，将袋上下反转，再次手动摇动袋2.5分钟，使上述液滴以1m/分钟的速度在袋内的底面(上下反转前的顶面)上移动。由此，使抗体吸附于袋内壁的两面，制造抗体固相化培养袋。
[0227]实施例4的培养容器在其内侧的两面固相化有抗CD3抗体。关于实施例4的培养容器的固相化浓度的测定结果，抗CD3抗体的吸附浓度为31.2ng/cm2。
[0228](比较例3)
[0229]与实施例3同样地制作IlcmX 22.5cm(约225cm2)的袋。
[0230]然后，在不在该袋中封入空气的情况下封入溶解有50yg的抗⑶3抗体(MiltenyiB1tec株式会社制)的磷酸缓冲液(Japan Life Technologies株式会社制)1ml，使该磷酸缓冲液与袋内的上下两面接触，在26°C静置60分钟。然后，用磷酸缓冲液40ml进行3次袋内的清洗，制造抗体固相化培养袋。
[0231 ]比较例3的培养容器在其内侧的两面固相化有抗CD3抗体。关于比较例3的培养容器的固相化浓度的测定结果，抗CD3抗体的吸附浓度为26.1ng/cm2。
[0232](比较例4)
[0233]与实施例3同样地制作IlcmX 22.5cm(约225cm2)的袋。
[0234]然后，在不在该袋中封入空气的情况下以液滴的状态封入溶解有50yg的抗⑶3抗体(Miltenyi B1tec株式会社制)的磷酸缓冲液(Japan Life Technologies株式会社制)10ml。然后，在26°C的条件下手动摇动袋5分钟，使磷酸缓冲液的液滴以1m/分钟的速度在袋内移动，使抗体吸附于袋的内表面。进一步，用磷酸缓冲液1ml进行3次袋内的清洗，制造抗体固相化培养袋。
[0235]比较例4的培养容器在其内侧的两面固相化有抗CD3抗体。关于比较例4的培养容器的固相化浓度的测定结果，抗CD3抗体的吸附浓度为23.8ng/cm2。
[0236]如图17所示，实施例3、实施例4、比较例3和比较例4中抗体对培养容器底面的单位面积的吸附效率(吸附浓度X 225cm2/50000ngX 100)分别为19%、14%、12%、11 %。
[0237]S卩，根据实施例3的方法，即使固相化时间为I分钟，与固相化时间为60分钟的比较例3的结果相比，吸附效率也增大60%左右。
[0238]另一方面，在不在培养容器中封入气体的情况下使液滴移动从而进行固相化的比较例4中，与比较例3的结果相比，吸附效率小。
[0239]另外，认为实施例4的吸附效率之所以小于实施例3的吸附效率，是因为实施例4的吸附面积为实施例3的吸附面积的2倍。
[0240]进一步，对实施例4与比较例4的结果进行比较可知，通过在培养容器中放入气体的基础上使液滴移动来进行固相化，由此能够将吸附效率提高30%左右。
[0241]这样地，根据本实施方式的培养容器的制造方法，即使在与以往相比更短的时间内，也能够将更多的抗体固相化于培养容器。另外，也能够使用比以往更少量的抗体将更多的抗体固相化于培养容器。
[0242][实验4:抗体固相化烧瓶的制造]
[0243](实施例5)
[0244]在漂浮培养用烧瓶800(Sumimoto Bakelite，聚苯乙烯制，底面积225cm2)中以液滴的状态封入溶解有50yg的抗CD3抗体(Mi ltenyi B1tec株式会社制)的磷酸缓冲液(Japan Life Techno1gies株式会社制)10ml。在26°C的条件下手动摇动烧瓶5分钟，使磷酸缓冲液的液滴以1m/分钟的速度在袋内的底面上移动，使抗体吸附于烧瓶内的底面，制造抗体固相化烧瓶。实施例5的抗体固相化烧瓶的抗CD3抗体的浓度为27.9ng/cm20
[0245](比较例5)
[0246]在漂浮培养用烧瓶800( Sumimoto Bakelite，聚苯乙稀制，底面积225cm2)中装入溶解有50口8的抗003抗体(1;[]^61171 B1tec株式会社制)的磷酸缓冲液(Japan LifeTechnologies株式会社制)1ml，使抗体溶液遍布整个底面，在26°C静置60分钟。由此，使抗体吸附于烧瓶的底面，制造抗体固相化烧瓶。比较例5的抗体固相化烧瓶的抗CD3抗体的浓度为 27.6ng/cm2。
[0247](比较例6)<