杀虫蛋白的制作方法

专利名称：杀虫蛋白的制作方法
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背景技术：
鞘翅目是一类重要的农业害虫，每年都引起严重的作物损失。鞘翅目昆虫的例子有玉米根虫和苜蓿象鼻虫(alfalfa weevil)。
苜蓿象鼻虫—紫苜蓿叶象(Hypera postica)及其近亲埃及苜蓿叶象(Hypera brunneipennis)是在美国种植的苜蓿的最重要的昆虫害虫，1984年有290万英亩遭到感染。每年花费合计2千万美元用于控制这些害虫。埃及苜蓿叶象是美国西南部的主要种类，它在炎热的夏天在此夏蛰(即夏眠)。在所有其它方面，它与在美国其它地区占优势的苜蓿象鼻虫是一样的。
幼虫阶段是象鼻虫生活史中最具破坏性的阶段。通过取食苜蓿的生长芽尖，幼虫引起叶片的骨骼化、矮化、降低植物生长、并最终降低产量。严重的感染可以毁灭整个苜蓿条。同样取食叶片的成虫引起额外的、但是较小的损伤。
每年美国有大约1千万英亩的玉米感染玉米根虫物种复合体。玉米根虫物种包括北方玉米根虫—长角叶甲(Diabrotica barberi)、南方玉米根虫—黄瓜十一星叶甲(D.undecimpunctata howardi)、和西方玉米根虫—玉米幼芽根叶甲(D.virgifera virgifera)。这些叶甲物种居于土壤中的幼虫取食玉米的根，引起倒伏。倒伏最终降低了玉米产量，并常常导致植株的死亡。成年甲虫通过取食玉米穗丝降低了授粉，并由此对玉米单株产量产生不利影响。另外，叶甲属的成虫和幼虫还攻击葫芦类农作物(黄瓜、甜瓜、南瓜等等)、和商业性生产的许多蔬菜和田间农作物，以及家园种植物。
已通过诸如轮作和高水平氮的应用等刺激不定根系生长的耕作方法，部分致力于对玉米根虫的控制。然而，化学杀虫剂严重依赖于确保实现期望的控制水平，杀虫剂结合或掺入到土壤中。使用一些化学杀虫剂的相关问题是环境污染和处理的昆虫种群中的抗性发展。
土壤微生物苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，B.t.)，是一种形成芽孢的革兰氏阳性细菌，其特征为含有伴孢晶体蛋白质内含物，在显微镜下表现为独特形状的晶体。B.t.的某些菌株产生对特定目的害虫有毒的蛋白质。已经分离得到某些B.t.毒素基因，并进行了测序，而且已经生产了基于重组DNA的B.t.产品并批准使用。另外，通过基因工程技术，正在发展将这些B.t.内毒素投递到农业环境中的新方法，包括用内毒素基因将植物经基因工程改造成具有昆虫抗性的应用，和将稳定的完整微生物细胞作为B.t.内毒素投递载体的应用(F.H.Gaertner和L.KimTIBTECH 6S4-S7)。由此，分离的B.t.内毒素基因日益具有商业价值。
B.t.杀虫剂的商业性使用最初被限制于小范围的鳞翅目(毛虫)害虫。苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种(B.thuringiensis subsp.kurstaki)的芽孢和晶体制备物，作为针对鳞翅目害虫的商业性杀虫剂，已经使用了许多年。例如，苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克HD-1变种(B.thuringiensis var.kurstaki HD-1)可产生对许多鳞翅目昆虫的幼虫有毒的结晶状δ-内毒素。
在最近几年中，然而，研究人员已经发现了对更广范围的害虫具有特异性的B.t.杀虫剂。例如其它B.t.物种即以色列亚种和粉菌变种(a.k.a.B.t.M-7，a.k.a.B.t.san diego)，已经分别商业性应用于控制双翅目和鞘翅目昆虫(F.H.Gaertner“杀虫蛋白的细胞投递系统活的和死的微生物”，《农作物保护剂的受控投递》，R.M.Wilkins编，Taylor and Francis，纽约和伦敦，第245-255页，1990)。还可以参阅T.L.Couch(1980)“苏云金芽孢杆菌以色列变种的蚊子致病性”，工业微生物学的发展(Developments inIndustrial Microbiology)，2261-76；C.C.Beegle(1978)“虫生细菌在农业生态系统中的应用”，工业微生物学的发展，2097-104；A.Krieg、A.M.Huger、G.A.Langenbruch、W.Wchnetter(1983)Z.ang.Ent.96500-508描述了据报导对两种鞘翅目甲虫(Colorado potato beetle，马铃薯叶甲[Lepinotarsa decemlineata]和蓝毛臀萤叶甲[Agelastica alni])有活性的苏云金芽孢杆菌粉菌变种(Bacillus thuringiensis var.tenebrionis)。
最近，已经鉴定了B.t.新亚种，而且已经分离得到了负责有活性的δ-内毒素蛋白质的基因(H.Hfte，H.R.Whiteley微生物学回顾(Microbiological Reviews)52(2)242-255)。Hfte和Whiteley将B.t.晶体蛋白质基因分成四个主要种类CryI(鳞翅目特异的)、CryII(鳞翅目和双翅目特异的)、CryIII(鞘翅目特异的)、和CryIV(双翅目特异的)。已经报道发现了对其它害虫有特异毒性的株系(J.S.Feitelson、J.Payne、和L.Kim生物技术(Bio/Technology)10271-275)。
Hfte和Whiteley对晶体蛋白质的1989年命名和分类方案，是基于推导的氨基酸序列和毒素的宿主范围。该方案覆盖了14种不同类型的毒素基因，分成五个主要种类。随着更多的毒素基因被发现，发现有类似序列的基因却具有明显不同的杀虫特异性，因此该方案逐渐变得不适用。已有人提出一种改进的基于氨基酸同一性的命名方案(Crickmore等人无脊椎动物病理学会，第29届年会，第3次国际苏云金芽孢杆菌研讨会，University of Cordoba，西班牙，9月1-6日，摘要)。除了cytA和cytB(仍作为单独的一类)外，所有毒素基因都保留了助记符“cry”。第一级的罗马数字换成了阿拉伯数字，去掉了第三级中的括号。目前的界线表示大约95％(第三级)、75％(第二级)、和48％(第一级)的序列同一性。除了提到的例外情况，许多原始名字得到了保留，但有些被重新分类。还可以参阅N.Crickmore、D.R.Zeigler、J.Feitelson、E.Schnepf、J.Van Rie、D.Lereclus、.J.Baum、和D.H.Dean(1998)“苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白质命名法修改”，微生物学及分子生物学回顾(Microbiology and Molecular Biology Reviews)第62卷807-813；和Crickmore、Zeigler、Feitelson、Schnepf、Van Rie、Lereclus、Baum、和Dean，“苏云金芽孢杆菌毒素命名法”(1999)http//www.biols.susx.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/index.html。该系统使用免费的软件程序CLUSTAL W和PHYLIP。PHYLIP程序包中的NEIGHBOR应用程序采用算术均值(UPGMA)算法。
在已发表的文献中，描述了B.t.晶体蛋白质基因在大肠杆菌中的克隆和表达(H.E.Schnepf、H.R.Whiteley美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)782893-2897)。美国专利4,448,885和美国专利4,467,036都公开了B.t.晶体蛋白质基因在E.coli中的表达。
美国专利4,797,276和4,853,331公开了可以在多种环境中用于控制鞘翅目害虫的苏云金芽孢杆菌粉菌变种(a.k.a.M-7，a.k.a.B.t.san diego)。美国专利4,918,006公开了具有针对双翅目的活性的B.t.毒素。美国专利4,849,217公开了具有针对苜蓿象鼻虫的活性的B.t.隔离群。美国专利5,208,077公开了具有针对鞘翅目的活性的B.t.隔离群。美国专利5,643,987公开了具有针对玉米根虫的活性、来自PS80JJ1的130kDa毒素。与本发明相关的WO 94/40162描述了对玉米根虫有毒的蛋白质新种类。美国专利5,151,363和4,948,734公开了具有针对线虫的活性的某些B.t.隔离群。
美国专利6,083,499和WO 97/40162公开了“二元毒素”。本发明与球形芽孢杆菌(Bacilius sphaericus)产生的杀蚊毒素是截然不同的。参阅EP 454 485；Davidson等人(1990)“球形芽孢杆菌的杀蚊子幼虫蛋白质的相互作用”，加拿大微生物学杂志(Can.J.Microbiol.)36(12)870-878；Baumann等人(1988)“编码球形芽孢杆菌2362和2297的51.4和41.9kDa蛋白质的杀蚊毒素基因的序列分析”，细菌学杂志(J.Bacteriol.)1702045-2050；Oei等人(1992)“经纯化的球形芽孢杆菌二元毒素及其删除衍生物与致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)肠道的结合功能性结合结构域的说明”，普通微生物学杂志(Journal of General Microbiology)138(7)1515-1526。
发明概述本发明涉及用于控制非哺乳动物害虫的新的物质和方法。在优选的实施方案中，本发明提供了用于控制鞘翅目(coleopteran)害虫的物质和方法。在更优选的实施方案中，此处所述的物质和方法被用于控制玉米根虫，最优选玉米幼芽根叶甲。本发明的杀虫蛋白还可以控制鳞翅目(lepidopteran)害虫，包括欧洲玉米螟(European cornborer)和棉铃虫(Helicoverpa zea)。
本发明有利的提供了多核苷酸及其编码的杀虫蛋白。在优选的实施方案中，一种40-50kDa蛋白和一种10-15kDa蛋白是一起使用的，它们组合在一起具有杀虫作用。由此，本发明的两类蛋白质可以称为“二元毒素”。如此处所用，术语“毒素”或“杀虫蛋白”包括这两类蛋白质任何一类。一起使用40-50kDa的蛋白质和10-15kDa的蛋白质是优选的，而非必须的。此处所述的一类多核苷酸序列编码全长分子量为大约40-50kDa的蛋白质。在特殊的实施方案中，这些蛋白质的分子量为大约43-47kDa。本发明的第二类多核苷酸编码大约10-15kDa的杀虫蛋白。在特殊的实施方案中，这些蛋白质的分子量为大约13-14kDa。应当明确的是，这两类毒素/基因都是本发明的一个方面。在特别优选的实施方案中，本发明的40-50kDa的蛋白质是与10-15kDa的蛋白质组合使用的。由此，本发明的蛋白质可以用于增加和/或促进其它蛋白质毒素的活性。
本发明包括了编码所述40-50kDa或10-15kDa毒素的多核苷酸、编码全长毒素保留了杀虫活性(优选当组合使用时)的一部分或片段的多核苷酸、和同时编码两类毒素的多核苷酸。此处还公开了融合蛋白(40-50kDa蛋白和10-15kDa蛋白融合在一起)及其编码多核苷酸的新的范例。
在一些实施方案中，根据本发明有用的B.t.毒素包括可以由此处公开的新的B.t.隔离群获得的毒素。应当明确的是，例如当40-50kDa和10-15kDa毒素一起使用时，一种毒素可以由一种隔离群获得，而另一种毒素可以由另一种隔离群获得。
本发明还包括了例示性B.t.隔离群和毒素的变体的使用，这些变体具有与特定例示性B.t.隔离群和毒素基本相同的鞘翅目活性特性。这些隔离群变体包括例如突变体。产生突变体的方法在微生物学领域是众所周知的。紫外线和化学诱变剂(诸如亚硝基胍)被广泛用于此目的。
在优选的实施方案中，本发明涉及包含至少一种本发明的分离多核苷酸的植物或植物细胞。优选的，转基因植物细胞在目的害虫取食的组织中表达杀虫蛋白。
或者，本发明的B.t.隔离群或表达此处所述毒素的重组微生物可以用于控制害虫。在这方面，本发明包括了对基本完整的B.t.细胞和/或包含本发明表达毒素的重组细胞的处理，使得当基本完整的细胞被应用于目的害虫的环境时其杀虫活性得到延长。经处理细胞可以作为杀虫毒素的保护层。
本发明的毒素是经目的昆虫消化后影响昆虫中肠细胞的口服毒剂。由此，目的害虫例如通过取食表达毒素的重组宿主细胞，接触了对害虫有毒的本发明蛋白质。这导致对目的害虫的控制。
附图简述


图1显示了3种例示性43-47kDa杀虫蛋白，以及这些杀虫毒素的共有序列。
图2显示了PS80JJ1的14和45kDa序列(SEQ ID NO31和10)的关系。
图3显示了实施例23的混和研究得到的LC50值的比较。
图4显示了51和42kDa的球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)毒素及基因和45kDa的149B1毒素及基因的蛋白质排列。
图5显示了51和42kDa的球形芽孢杆菌毒素及基因和45kDa的149B1毒素及基因的核苷酸序列排列。
序列简述SEQ ID NO1是80JJ1的大约45kDa毒素的5个氨基酸的N末端序列。
SEQ ID NO2是80JJ1的大约45kDa毒素的25个氨基酸的N末端序列。
SEQ ID NO3是80JJ1的大约14kDa毒素的24个氨基酸的N末端序列。
SEQ ID NO4是149B1的大约47kDa毒素的N末端序列。
SEQ ID NO5是PS149B1经纯化的大约14kDa蛋白质的50个氨基酸的N末端氨基酸序列。
SEQ ID NO6是167H2的大约47kDa毒素的N末端序列。
SEQ ID NO7是PS167H2经纯化的大约14kDa蛋白质的25个氨基酸的N末端序列。
SEQ ID NO8是根据本发明使用的PS80JJ1的44.3kDa毒素编码基因的寡核苷酸探针和PS149B1和PS167H2的正向引物。
SEQ ID NO9是根据本发明使用的PS149B1和PS167H2的反向引物。
SEQ ID NO10是大约45kDa的PS80JJ1毒素的编码基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO11是大约45kDa的PS80JJ1毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO12是大约44kDa的PS149B1毒素的编码基因的部分核苷酸序列。
SEQ ID NO13是大约44kDa的PS149B1毒素的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO14是大约44kDa的PS167H2毒素的编码基因的部分核苷酸序列。
SEQ ID NO15是大约44kDa的PS167H2毒素的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO16是根据本发明用于引物设计的肽序列。
SEQ ID NO17是根据本发明用于引物设计的肽序列。
SEQ ID NO18是根据本发明用于引物设计的肽序列。
SEQ ID NO19是根据本发明用于引物设计的肽序列。
SEQ ID NO20是对应于SEQ ID NO16的肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO21是对应于SEQ ID NO17的肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO22是对应于SEQ ID NO18的肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO23是对应于SEQ ID NO19的肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO24是基于SEQ ID NO22的反向互补链的反向引物。
SEQ ID NO25是基于SEQ ID NO23的反向互补链的反向引物。
SEQ ID NO26是基于PS80JJ1的44.3kDA毒素的正向引物。
SEQ ID NO27是基于PS80JJ1的44.3kDA毒素的反向引物。
SEQ ID NO28是根据本发明代表1类新毒素的一般性序列。
SEQ ID NO29是根据本发明使用的寡核苷酸探针。
SEQ ID NO30是包含14和45kDa的PS80JJ1毒素开放阅读框架和侧翼核苷酸序列的完整基因座的核苷酸序列。
SEQ ID NO31是PS80JJ1的14kDa毒素的开放阅读框架的核苷酸序列。
SEQ ID NO32是PS80JJ1的14kDa毒素的推导氨基酸序列。
SEQ ID NO33是根据本发明使用的反向寡核苷酸引物。
SEQ ID NO34是包含14和44kDa的PS167H2毒素开放阅读框架和侧翼核苷酸序列的完整基因座的核苷酸序列。
SEQ ID NO35是大约14kDa的PS167H2毒素的编码基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO36是大约14kDa的PS167H2毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO37是大约44kDa的PS167H2毒素的编码基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO38是大约44kDa的PS167H2毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO39是包含14和44kDa的PS149B1毒素开放阅读框架和侧翼核苷酸序列的完整基因座的核苷酸序列。
SEQ ID NO40是大约14kDa的PS149B1毒素的编码基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO41是大约14kDa的PS149B1毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO42是大约44kDa的PS149B1毒素的编码基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO43是大约44kDa的PS149B1毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO44是经玉米优化的编码80JJ1的大约14kDa毒素的基因序列。
SEQ ID NO45是经玉米优化的编码80JJ1的大约44kDa毒素的基因序列。
SEQ ID NO46是在实施例15(见下文)中使用的反向引物的DNA序列。
SEQ ID NO47是正向引物(见实施例16)的DNA序列。
SEQ ID NO48是反向引物(见实施例16)的DNA序列。
SEQ ID NO49是正向引物(见实施例16)的DNA序列。
SEQ ID NO50是反向引物(见实施例16)的DNA序列。
SEQ ID NO51是来自PS131W2、编码14kDa蛋白质的DNA序列。
SEQ ID NO52是PS131W2的14kDa蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO53是来自PS131W2、编码44kDa蛋白质的部分DNA序列。
SEQ ID NO54是PS131W2的44kDa蛋白质的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO55是来自PS158T3、编码14kDa蛋白质的DNA序列。
SEQ ID NO56是PS158T3的14kDa蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO57是来自PS158T3、编码44kDa蛋白质的部分DNA序列。
SEQ ID NO58是PS158T3的44kDa蛋白质的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO59是来自PS158X10、编码14kDa蛋白质的DNA序列。
SEQ ID NO60是PS158X10的14kDa蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO61是来自PS185FF、编码14kDa蛋白质的DNA序列。
SEQ ID NO62是PS185FF的14kDa蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO63是来自PS185FF、编码44kDa蛋白质的部分DNA序列。
SEQ ID NO64是PS185FF的44kDa蛋白质的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO65是来自PS185GG、编码14kDa蛋白质的DNA序列。
SEQ ID NO66是PS185GG的14kDa蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO67是来自PS185GG、编码44kDa蛋白质的BNA序列。
SEQ ID NO68是PS185GG的44kDa蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO69是来自PS185L12、编码14kDa蛋白质的DNA序列。
SEQ ID NO70是PS185L12的14kDa蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO71是来自PS185W3、编码14kDa蛋白质的DNA序列。
SEQ ID NO72是PS185W3的14kDa蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO73是来自PS186FF、编码14kDa蛋白质的DNA序列。
SEQ ID NO74是PS186FF的14kDa蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO75是来自PS187F3、编码14kDa蛋白质的DNA序列。
SEQ ID NO76是PS187F3的14kDa蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO77是来自PS187F3、编码44kDa蛋白质的部分DNA序列。
SEQ ID NO78是PS187F3的44kDa蛋白质的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO79是来自PS187G1、编码14kDa蛋白质的DNA序列。
SEQ ID NO80是PS187G1的14kDa蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO81是来自PS187G1、编码44kDa蛋白质的部分DNA序列。
SEQ ID NO82是PS187G1的44kDa蛋白质的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO83是来自PS187L14、编码14kDa蛋白质的DNA序列。
SEQ ID NO84是PS187L14的14kDa蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO85是来自PS187L14、编码44kDa蛋白质的部分DNA序列。
SEQ ID NO86是PS187L14的44kDa蛋白质的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO87是来自PS187Y2、编码14kDa蛋白质的DNA序列。
SEQ ID NO88是PS187Y2的14kDa蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO89是来自PS187Y2、编码44kDa蛋白质的部分DNA序列。
SEQ ID NO90是PS187Y2的44kDa蛋白质的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO91是来自PS201G、编码14kDa蛋白质的DNA序列。
SEQ ID NO92是PS201G的14kDa蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO93是来自PS201HH、编码14kDa蛋白质的DNA序列。
SEQ ID NO94是PS201HH的14kDa蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO95是来自PS201L3、编码14kDa蛋白质的DNA序列。
SEQ ID NO96是PS201L3的14kDa蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO97是来自PS204C3、编码14kDa蛋白质的DNA序列。
SEQ ID NO98是PS204C3的14kDa蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO99是来自PS204G4、编码14kDa蛋白质的DNA序列。
SEQ ID NO100是PS204G4的14kDa蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO101是来自PS204I11、编码14kDa蛋白质的DNA序列。
SEQ ID NO102是PS204I11的14kDa蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO103是来自PS204J7、编码14kDa蛋白质的DNA序列。
SEQ ID NO104是PS204J7的14kDa蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO105是来自PS236B6、编码14kDa蛋白质的DNA序列。
SEQ ID NO106是PS236B6的14kDa蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO107是来自PS242K10、编码14kDa蛋白质的DNA序列。
SEQ ID NO108是PS242K10的14kDa蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO109是来自PS242K10、编码44kDa蛋白质的部分DNA序列。
SEQ ID NO110是PS242K10的44kDa蛋白质的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO111是来自PS246P42、编码14kDa蛋白质的DNA序列。
SEQ ID NO112是PS246P42的14kDa蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO113是来自PS69Q、编码14kDa蛋白质的DNA序列。
SEQ ID NO114是PS69Q的14kDa蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO115是来自PS69Q、编码44kDa蛋白质的DNA序列。
SEQ ID NO116是PS69Q的44kDa蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO117是来自KB54、编码14kDa蛋白质的DNA序列。
SEQ ID NO118是KB54的14kDa蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO119是来自KR1209、编码14kDa蛋白质的DNA序列。
SEQ ID NO120是KR1209的14kDa蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO121是来自KR1369、编码14kDa蛋白质的DNA序列。
SEQ ID NO122是KR1369的14kDa蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO123是来自KR589、编码14kDa蛋白质的DNA序列。
SEQ ID NO124是KR589的14kDa蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO125是来自KR589、编码44kDa蛋白质的部分DNA序列。
SEQ ID NO126是KR589的44kDa蛋白质的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO127是经优化用于在玉米(Zea mays)中表达的命名为149B1-15-PO的基因的多核苷酸序列。该基因编码可从WO97/40162中公开的PS149B1中获得的大约15kDa毒素。
SEQ ID NO128是经优化用于在玉米中表达的命名为149B1-45-PO的基因的多核苷酸序列。该基因编码可从WO97/40162中公开的PS149B1中获得的大约45kDa毒素。
SEQ ID NO129是经优化用于在玉米中表达的命名为80JJ11-15-PO7的基因的多核苷酸序列。该基因是编码大约15kDa毒素的替代基因。
SEQ ID NO130是命名为80JJ11-15-PO7的基因编码的毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO131是根据本发明(见实施例20)使用的寡核苷酸引物(15kfor1)。
SEQ ID NO132是根据本发明(见实施例20)使用的寡核苷酸引物(45krev6)。
SEQ ID NO133是来自PS201L3、编码14kDa蛋白质的DNA序列。
SEQ ID NO134是PS201L3的14kDa蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO135是来自PS201L3、编码44kDa蛋白质的部分DNA序列。
SEQ ID NO136是PS201L3的44kDa蛋白质的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO137是来自PS187G1、编码14kDa蛋白质的DNA序列。
SEQ ID NO138是PS187G1的14kDa蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO139是来自PS187G1、编码44kDa蛋白质的DNA序列。
SEQ ID NO140是PS187G1的44kDa蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO141是来自PS201HH2、编码14kDa蛋白质的DNA序列。
SEQ ID NO142是PS201HH2的14kDa蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO143是来自PS201HH2、编码44kDa蛋白质的部分DNA序列。
SEQ ID NO144是PS201HH2的44kDa蛋白质的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO145是来自KR1369、编码14kDa蛋白质的DNA序列。
SEQ ID NO146是KR1369的14kDa蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO147是来自KR1369、编码44kDa蛋白质的DNA序列。
SEQ ID NO148是KR1369的44kDa蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO149是来自PS137A、编码14kDa蛋白质的DNA序列。
SEQ ID NO150是PS137A的14kDa蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO151是来自PS201V2、编码14kDa蛋白质的DNA序列。
SEQ ID NO152是PS201V2的14kDa蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO153是来自PS207C3、编码14kDa蛋白质的DNA序列。
SEQ ID NO154是PS207C3的14kDa蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO155是根据本发明(见实施例22)使用的寡核苷酸引物(F1new)。
SEQ ID NO156是根据本发明(见实施例22)使用的寡核苷酸引物(R1new)。
SEQ ID NO157是根据本发明(见实施例22)使用的寡核苷酸引物(F2new)。
SEQ ID NO158是根据本发明(见实施例22)使用的寡核苷酸引物(R2new)。
SEQ ID NO159是大约58kDa的融合蛋白。
SEQ ID NO160是编码SEQ ID NO159的蛋白质的融合基因。
SEQ ID NO161是根据本发明(见实施例27)使用的引物45kD5’。
SEQ ID NO162是根据本发明(见实施例27)使用的引物45kD3’rc。
SEQ ID NO163是根据本发明(见实施例27)使用的引物45kD5’01。
SEQ ID NO164是根据本发明(见实施例27)使用的引物45kD5’02。
SEQ ID NO165是根据本发明(见实施例27)使用的引物45kD3’03。
SEQ ID NO166是根据本发明(见实施例27)使用的引物45kD3’04。
发明详述本发明涉及两类新的多核苷酸序列以及这些多核苷酸序列编码的新的杀虫蛋白。在一个实施方案中，蛋白质的全长分子量为大约40-50kDa。在此处例示的特定实施方案中，这些蛋白质的分子量为大约43-47kDa。在第二个实施方案中，杀虫蛋白的分子量为大约10-15kDa。在此处例示的特定实施方案中，这些蛋白质的分子量为大约13-14kDa。
在优选的实施方案中，40-50kDa蛋白和10-15kDa蛋白是一起使用的，它们组合在一起具有杀虫作用。由此，本发明的两类蛋白质可以称为“二元毒素”。如此处所用，术语“毒素”包括这两类杀虫蛋白任何之一。本发明涉及编码所述40-50kDa或10-15kDa毒素的多核苷酸、编码全长毒素当组合使用时保留了杀虫活性的部分或片段的多核苷酸、和同时编码两类毒素的多核苷酸。在优选的实施方案中，这些毒素对鞘翅目害虫，更优选玉米根虫，最优选玉米幼芽根叶甲有活性。鳞翅目害虫也可以作为目标。
此处例示了某些特定毒素。对于具有已知氨基酸序列的毒素，分子量也是已知的。本领域技术人员可以理解，通过凝胶电泳测定的蛋白质表观分子量有时并不是真正的分子量。因此，此处提及的例如45kDa蛋白或14kDa蛋白应当理解为指大致那么大的蛋白质，真正的分子量可以略有不同。
本发明不仅涉及编码这些种类的毒素的多核苷酸，还涉及使用这些多核苷酸产生表达毒素的重组宿主。在其它方面，本发明涉及本发明的大约40-50kDa毒素和本发明的大约10-15kDa毒素的组合使用，以实现对害虫的高效控制，包括诸如玉米根虫等鞘翅目害虫。例如，植物的根可以表达这两类毒素。
由此，通过本领域技术人员已知的多种技术，可以使用本发明的隔离群、毒素、和基因实现对害虫的控制。这些方法包括例如将B.t.隔离群应用于害虫(或其区域)、将重组微生物应用于害虫(或其区域)、和用编码本发明杀虫毒素的基因转化植物。根据本发明使用的微生物可以是例如苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌、和/或假单胞菌。本领域技术人员可以通过标准技术产生重组宿主。此处公开了这些转化必需的物质，或者本领域技术人员可以方便的获得它们。本领域技术人员通过与此处提供的技术相结合的标准技术，还可以实现对昆虫和诸如线虫和螨虫等其它害虫的控制。
此处提供的毒素和多核苷酸序列新种类根据本发明由多个参数定义。此处描述的一个毒素决定性特征是杀虫活性。在特定的实施方案中，这些毒素具有针对鞘翅目害虫的活性。本发明还包括具有抗鳞翅目活性的毒素。本发明的毒素和基因还可以由它们的氨基酸序列和核苷酸序列进一步定义。每类新分子的序列可以由它们与某些例示性序列的相似性或同一性以及与某些例示性探针的杂交能力或由某些例示性引物扩增的能力进行鉴定或定义。此处提供的两类毒素还可以根据它们与某些抗体的免疫反应性和它们与通式的一致性进行鉴定。
对于本领域技术人员清楚的是，编码本发明杀虫蛋白的基因可以通过多种方法获得。此处例示的特定基因可以由保藏在此处所述培养物保藏中心的隔离群获得。本发明的这些基因和毒素还可以例如通过使用基因合成仪进行合成构建。
SEQ ID NO11、43、和38提供了3种例示性45kDa毒素的序列。在优选的实施方案中，这类毒素的序列符合SEQ ID NO28所示的通用序列。在优选的实施方案中，这类毒素符合
图1所示的共有序列。
通过此处提供的教学，本领域技术人员将容易的产生并使用此处所述多种毒素和多核苷酸序列的新种类。
根据本发明有用的微生物已经保存于农业研究机构专利培养物收藏中心(Agricultural Research Service Patent CultureCollection)(NRRL)的永久保藏中心，北方地区研究中心(NorthernRegional Research Center)，北方大学街1815号(1815 NorthUniversity Street)，Peoria，伊利诺斯61604美国。保藏菌株的培养物保藏编号如下
由于美国专利5,151,363和其它专利的发布，公众可以获得PS80JJ1隔离群。
本发明的其它方面涉及新的隔离群和可由这些隔离群获得的毒素和基因。新的隔离群已经进行了保藏，并包括于上表中。这些隔离群已经进行了保藏，在该专利申请的待审期内，保证根据37 CFR 1.14和35 U.S.C.122.授权的专利和商标委员会所确定的人能获取所述培养物。在提交了该申请的副本或其后续申请的国家中，可以按照该国专利法的要求提供所述保藏物。但是，应当明白保藏物的可获得性并不构成对以侵犯由政府行为授予的专利权来实施本发明的许可。
此外，将按照微生物保藏的布达佩斯条约款项来保存和对公众发放所述保藏培养物，即应小心储存以保证其在最近一次要求重新提供保藏物样品后至少5年内，以及任何情况中在保藏日后至少30年内或公开该培养物的专利授权后的有效期内存活并不被污染。由于保藏物状况使得无法由保藏物提供样品时，保藏者承担替换保藏物的责任。公众获取所述培养物的所有限制在公开该培养物的专利被授权时去除。
下表提供了根据本发明有用的某些B.t.隔离群的特征。
表1.对鞘翅目有毒的B.t.菌株的描述培养物 晶体描述大致分子量(kDa) 血清型 NRRL保藏号 保藏日期PS80JJ1 多价吸附130、90、47、37、14 4a4b、sotto B-18679 90-7-17PS149B1 130、47、14 B-21553 96-3-28PS167H2 70、47、14B-23554 96-3-28本发明的其它隔离群还可以由毒素内容物的形状和位置进行表征。毒素、基因、和探针本发明的多核苷酸可以用于形成完整“基因”，以在期望的宿主细胞中编码蛋白质或肽。例如，本领域技术人员将容易看出，所附序列表中的一些多核苷酸没有终止密码子。同样的，正如本领域已知的，本发明多核苷酸可以恰当的置于感兴趣宿主中启动子的控制之下。
正如技术人员容易想到的，DNA通常以双链形式存在。在这种排列方式中，一条链与另一链互补，反之亦然。由于DNA在例如植物中进行复制，所以产生了另外的DNA互补链。在本领域内“编码链”通常用来指可与反义链结合的链。mRNA由DNA的“反义”链转录得到。“有义”或“编码”链含有一系列密码子(密码子是能三个一组的阅读从而产生特定氨基酸的三个核苷酸)，作为开放读码框(ORF)阅读从而形成感兴趣的蛋白质或肽。为了在体内表达蛋白质，通常DNA的一条链转录成mRNA的互补链，作为蛋白质的模板。由此，本发明包括使用所附序列表中的例示性多核苷酸和/或互补链。本发明包括与例示性DNA在功能上等同的RNA和PNA(肽核酸)。
使用例如寡核苷酸探针可以鉴定并获得本发明的毒素和基因。这些探针是可检测的核苷酸序列，如国际申请号WO 93/16094中所述，它们可以借助恰当的标记进行检测，或制成本身荧光。探针(和本发明多核苷酸)可以是DNA、RNA、或PNA。除了腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、和尿嘧啶(U；用于RNA分子)，本发明的合成探针(和多核苷酸)还可以含有次黄嘌呤(能够与所有四种碱基配对的中性碱基；有时在合成探针中代替所有四种碱基混和物使用)。由此，当此处提及合成的、简并的寡核苷酸，且一般性使用“h”时，“h”可以是G、A、T、C、或次黄嘌呤。此处使用的多义代码与标准IUPAC的命名协定是一致的，例如，R表示A或G，Y表示C或T，等等。
正如本领域众所周知的，如果探针分子和核酸样品通过在两种分子间形成强键而发生杂交，那么可以合理的假设探针和样品具有实质性的同源性/相似性/同一性。优选的，杂交在严谨条件下通过本领域众所周知的技术进行，例如G.H.Keller和M.M.Manak(1987)DNA探针(DNA Probes)，Stockton出版社，纽约州纽约市，第169-170页所述。例如，如此处所述，通过用2xSSC(标准柠檬酸盐溶液)/0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)于室温15分钟进行第一次清洗，通常进行两次清洗，可以实现高严谨条件。然后通过降低盐浓度和/或升高温度可以实现更高的严谨度。例如，上述清洗后再用0.1xSSC/0.1％SDS于室温15分钟进行两次清洗，之后用0.1xSSC/0.1％SDS于55℃ 30分钟进行后续清洗。本领域技术人员知道，这些温度可以用于其它杂交和此处提出的清洗方案(例如SSPE可以作为盐代替SSC)。通过向445ml水中加入50ml 20xSSC和5ml 10％SDS，可以制备2xSSC/0.1％SDS。通过混和NaCl(175.3g/0.15M)、柠檬酸钠(88.2g/0.015M)、和1L水，并用10N NaOH调pH7.0，可以制备20xSSC。通过在50ml经高压灭菌的水中溶解10g SDS、稀释至100ml、并分装，可以制备10％SDS。
探针的检测提供了以已知方式测定是否发生杂交的方法。这种探针分析提供了用于鉴定本发明的毒素编码基因的快速方法。根据本发明作为探针使用的核苷酸片段可以使用DNA合成仪和标准步骤进行合成。这些核苷酸序列还可以作为PCR引物用于扩增本发明基因。
分子的杂交特征可以用于定义本发明的多核苷酸。由此，本发明包括与此处例示的多核苷酸(诸如SEQ ID NO46-166中包括的DNA序列)可发生杂交的多核苷酸(和/或其互补链，优选其完全互补链)。
如此处所用，用于杂交的“严谨”条件指与当前申请人采用的条件实现相同或大致相同的杂交特异性程度的条件。具体而言，Southern印迹上固定的BNA与32P标记的基因特异性探针的杂交可以通过标准方法(T.Maniatis、E.F.Fritsch、J.Sambrook分子克隆实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)进行。一般而言，可以在能够检测目标序列(例如与PS80JJ1毒素基因具有同源性)的严谨条件下进行杂交和随后的洗涤。对于双链DNA基因探针，可以在比DNA杂合体解链温度(Tm)低20-25℃的温度下、在6xSSC/5xDenhardt氏溶液/0.1％SDS/0.1mg/ml变性DNA中、过夜进行杂交。下面的公式描述了解链温度(G.A.Beltz、K.A.Jacobs、T.H.Eickbush、P.T.Cherbas、和F.C.Kafatos酶学方法(Methods of Enzymology)，R.Wu、L.Grossman、和K.Moldave[编]Academic出版社，纽约，100266-285)。
Tm(℃)＝81.5℃+16.6Log[Na+]+0.41(％G+C)-0.61(％甲酰胺)-600/双螺旋碱基对长度。
通常如下进行洗涤(1)在1xSSPE/0.1％SDS中于室温15分钟洗涤2次(低严谨度洗涤)。
(2)在0.2xSSPE/0.1％SDS中于Tm-20℃ 15分钟洗涤1次(中等严谨洗涤)。
对于寡核苷酸探针，可以在比杂合体解链温度(Tm)低10-20℃的温度下、在6xSSPE/5xDenhardt氏溶液/0.1％SDS/0.1mg/ml变性DNA中、过夜进行杂交。由下面的公式确定寡核苷酸探针的TmTm(℃)＝2(T/A碱基对数目)+4(G/C碱基对数目)(S.V.Suggs、T.Mivake、E.H.Kawashime、M.J.Johnson、K.Itakura、和R.B.WallaceICN-UCLA Symp.Dev.Biol.UsingPurified Genes，D.D.Brown[编]，Academic出版社，纽约，23683-693)。
通常如下进行洗涤(1)在1xSSPE/0.1％SDS中于室温15分钟洗涤2次(低严谨度洗涤)。
(2)在1xSSPE/0.1％SDS中于杂交温度15分钟洗涤1次(中等严谨洗涤)。
可由隔离群PS149B1、PS167H2、和PS80JJ1获得的毒素经定性分析，具有至少一项下列特征(本发明的新毒素可以用此处提出的这些和其它鉴定信息进行相似的定性分析)(a)所述毒素由在严谨条件下与选自下组的核苷酸序列可发生杂交的核苷酸序列编码编码SEQ ID NO2的DNA、编码SEQ ID NO4的DNA、编码SEQ ID NO6的DNA、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、编码SEQ ID NO11的DNA、SEQ ID NO12、编码SEQ ID NO13的DNA、SEQ ID NO14、编码SEQ ID NO15的DNA、编码SEQ ID NO16的DNA、编码SEQ ID NO17的DNA、编码SEQ ID NO18的DNA、编码SEQ ID NO19的DNA、SEQ ID NO20、SEQ ID NO21、SEQ ID NO22、SEQ IDNO23、SEQ ID NO24、SEQ ID NO25、SEQ ID NO26、SEQ ID NO27、编码SEQ ID NO28的杀虫部分的DNA、SEQ ID NO37、编码SEQID NO38的DNA、SEQ ID NO42、和编码SEQ ID NO43的DNA；(b)所述毒素与针对选自下组的苏云金芽孢杆菌隔离群的大约40-50kDa杀虫毒素或其片段的抗体可发生免疫反应具有NRRLB-18679的鉴定特征的PS80JJ1、具有NRRL B-21553的鉴定特征的PS149B1、和具有NRRL B-21554的鉴定特征的PS167H2；
(c)所述毒素由核苷酸序列编码，其中所述核苷酸序列的部分可以使用选自下组的引物对通过PCR进行扩增SEQ ID NO20和24产生大约495bp的片段、SEQ ID NO20和25产生大约594bp的片段、SEQ IDNO21和24产生大约471bp的片段、SEQ ID NO21和25产生大约580bp的片段；(d)所述毒素包含SEQ ID NO28所示氨基酸序列的杀虫部分；(e)所述毒素包含与选自下组的氨基酸序列的杀虫部分具有至少大约60％同源性的氨基酸序列SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO38、和SEQ ID NO43；(f)所述毒素由在严谨条件下与选自下组的核苷酸序列可发生杂交的核苷酸序列编码编码SEQ ID NO3的DNA、编码SEQ ID NO5的DNA、编码SEQ ID NO7的DNA、编码SEQ ID NO32的DNA、编码SEQID NO36的DNA、和编码SEQ ID NO41的DNA；(g)所述毒素与针对选自下组的苏云金芽孢杆菌隔离群的大约10-15kDa杀虫毒素或其片段的抗体可发生免疫反应具有NRRLB-18679的鉴定特征的PS80JJ1、具有NRRL B-21553的鉴定特征的PS149B1、和具有NRRL B-21554的鉴定特征的PS167H2；(h)所述毒素由其中部分核苷酸序列可以使用引物对SEQ ID NO29和33通过PCR进行扩增的核苷酸序列编码；(i)所述毒素包含与选自下组的氨基酸序列具有至少大约60％同源性的氨基酸序列SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO32的杀虫部分、SEQ ID NO36的杀虫部分、和SEQ ID NO41的杀虫部分。基因和毒素的修饰根据本发明有用的基因和毒素不仅包括具体例示的全长序列，还包括这些序列的部分和/或片段(包括与全长分子相比其内部的和/或末端删除)，及其变体、突变体、嵌合体、和融合体。本发明的蛋白质可以包含取代氨基酸，只要它们保留了此处具体例示的蛋白质的特征性杀虫活性即可。“变体”基因的核苷酸序列编码与例示蛋白质相同的毒素或具有等同的杀虫活性的毒素。如此处所用，术语“等同毒素”指具有与例示毒素相同或基本相同的、针对目的害虫的生物学活性的毒素。如此处所用，“基本相同的”序列指包含不显著影响杀虫活性的氨基酸取代、删除、添加、或插入的序列。此定义还包括保留了杀虫活性的片段。保留了例示毒素的杀虫活性的片段和等同物属于本发明的范围之内。
等同毒素和/或编码这些等同毒素的基因可以使用此处提供的教学由野生型或重组B.t.隔离群和/或其它野生型或重组有机体衍生得到。
使用例如用于产生点突变的标准方法，可以容易的构建基因的变体。同样的，例如美国专利5,605,793描述了通过随机片段化后的DNA重新装配产生额外的分子多样性的方法。变体基因可以用于产生变体蛋白质；重组宿主可以用于产生变体蛋白质。使用商品化的外切核酸酶或内切核酸酶根据标准步骤可以产生全长基因的片段。例如，诸如Bal31等酶或定点诱变可以用于由这些基因的末端系统切除核苷酸。同样的，编码活性片段的基因可以使用多种限制酶获得。蛋白酶可以用于直接获得这些毒素的活性片段。
有大量的方法可以用于获取本发明的杀虫毒素。例如，针对此处公开并要求的杀虫毒素的抗体可以用于由蛋白质混和物鉴定并分离其它毒素。具体而言，可以制备针对毒素中最保守且最独特(与其它B.t.毒素相比)的部分的抗体。然后这些抗体可以通过免疫沉淀、酶联免疫吸附实验(ELISA)、或Western印渍，用于特异性鉴定具有特征性活性的等同毒素。使用标准步骤可以容易的制备针对此处公开的毒素、等同毒素、或这些毒素的片段的抗体。然后可以由微生物来源获得编码这些毒素的基因。
由于遗传密码的冗余性，多种不同的DNA序列可以编码此处公开的氨基酸序列。产生这些编码相同或基本相同毒素的替代DNA序列，完全属于本领域技术人员的技术范围之内。这些变体DNA序列属于本发明的范围之内。
此处例示了本发明的某些毒素。既然这些毒素仅仅是本发明毒素的例示，显然本发明包括具有与例示毒素相同或相似杀虫活性的变体或等同毒素(和编码等同毒素的核苷酸序列)。等同毒素与例示毒素具有氨基酸相似性(和/或同源性)。氨基酸同一性通常高于60％，优选高于75％，更优选高于80％，甚至更优选高于90％，而且可以高于95％。本发明的优选多核苷酸和蛋白质还可以由更具体的同一性和/或相似性范围定义。例如，与此处例示的序列相比，同一性和/或相似性可以是与本文例示序列相比为49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、或99％。除非特别说明，此处使用的两种核酸的序列同一性和/或相似性百分数使用Karlin和Altschul(1990)美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)872264-2268的算法，经Karlin和Altschul(1993)美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)905873-5877修正，进行确定。这种算法掺入了Altschul等人(1990)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)215402-410的NBLAST和XBLAST程序。用NBLAST程序进行BLAST核苷酸搜索，评分＝100，词长＝12，以获得具有期望的序列同一性百分数的核苷酸序列。为了获得用于比较目的的有缺口排列，如Altschul等人(1997)核酸研究(Nucl.Acids Res.)253389-3402中所述使用Gapped BLAST。当利用BLAST和GappedBLAST程序时，使用相应程序(NBLAST和XBLAST)的系统设定参数。参阅http//www.ncbi.nih.gov。评分还可以如上文背景部分所述使用Crickmore等人的方法和算法进行计算。
毒素中负责生物学活性或涉及最终负责生物学活性的三维构型确定的决定性区域中氨基酸同源性是最高的。在这个方面，如果某些氨基酸取代位于活性的非决定性区域，或者是不影响分子三维构型的保守氨基酸取代，那么这些取代是可接受的，并且是可预计的。例如，氨基酸可以属于下列类型非极性；不带电荷、极性；碱性；和酸性。只要取代不显著改变化合物的生物学活性，则保守取代(即一种类型的氨基酸被同类的另一种氨基酸取代)属于本发明的范围之内。表2提供了属于各类的氨基酸范例的表。
表2.氨基酸类型 氨基酸范例非极性 Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trp不带电荷、极性 Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln酸性 Asp、Glu碱性 Lvs、Arg、His在某些情况中，也可以进行非保守取代。决定性因素是这些取代不能显著影响毒素的生物学活性。
如此处所用，“分离的”多核苷酸和/或“纯化的”毒素指这些分子不与天然状况下相关的其它分子相关联；这些术语包括在植物中的使用。由此，“分离的”和/或“纯化的”意味着涉及此处所述的“人为操作”。
与本发明毒素功能等同的合成基因也可以用于转化宿主。用于产生合成基因的方法可以在例如美国专利5,380,831中找到。转基因宿主可以将本发明的毒素编码基因导入广泛的微生物或植物宿主。在优选的实施方案中，毒素基因的表达直接的或间接的导致杀虫蛋白的细胞内产生和维持。当害虫取食转基因/重组/经转化宿主细胞时，同时也就取食了毒素。这是引起害虫与毒素接触的优选方式。结果害虫受到了控制(杀死或虚弱)。或者，合适的微生物宿主，如诸如荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)等假单胞菌，可以应用于害虫地点，它们将在此增殖并被目的害虫取食。可以在延长毒素活性和稳定细胞的条件下，对含有毒素基因的微生物进行处理。然后可以将保留了毒性活性的经处理细胞应用于目的害虫的环境。
在优选的实施方案中，使用了重组植物细胞和植物。优选的植物(和植物细胞)是玉米和/或玉蜀黍。
当通过合适的载体将B.t.毒素基因导入微生物宿主，并将该宿主以活的状态应用于环境时，应当使用某些宿主微生物。微生物宿主选自已知占据一种或多种感兴趣农作物的“植物圈”(叶表、叶圈、根际、和/或根表)的类型。选择这些微生物是为了能够在特殊环境中(农作物和其它昆虫栖息地)成功的与野生型微生物竞争，提供表达多肽杀虫剂的基因的稳定维持和表达，并理想的为杀虫剂提供免于环境降解和灭活的进一步保护。
已知大量的微生物栖息于广泛的重要农作物的叶面(植物叶片表面)和/或根际(植物根部周围的土壤)。这些微生物包括细菌、藻类、和真菌。特别感兴趣的是微生物，诸如细菌，如假单胞菌属(Pseudomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、根瘤菌属(Rhizobium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、嗜甲基菌属(Methylophilius)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、醋杆菌属(Acetobacter)、乳杆菌属(Lactobacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azotobacter)、明串珠菌属(Leuconostoc)、和产碱菌属(Alcaligenes)；真菌，特别是酵母，如酵母属(Saccharomyces)、隐球酵母属(Cryptococcus)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、红酵母属(Rhodotorula)、和短梗霉属(Aureobasidium)。特别感兴趣的是这些植物圈细菌物种，如丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、木醋杆菌(Acetobacter xylinum)、根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)、类球形红假单胞菌(Rhodopseudomonas spheroides)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、苜蓿根瘤菌(Rhizobiummelioti)、真养产碱菌(Alcaligenes entrophus)、和维涅兰德固氮菌(Azotobacter vinlandii)；和植物圈酵母物种，诸如深红酵母(Rhodotorula rubra)、胶粘红酵母(R.glutinis)、海滨红酵母(R.marina)、橙黄色红酵母(R.aurantiaca)、浅白隐球酵母(Cryptococcus albidus)、流散隐球酵母(C.diffluens)、罗伦隐球酵母(C.laurentii)、罗氏酵母(Saccharomyces rosei)、普地酵母(S.pretoriensis)、啤酒酵母(S.cerevisiae)、红色掷孢酵母(Sporobolomyces roseus)、香气掷孢酵母(S.odorus)、佛地克鲁维酵母(Kluyveromyces veronae)、和出芽短梗霉(Aureobasidium pollulans)。特别感兴趣的是有色微生物。
有许多方法可以在基因稳定维持和表达的条件下将编码毒素的B.t.基因导入目的宿主。这些方法对于本领域的技术人员是众所周知的，并描述于例如美国专利5,135,867(此处引用作为参考)。细胞的处理如上所述，可以对表达B.t.毒素的B.t.或重组细胞进行处理，以延长毒素活性和稳定细胞。形成的杀虫微囊在细胞结构中包含B.t.毒素，该细胞结构经稳定化处理并在微囊应用于目的害虫环境时可保护毒素。合适的宿主细胞可以包括原核细胞或真核细胞，通常局限于那些不产生对高等有机体(诸如哺乳动物)有毒的物质的细胞。然而，当对高等有机体有毒的物质是不稳定的，或者应用水平低得足以避免任何可能的对哺乳动物宿主的毒性时，可以使用产生有毒物质的有机体。作为宿主，特别感兴趣的是原核生物和低等真核生物，诸如真菌。
细胞通常是完整的，并在处理时基本处于繁殖形式而非孢子形式，但是在一些情况中可以采用孢子。
微生物细胞，如含有B.t.毒素基因的微生物的处理，可以通过化学或物理的方法，或者通过化学和/或物理方法的组合进行，只要该技术不损害毒素的特性，并且不减小细胞保护毒素的能力即可。化学试剂的范例是卤化试剂，特别是原子编号17-80的卤素。更具体的说，碘可以在温和条件下应用足够时间以实现期望的结果。其它合适的技术包括用醛，诸如戊二醛；抗感染药，诸如洁尔灭和氯化十六烷基吡啶鎓；醇，诸如异丙醇和乙醇；各种组织学固定剂，诸如鲁戈氏碘、布安氏(Bouin)固定剂、各种酸和Helly固定剂(参阅Humason和L.Gretchen，动物组织技术(Animal Tissue Techniques)，W.H.Freemanand Company，1967)的处理；或者物理(热)和化学试剂组合处理，从而当细胞施用到宿主环境时，可保护并延长细胞内产生的毒素的活性。物理方法的范例是诸如γ辐射和X辐射等短波辐射、冷冻、UV照射、冻干等等。美国专利4,695,455和4,695,462中公开了处理微生物细胞的方法，两篇专利此处引用作为参考。
增强的结构稳定性通常可增强细胞对环境条件的抵抗力。当杀虫剂以前形式使用时，选择的细胞处理方法应当不抑制目的害虫病原体将杀虫剂前形式加工成成熟形式的过程。例如甲醛使蛋白质交联，而且能够抑制多肽杀虫剂前形式的加工过程。处理方法应当至少保留毒素生物利用度或生物活性的实质性部分。
选择用于生产目的的宿主细胞中特别感兴趣的特征包括，易于将B.t.基因导入宿主、表达系统的有效性、表达效率、杀虫剂在宿主中的稳定性、和存在辅助遗传能力。作为杀虫剂微囊使用的感兴趣的特征包括，对杀虫剂的保护质量，诸如厚的细胞壁、色素沉着、和包涵体的细胞内包装或形成；在水性环境中的存活；无哺乳动物毒性；对害虫取食的吸引力；易于杀死和固定而不损伤毒素；等等。其它考虑包括易于配制和操作、经济、储存稳定性、等等。细胞的培养包含B.t.杀虫基因的细胞宿主可以在任何便利的营养培养基中进行培养，优选其中DNA构建物可提供用于选择性培养基的选择性优势，使得所有或基本上所有的细胞都保留B.t.基因。然后可以以传统方法收获这些细胞。或者，可以在收获前对细胞进行处理。
本发明的B.t.细胞可以使用标准培养基和发酵技术进行培养。在发酵循环完成后，可以使用本领域众所周知的方法，首先从发酵液中分离B.t.孢子和晶体，从而收获细菌。通过加入表面活性剂、分散剂、惰性载体、和其它有助于特殊目的害虫的操作和应用的成分，回收的B.t.孢子和晶体可以配制成湿粉、浓缩液、颗粒、或其它制剂。这些制剂和应用步骤在本领域是众所周知的。配制可以将配制的含有引诱剂和B.t.隔离群孢子和晶体、或包含可由此处公开的B.t.隔离群得到的基因的重组微生物的诱饵颗粒应用于土壤。还可以将配制的产品作为种子覆料或根部处理或作物生长周期晚期的完整植株处理应用。植物和土壤的B.t.细胞处理可以采用湿粉、颗粒、或粉尘，与多种惰性物质诸如无机矿物质(叶硅酸盐(phyllosilicate)、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐、等等)或植物材料(玉米穗轴粉、稻壳、胡桃壳、等等)混合使用。制剂可以包括扩散-增稠佐剂、稳定剂、其它杀虫添加剂、或表面活性剂。液体制剂可以是基于水的或非水的，并可采用泡沫、凝胶、悬浮液、可乳化浓缩物等等形式。成分可以包括流变剂、表面活性剂、乳化剂、分散剂、或聚合物。
本领域技术人员可以理解，杀虫剂浓度将由于具体制剂的性质广泛变化，特别是可以作为浓缩物或直接使用。杀虫剂将以至少1％(以重量计)存在，而且可以是100％(以重量计)。干燥制剂通常含有大约1-95％(以重量计)的杀虫剂，而液体制剂通常是在液相中含约1-60％(以重量计)。含有细胞的制剂通常含有大约102-大约104个细胞/mg。这些制剂将以每公顷大约50mg(液体的或干燥的)-1kg或更多的量施用。
通过喷、撒、洒、等等，可以将制剂应用于害虫环境，例如土壤和叶片上。突变体本发明隔离群的突变体可以通过本领域众所周知的步骤产生。例如，使用甲烷磺酸乙酯(EMS)对隔离群进行诱变，可以得到不产孢子的突变体。使用紫外线和亚硝基胍，通过本领域众所周知的步骤也可以产生突变体。
有较小百分数的不产孢子突变体将保持完整而且在长时间发酵期间不溶解；这些菌株称为溶解阴性(-)。溶解阴性菌株可以，通过在摇瓶培养基中筛选不产孢子的突变体并选择那些仍然完整并在发酵结束时含有毒素晶体的突变体，进行鉴定。溶解阴性菌株适合于进行细胞处理，从而得到受保护的被囊毒素蛋白质。
为了制备上述不产孢子的突变体的噬菌体抗性变体，取一些噬菌体裂解液涂在琼脂培养基上并干燥。然后取一些噬菌体敏感型细菌菌株直接涂在已经干燥的裂解液上并干燥。将平板于30℃温育。温育2天后，可以在琼脂上看到大量菌落。挑取这些菌落中的一些，并在琼脂培养基平板上进行传代培养。通过与噬菌体裂解液的交叉划线，测试这些表观抗性培养物的抗性。用噬菌体裂解液在平板上划一条线并干燥。然后用推测的抗性培养物划线，与噬菌体线交叉。于30℃温育过夜后，抗性细菌培养物在与噬菌体线交叉的任何地方显示不溶解。然后通过在琼脂培养基平板上涂一层抗性培养物的菌苔，再一次确认噬菌体抗性。敏感菌株也以相同方式进行涂板，作为阳性对照。干燥后，滴一滴噬菌体裂解液在平板中央并干燥。于30℃温育24小时后，滴加有噬菌体裂解液的区域内抗性培养物显示不溶解。
下面是例示本发明实践步骤的实施例。这些实施例不应当理解为限制。除非另有注释，所有百分比以重量计，而所有溶剂混和比例以体积计。
实施例实施例1-本发明B.t.隔离群的培养B.t.隔离群或其突变体的传代培养物，可以用于接种下面的培养基，即蛋白胨、葡萄糖、盐培养基。
细菌用蛋白胨 7.5 g/l葡萄糖 1.0 g/lKH2PO43.4 g/lK2HPO44.35 g/l盐溶液 5.0 ml/lCaCl2溶液 5.0 ml/lpH 7.2盐溶液(100ml)MgSO4·7H2O 2.46gMnSO4·H2O 0.04gZnSO4·7H2O 0.28gFeSO4·7H2O 0.40gCaCl2溶液(100ml)CaCl2·2H2O 3.66g将盐溶液和CaCl2溶液过滤除菌，并在接种时加到经高温灭菌的培养基中。烧瓶于30℃在旋转摇床上以200rpm温育64小时。
上述步骤可以通过本领域众所周知的步骤容易的放大至大发酵罐。
可以通过本领域众所周知的步骤，分离在上述发酵中得到的B.t.芽孢和/或晶体。经常使用的步骤是对收获的发酵液进行分离技术，如离心。实施例2-形成了孢子的苏云金芽孢杆菌培养物对玉米根虫的活性将PS80JJ1、PS149B1、或PS167H2在液体培养基中在摇瓶中培养至芽孢形成，并通过离心沉淀。将培养物沉淀重悬于水，并在上述表面施药生物检测(top load bioassay)中测试针对玉米根虫的活性。通过测光密度法估计培养物沉淀中存在的14kDa和44.3kDa蛋白质的量，并用于计算以LC50表述的比活性。每种天然苏云金芽孢杆菌菌株的活性列于表3(B.t.菌株的WCRW表面施药生物检测)。
表3.B.t.菌株的WCRW表面施药生物检测B.t.菌株LC50(μg/cm2)*95％CL 斜率PS80JJ1 6 4-81.5PS167H2 6 4-91.6PS149B1 8 4-12 1.8CryB细胞空白4％N/AN/A水空白 4％N/AN/A*提供了对照在高剂量下的百分比死亡率实施例3-45kDa的80JJ1蛋白质的蛋白质纯化将1g 80JJ1的冻干粉悬于40ml缓冲液(含有80mM Tris-HCl pH7.8，5mM EDTA，100μM PMSF，0.5μg/ml亮抑酶肽，0.7μg/ml胃酶抑制剂，和40μg/ml苯丁抑制素。将悬浮液进行离心，并弃去产生的上清液。将沉淀清洗5次，每次使用35-40ml上述缓冲液。如上所述，将清洗后的沉淀重悬于10ml溶液(40％ NaBr，5mM EDTA，100μM PMSF，0.5μg/ml亮抑酶肽，0.7μg/ml胃酶抑制剂，和40μg/ml苯丁抑制素)。并置于摇床中75分钟。离心NaBr悬浮液，取出上清，沉淀用40％ NaBr，5mM EDTA，100μM PMSF，0.5μg/ml亮抑酶肽，0.7μg/ml胃酶抑制剂，和40μg/ml苯丁抑制素再次处理。合并上清液(40％NaBr可溶)，并用10mM cAPS pH10.0/1mM EDTA于4℃进行透析。将透析后的提取物进行离心，并除去产生的上清液。将沉淀(40％ NaBr透析沉淀)悬于5ml H2O，并离心。除去产生的上清液。如上所述，将清洗后的沉淀用10ml H2O再一次进行清洗，并离心。将清洗后的沉淀悬于1.5ml H2O，其在SDS-PAGE分析中显示主要含有3条蛋白质条带，表观迁移率为大约47kDa、45kDa、和15kDa。Lowry检测显示，在纯化的这一步，悬浮的40％ NaBr透析沉淀含有大约21mg/ml蛋白质。
使用15％丙烯酰胺凝胶，经SDS-PAGE(U.K.Laemlli自然(Nature)227680)分离沉淀悬浮液中的蛋白质。然后将分离的蛋白质在10mM CAPS pH11.0/10％ MeOH中于100V恒压电泳转移到PVDF膜(Millipore公司)上。1小时后，将PVDF膜在水中简单漂洗，并在0.25％考马斯蓝R-250/50％甲醇/5％醋酸中浸泡3分钟。将染色后的膜在40％ MeOH/5％醋酸中进行脱色。将脱色后的膜于室温晾干(LeGendre等人用于微量测序的蛋白质纯化的实践指南，P.Matsudaira编，Academic出版社，纽约州纽约市)。使用自动化气相Edman降解法(M.W.Hunkapillar、R.M.Hewick、W.L.Dreyer、L.E.Hood酶学方法(Meth.Enzymol.)91399)对膜进行测序。
氨基酸分析揭示，45kDa条带的N末端序列如下Met-Leu-Asp-Thr-Asn(SEQ ID NO1)。
同样分析了47kDa条带并测定了N末端氨基酸序列，与SEQ ID NO1的5氨基酸序列相同。因此，47kDa肽和45kDa肽的N末端氨基酸序列是相同的。
此氨基酸序列还对应于由PS80JJ1芽孢/晶体粉末的45kDa肽使用另一种纯化方案得到的序列，其N末端序列如下Met-Leu-Asp-Thr-Asn-Lys-Val-Tyr-Glu-Ile-Ser-Asn-Leu-Ala-Asn-Gly-Leu-Tyr-Thr-Ser-Thr-Tyr-Leu-Ser-Leu(SEQ ID NO2).实施例4-PS80JJ1的14kDa肽的纯化将0.8ml白色透析悬浮液(大约21mg/ml，含有47kDa、45kDa、和15kDa肽)溶于10ml 40％ NaBr，并加入0.5ml 100mM EDTA。大约18小时(过夜)后，得到白色不透明的悬浮液。离心收集并弃去。将上清液在Centricon-30(Amicon公司)中浓缩至终体积大约15ml。将滤出液用水通过过滤透析进行清洗并置于冰上，最终形成乳白色悬浮液。将悬浮液进行离心，分离并保存沉淀和上清液。然后将沉淀悬于1.0ml水(大约6mg/ml)。SDS-PAGE分析显示，沉淀含有基本纯的15kDa蛋白质。
测定出其N末端氨基酸序列是Ser-Ala-Arg-Glu-Val-His-Ile-Glu-Ile-Asn-Asn-Thr-Arg-His-Thr-Leu-Gln-Leu-Glu-Ala-Lys-Thr-Lys-Leu(SEQ ID NO3).实施例5-蛋白质的生物检测透析后的80JJ1的NaBr提取物(含有47kDa、45kDa、和15kDa肽)的不溶部分制备物，在针对玉米幼芽根叶甲的生物检测中展示显著的毒性活性。实施例6-PS149B1的45kDa蛋白的蛋白质纯化和定性分析将P1沉淀重悬于2倍体积/单位净重的去离子水，并加入9倍体积的40％(w/w)NaBr水溶液。这一步和所有随后操作都在冰上或于4-6℃进行。30分钟后，将悬浮液用36倍体积的冷水进行稀释，并以25,000xg离心30分钟，以分离沉淀和上清液。
将产生的沉淀重悬于1-2倍体积的水，并铺在20-40％(w/w)NaBr梯度上，以8,000xg离心100分钟。回收位于大约32％(w/w)NaBr的薄层(“包涵体”，或INC)，并使用截留MW 6-8kDa的透析膜在水中透析过夜。25,000×g离心回收颗粒物质，重悬于水中，分装，并通过Lowry法和SDS-PAGE进行蛋白质检测。
将产生的上清液使用Centricon-10浓缩器浓缩3-4倍，然后使用截留MW 6-8kDa的透析膜在水中透析过夜。以25,000xg离心回收颗粒物，重悬于水，分装，并通过Lowry法和SDS-PAGE进行蛋白质检测。此部分称为P1.P2。
使用15％丙烯酰胺凝胶，经SDS-PAGE(U.K.Laemlli，见上文)分离沉淀悬浮液中的肽。然后将分离的蛋白质在10mM CAPS pH11.0/10％ MeOH中于100V恒压电泳转移到PVDF膜(Millipore公司)上。1小时后，将PVDF膜在水中简单漂洗，并在0.25％考马斯蓝R-250/50％甲醇/5％醋酸中浸泡3分钟。将染色后的膜在40％ MeOH/5％醋酸中进行脱色。将脱色后的膜于室温晾干(LeGendre等人，见上文)。使用自动化气相Edman降解法(M.W.Hunkapillar等人，见上文)对膜进行测序。
蛋白质分析揭示，存在两种主要的多肽，分子量为47kDa和14kDa。分子量是与已知分子量的标准多肽对照进行测量的。此方法只提供了真正分子量的估计值。来自PS149B1的47kDa条带与来自PS80JJ1的47kDa蛋白质在SDS-PAGE上以难以区分开的方式迁移。同样的，来自PS149B1的14kDa条带与来自PS167H2和PS80JJ1的14kDa条带在SDS-PAGE上也以难以区分开的方式迁移。除了这两种估计分别在考马斯染色物质中占25-35％(47kDa)和35-55％(15kDa)的多肽，还存在包含那些MW估测值46kDa、130kDa、和70kDa的次要条带。
蛋白质分析揭示，INC部分含有MW 47kDa的单一多肽，而P1.P2部分含有MW 14kDa的单一多肽。由P1回收这些多肽的产率大于50％。
经纯化的来自PS149B1的47kDa蛋白质的N末端氨基酸序列是Met-Leu-Asp-Thr-Asn-Lys-Val-Tyr-Glu-Ile-Ser-Asn-His-Ala-Asn-Gly-Leu-Tyr-Ala-Ala-Thr-Tyr-Leu-Ser-Leu(SEQ ID NO4).
经纯化的来自PS149B1的14kDa蛋白质的N末端氨基酸序列是Ser-Ala-Arg-Glu-Val-His-Ile-Asp-Val-Asn-Asn-Lys-Thr-Gly-His-Thr-Leu-Gln-Leu-Glu-Asp-Lys-Thr-Lys-Leu-Asp-Gly-Gly-Arg-Trp-Arg-Thr-Ser-Pro-Xaa-Asn-Val-Ala-Asn-Asp-Gln-Ile-Lys-Thr-Phe-Val-Ala-Glu-Ser-Asn(SEQ ID NO5).实施例7-PS167H2的45kDa和14kDa毒素的氨基酸序列经纯化的来自PS167H2的45kDa蛋白质的N末端氨基酸序列是Met-Leu-Asp-Thr-Asn-Lys-Ile-Tyr-Glu-Ile-Ser-Asn-Tyr-Ala-Asn-Gly-Leu-His-Ala-Ala-Thr-Tyr-Leu-Ser-Leu(SEQ ID NO6).
经纯化的来自PS167H2的14kDa蛋白质的N末端氨基酸序列是Ser-Ala-Arg-Glu-Val-His-Ile-Asp-Val-Asn-Asn-Lys-Thr-Gly-His-Thr-Leu-Gln-Leu-Glu-Asp-Lys-Thr-Lys-Leu(SEQ ID NO7).
这些氨基酸序列可以与由80JJ1芽孢/晶体粉末的47kDa肽得到的N末端序列(SEQ ID NO1)和由80JJ1芽孢/晶体粉末的14kDa肽得到的N末端序列(SEQ ID NO3)进行比较。
显然，45-47kDa蛋白质是高度相关的，14kDa蛋白质也是高度相关的。实施例8-蛋白质的生物检测进行经纯化的来自PS149B1的蛋白质部分针对玉米幼芽根叶甲的生物检测，发现它们在组合使用时展示显著的毒性活性。事实上，这一组合使用恢复了在最初的制备物(P1)中记录的活性。下列生物检测数据组显示了百分比死亡率并论证了此效果。
表4.浓度(μg/cm2) P1 INC P1.P2 INC+P1.P230088，100，9419 13 10010094，50，63 31 38 9433.3 19，19，44 38 13 5011.1 13，56，25 12 31 133.70，50，0 0 31 131.213，43，12 0 12 190.46，12，6 25 19 6实施例9-来自苏云金芽孢杆菌PS80JJ1菌株的新的δ-内毒素基因的分子克隆、表达、和DNA序列分析由生长至600nm光密度为1.0的苏云金芽孢杆菌(B.t.)细胞制备总细胞DNA。通过离心沉淀细胞，并重悬于原生质体缓冲液(0.3M蔗糖/25mM Tris-Cl[pH8.0]/25mM EDTA，加入20mg/ml溶菌酶)。于37℃温育1小时后，通过两个冻融循环使原生质体裂解。向完全裂解液中加入9倍体积的溶液(0.1M NaCl/0.1％ SDS/O.1M Tris-Cl)。用酚∶氯仿(1∶1)对澄清的裂解液进行两次抽提。加入2倍体积的乙醇沉淀核酸，并经离心沉淀。将沉淀重悬于TE缓冲液，并加入RNA酶至终浓度50μg/ml。于37℃温育1小时后，将溶液用苯酚∶氯仿(1∶1)和TE饱和的氯仿各提取1次。通过加入1/10体积的3M NaOAc和2倍体积的乙醇从液相中沉淀DNA。通过离心沉淀DNA，用70％的乙醇清洗，干燥，并重悬于TE缓冲液。
根据N末端肽序列数据，设计了用于PS80JJ1的45kDa毒素编码基因的寡核苷酸探针。29个碱基的寡核苷酸探针的序列是5′-ATG YTW GAT ACW AAT AAA GTW TAT GAA AT-3′(SEQ ID NO8)如上所示，此寡核苷酸在四个位置是混和的。此探针用32P进行了放射性标记，并用于经各种内切核酸酶消化的PS80JJ1总细胞DNA的Southern印渍的标准条件杂交。表5所示的来自这些实验的代表性放射自显影数据显示了与44.3kDa毒素寡核苷酸探针(SEQ ID NO8)具有序列同源性的DNA限制性片段的大小。表5.在Southern印渍上与44.3kDa毒素基因寡核苷酸探针(SEQ IDNO8)在标准条件下杂交的PS80JJ1细胞DNA片段的RFLP限制酶 大致片段大小(kbp)EcoRI 6.0HindIII8.3KpnI 7.4PstI 11.5XbaI 9.1在这些分析中鉴定的这些DNA片段包含PS80JJ1的45kDa毒素基因的全部或片段。正如预测的(见下文表6)，表5中杂交DNA片段的大致大小符合与其它实验中使用的PS80JJ1的45kDa毒素亚基因探针杂交的PS80JJ1片段子集的大小。
由经Sau3AI部分消化的PS80JJ1 DNA构建基因文库。将部分限制性消化物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离。将9.3-23kbp的DNA片段由凝胶上切下，由凝胶片电洗脱，在Elutip-D离子交换柱(Schleicher andSchuell，Keene，NH)上进行纯化，并通过乙醇沉淀回收。将Sau3AI插入片段连接到经BamHI消化的LambdaGem-11(Promega，Madison，WI)中。包装重组噬菌体，并铺在E.coli KW251细胞上。通过上述寡核苷酸探针的杂交筛选噬菌斑。将杂交噬菌体进行噬菌斑纯化，并感染E.coli KW251细胞的液体培养物，通过标准步骤进行DNA分离(Maniatis等人，见上文)。
Southern印渍分析揭示，一个重组噬菌体分离物含有的大约4.8kbp的XbaI-SacI条带与PS80JJ1毒素基因探针发生杂交。PS80JJ1毒素基因侧翼的SacI位点是噬菌体载体的克隆位点，而侧翼的XbaI位点位于PS80JJ1 DNA插入片段内。通过标准方法，将此DNA限制性片段亚克隆到pBluescript S/K(Stratagene，San Diego，CA)中，用于序列分析。产生的质粒称为pMYC2421。同样将DNA插入片段亚克隆到pHTBlueII(一种大肠杆菌/苏云金芽孢杆菌穿梭载体，含有pBluescript S/K(Stratagene，La Jolla.CA)和来自B.t.固有质粒的复制起点，[D.Lereclus等人(1989)FEMS微生物学快报(FEMSMicrobiology Letters)60211-218]中产生pMYC2420。
根据N末端肽序列数据，设计了用于PS80JJ1的14kDa毒素编码基因的寡核苷酸探针。该28个碱基的寡核苷酸探针的序列是5′GW GAA GTW CAT ATW GAA ATW AAT AAT AC 3′(SEQ ID NO29).
如上所示，此寡核苷酸在四个位置是混和的。此探针用32P进行放射性标记，并用于经各种内切核酸酶消化的PS80JJ1总细胞和pMYC2421DNA的Southern印渍的标准条件杂交。这些RFLP作图实验证明，14kDa毒素的编码基因位于与含44.3kDa毒素N末端编码序列相同的基因组EcoRI片段上。
为了测试PS80JJ1毒素基因在B.t.中的表达，通过电穿孔用pMYC2420转化无晶体(Cry-)B.t.宿主CryB(A.Aronson，PurdueUniversity，West Lafayette，IN)。通过SDS-PAGE分析证明了由pMYC2420编码的两种大约14和44.3kDa的PS80JJ1毒素的表达。对来自重组CryB[pMYC2420]菌株MR536的毒素晶体制备物进行检测，显示具有针对玉米幼芽根叶甲的活性。
使用ABI373自动化测序系统和相关软件，对pMYC2421编码的PS80JJ1毒素基因进行测序。包含两个开放阅读框架和侧翼核苷酸序列的完整基因座序列显示于SEQ ID NO30。14kDa毒素基因的终止密码子位于44.3kDa毒素基因起始密码子上游(5’)121个碱基对处(图2)。与编码杀虫蛋白的其它毒素基因相比，PS80JJ1的14kDa毒素开放阅读框架核苷酸序列(SEQ ID NO31)、44.3kDa毒素开放阅读框架核苷酸序列(SEQ ID NO10)、和相应的推导氨基酸序列(SEQ ID NO32和SEQ ID NO11)是新的。
由此，编码PS80JJ1的14kDa毒素的核苷酸序列显示于SEQ ID NO31。PS80JJ1的14kDa毒素的推导氨基酸序列显示于SEQ ID NO32。同时编码PS80JJ1的14和54kDa毒素的核苷酸序列以及侧翼序列显示于SEQ ID NO30。这些序列的相互关系显示于图2。
包含质粒pMYC2421的E.coli NM522的传代培养物于1996年3月28日保存于专利培养物收藏中心(NRRL)的永久收藏中心，RegionalResearch Center，1815 North University Street，Peoria，Illinois，61604美国。编号是NRRL B-21555。实施例10-来自苏云金芽孢杆菌PS149B1和PS167H2菌株的其它新的δ-内毒素基因的RFLP和PCR分析另外两种对玉米根虫有活性的菌株PS149B1和PS167H2，也产生包含大约14和45kDa多肽的伴孢蛋白质晶体。使用Southern杂交和部分DNA序列分析，检验了这些毒素与80JJ1毒素的相关性。如上所述由这些B.t.菌株提取DNA，并使用14kDa毒素寡核苷酸探针(SEQ ID NO29)和80JJ1的44.3kDa毒素基因编码序列的大约800bp PCR片段进行标准Southern杂交。表6所示的来自这些实验的RFLP数据显示了与44.3kDa毒素具有序列同源性的DNA限制性片段的大小。表7所示的来自这些实验的RFLP数据显示了与14kDa毒素具有序列同源性的DNA限制性片段的大小。
3种菌株都展示独特的RFLP模式。来自PS149B1或PS167H2的杂交DNA片段包含与PS80JJ1的44.3kDa毒素具有序列同源性的完整或部分毒素基因。
3种菌株都展示独特的RFLP模式。来自PS149B1或PS167H2的杂交DNA片段包含与PS80JJ1的14kDa毒素基因具有序列同源性的完整或部分毒素基因。
使用根据PS80JJ1的44.3kDa毒素基因序列设计的正向和反向寡核苷酸引物对，通过PCR扩增PS149B1或PS167H2中的部分毒素基因。对于PS149B1，使用了下面的引物对正向5′-ATG YTW GAT ACW AAT AAA GTW TAT GAA AT-3′(SEQ ID NO8)反向5′-GGA TTA TCT ATC TCT GAG TGT TCT TG-3′(SEQ ID NO9)对于PS167H2，使用了相同的引物对。使用ABI373自动化测序系统和相关软件，对这些PCR衍生片段进行了测序。获得的部分基因和肽序列显示于SEQ ID NO12-15。这些片段包含存在于B.t.菌株PS149B1或PS167H2中对玉米根虫有活性的新毒素的部分核苷酸编码序列和肽序列。实施例11-来自苏云金芽孢杆菌PS149B1和PS167H2菌株的新的δ-内毒素基因的分子克隆和DNA序列分析如关于PS80JJ1所述，由PS149B1和PS167H2菌株提取总细胞DNA。如上所述，分别在Lambda-Gem11中构建两种菌株经大小分离后的Sau3A部分限制性片段的基因文库。包装重组噬菌体，并铺在E.coli KW251细胞上。通过与44kDa毒素基因特异的寡核苷酸探针的杂交筛选噬菌斑。将杂交噬菌体进行噬菌斑纯化，并感染E.coli KW251细胞的液体培养物，通过标准步骤进行DNA分离(Maniatis等人，见上文)。
对于PS167H2，Southern印渍分析揭示，一个重组噬菌体分离物的大约4.0-4.4kbp的HindIII条带与PS80JJ1的44kDa毒素基因5’寡核苷酸探针(SEQ ID NO8)发生杂交。通过标准方法，将此DNA限制性片段亚克隆到pBluescript S/K(Stratagene，San Diego，CA)中，用于序列分析。同样将该片段亚克隆到高拷贝数的穿梭载体pHT370(0.Arantes、D.Lereclus基因(Gene)108115-119)中，用于苏云金芽孢杆菌中的表达分析(见下文)。产生的重组的、高拷贝数的双功能质粒称为pMYC2427。
使用ABI373自动化测序系统和相关软件，对pMYC2427编码的PS167H2毒素基因进行了测序。包含两个开放阅读框架和侧翼核苷酸序列的完整基因座序列显示于SEQ ID NO34。14kDa毒素基因的终止密码子位于44kDa毒素基因起始密码子上游(5’)107个碱基对处(图2)。与编码杀虫蛋白质的其它已知毒素基因相比，PS167H2的14kDa毒素编码序列(SEQ ID NO35)、44kDa毒素编码序列(SEQ ID NO37)、和相应的推导氨基酸序列(SEQ ID NO36和SEQ ID NO38)是新的。毒素基因的排列方式与PS80JJ1的14和44kDa毒素相似，而且具有一些同源性。
包含质粒pMYC2427的E.coli NM522的传代培养物于1997年3月26日保存于专利培养物收藏中心(NRRL)的永久收藏中心，RegionalResearch Center，1815 North University Street，Peoria，Illinois，61604美国。编号是NRRL B-21672。
对于PS149B1，使用PS80JJ1的40kDa寡核苷酸5’探针(SEQ ID NO8)的Southern印渍分析证明大约5.9kbp的ClaI DNA片段可发生杂交。将PS149B1基因组DNA的完全ClaI消化物在琼脂糖凝胶上进行分离，并亚克隆到pHTBlueII中。同样将片段亚克隆到高拷贝数的穿梭载体pHT370(O.Arantes、D.Lereclus基因(Gene)108115-119)中，用于苏云金芽孢杆菌中的表达分析(见下文)。产生的重组的、高拷贝数的双功能质粒称为pMYC2429。
使用ABI自动化测序系统和相关软件，对pMYC2429编码的PS49B1毒素基因进行了测序。包含两个开放阅读框架和侧翼核苷酸序列的完整基因座序列显示于SEQ ID NO39。14kDa毒素基因的终止密码子位于44kDa毒素基因起始密码子上游(5’)108个碱基对处(图2)。与编码杀虫蛋白质的其它已知毒素基因相比，PS149B1的14kDa毒素编码序列(SEQ ID NO40)、44kDa毒素编码序列(SEQ ID NO42)、和相应的推导氨基酸序列(SEQ ID NO41和SEQ ID NO43)是新的。毒素基因的排列方式与PS80JJ1和PS167H2的14和44kDa毒素相似，而且具有一些同源性。这3种毒素操纵子共同构成杀虫毒素新家族。
包含pMYC2429的E.coli NM522的传代培养物于1997年3月26日保存于专利培养物收藏中心(NRRL)的永久收藏中心，Regional ResearchCenter，1815 North University Street，Peoria，Illinois，61604美国。编号是NRRL B-21673。实施例12-用于鉴定并克隆具有针对玉米根虫的活性的新毒素的PCR扩增使用Genetics Computer Group序列分析软件Pileup，以缺口权＝3.00，缺口长度权＝0.10，对来自PS80JJ1、PS149B1、和PS167H2的三种新的大约45kDa玉米根虫活性毒素的DNA和肽序列(SEQ ID NO12-15)进行比对。将序列比对用于鉴定保守肽序列，该序列被用于设计很可能与编码此毒素新家族成员的基因可杂交的寡核苷酸引物。这些引物可以用于PCR扩增这些及相关毒素基因的诊断性DNA片段。根据各种序列可能设计大量的引物，此处提供了4种作为范例。这些肽序列是
Asp-Ile-Asp-Asp-Tyr-Asn-Leu(SEQ ID NO16)Trp-Phe-Leu-Phe-Pro-Ile-Asp(SEQ ID NO17)Gln-Ile-Lys-Thr-Thr-Pro-Tyr-Tyr(SEQ ID NO18)Tyr-Glu-Trp-Gly-Thr-Glu(SEQ ID NO19).对应的核苷酸序列是5′-GATATWGATGAYTAYAAYTTR-3′(SEQ ID NO20)5′-TGGTTTTTRTTTCCWATWGAY-3′(SEQ ID NO21)5′-CAAATHAAAACWACWCCATATTAT-3′(SEQ ID NO22)5′-TAYGARTGGGGHACAGAA-3′(SEQ ID NO23).在热循环反应中用于聚合酶扩增的正向引物是根据SEQ ID NO20和21的核苷酸序列设计的。反向引物是根据SEQ ID NO22和23的反向互补序列设计的5′-ATAATATGGWGTWGTTTTDATTTG-3′(SEQ ID NO24)5′-TTCTGTDCCCCAYTCRTA-3′(SEQ ID NO25).这些引物可以组合用于扩增鉴定新玉米根虫毒素编码基因的下列大小的DNA片段(表8)。
表8.可用新玉米根虫活性毒素特异的引物扩增的诊断性DNA片段的预测大小(碱基对)引物对(SEQ ID NO) DNA片段大小(bp)20+2449520+2559421+2447121+25580相似的，编码新的玉米根虫活性毒素的完整基因可以在热循环反应中使用根据开放阅读框架侧翼的DNA序列设计的引物通过聚合酶扩增分离得到。对于PS80JJ1的44.3kDa毒素，设计并合成了这样一对引物，用于扩增包含完整毒素编码序列的诊断性1613bp DNA片段。这些引物是
正向5′-CTCAAAGCGGATCAGGAG-3′(SEQ ID NO26)反向5′-GCGTATTCGGATATGCTTGG-3′(SEQ ID NO27).对于PS80JJ1的14kDa毒素的PCR扩增，编码N末端肽序列的寡核苷酸(SEQ ID NO29)可以与基于PS80JJ1毒素基因座中的序列的多种反向寡核苷酸引物组合使用。这样一种反向引物是5′CATGAGATTTATCTCCTGATCCGC 3′(SEQ ID NO33).当用于标准PCR反应时，此引物对扩增包含完整14kDa毒素编码序列和对应于121个碱基的基因间隔区的一些3’侧翼序列和部分44.3kDa毒素基因的诊断性1390bp DNA片段。当与14kDa正向引物组合使用时，PCR将产生诊断性的322bp DNA片段。实施例13-克隆剂量应答生物检测将PS80JJ1毒素操纵子由pMYC2421亚克隆到pHT370中，用于与由PS149B1和PS167H2克隆的重组毒素直接比较生物活性。产生的重组的、高拷贝数的双功能质粒称为pMYC2426。
包含质粒pMYC2426的E.coli NM522的传代培养物于1997年3月26日保存于专利培养物收藏中心(NRRL)的永久收藏中心，RegionalResearch Center，1815 North University Street，Peoria，Illinois，61604美国。编号是NRRL B-21671。
为了测试PS80JJ1、PS149B1、和PS167H2毒素基因在B.t.中的表达，通过电穿孔分别用pMYC2426、pMYC2427、和pMYC2429转化无晶体(Cry-)B.t.宿主CryB(A.Aronson，Purdue University，WestLafayette，IN)。产生的重组菌株依次称为MR543(CryB[pMYC2426])、MR544(CryB[pMYC2427])、和MR546(CryB[pMYC2429])。通过每种重组菌株的SDS-PAGE分析证明了大约14和44kDa两种毒素的表达。
进行了来自重组菌株的毒素晶体制备物针对玉米幼芽根叶甲的检测。它们的食物用山梨酸和SIGMA pen-strep-ampho-B进行了改良。将样品以50μl悬浮液/cm2食物表面积的比率进行表面施药。生物检测使用新生玉米幼芽根叶甲幼虫于大约25℃进行4天。表9列出了克隆(沉淀)的百分比死亡率和表面施药LC50估测值。dH2O对照产生7％的死亡率。
通过测光密度法估计晶体制备物中存在的14kDa和44.3kDa蛋白质的量，并用于计算以LC50表述的比活性。表10(B.t.克隆的WCRW表面施药生物检测)列出了克隆(沉淀)的LC50估测值。
表10.B.t.克隆的WCRW表面施药生物检测B.t.克隆B.t.亲本菌株LC50(μg/cm2)* 95％CL 斜率MR543 PS80JJ1 37 17-366* 0.79MR544 PS167H2 10 6-141.6MR546 PS149B1 8 4-121.5N/A CryB细胞空白 4％ N/A N/AN/A 水空白4％ N/A N/A*提供了高剂量下的百分比死亡率作为对照**90％CL实施例14-PS80JJ1二元毒素操纵子中14和44kDa多肽的突变分析本发明的二元毒素基因在其野生型状态在操纵子中的排列方式通常是，14kDa蛋白质基因首先转录，随后是45kDa蛋白质基因转录。这些基因被相对短的非编码区隔开。代表性ORF显示于SEQ ID NO30、SEQ ID NO34、和SEQ ID NO39。
为了研究单个14和44.3kDa晶体蛋白质对玉米根虫活性的贡献，在分开的实验中进行PS80JJ1操纵子中每个基因的突变，以消除一种蛋白质的表达。然后在B.t.中表达完整基因，并测试重组蛋白质针对玉米根虫的活性。
首先，通过对位于开放阅读框架的第387位碱基的EcoRI位点截短，进行了pMYC2421上编码的44.3kDa基因的突变。此截短和随后与载体序列的连接产生了编码大约24kDa假设融合蛋白的开放阅读框架。将产生的编码完整14kDa基因和截短45kDa基因的操纵子亚克隆到高拷贝数的穿梭载体pHT370(0.Arantes、D.Lereclus基因(Gene)108115-119)中，用于在苏云金芽孢杆菌中的表达分析。通过电穿孔用产生的质粒pMYC2424转化无晶体(Cry-)B.t.宿主CryB(A.Aronson，Purdue University，West Lafayette，IN)。产生的重组菌株称为MR541。通过MR541的产孢子培养物的SDS-PAGE分析，只检测到了14kDa的PS80JJ1蛋白质。只表达14kDa的PS80JJ1蛋白质的MR541制备物在针对玉米根虫的表面施药生物检测中，没有观察到死亡。
其次，通过在位于开放阅读框架的第11位碱基处的Nrul位点插入含有所有可能的阅读框架形式的终止密码子的寡核苷酸接头，进行了pMYC2421上编码的14kDa基因的突变。此接头的序列是5’TGAGTAACTAGATCTATTCAATTA 3′此接头导入了BglII位点，用于通过BglII限制性消化确认插入。用BglII鉴定了含诱变接头的质粒克隆，并测序确认。将编码14kDa无义突变的操纵子插入片段亚克隆到pHT370中，产生质粒pMYC2425。通过电穿孔用此质粒转化CryB，以产生重组B.t.菌株MR542。如SDS-PAGE分析所示，MR542的产孢培养物中只表达了44.3kDa的PS80JJ1蛋白质。只表达44.3kDa pS80JJ1蛋白质的MR542制备物没有观察到针对玉米根虫的死亡率。实施例15-来自PS149B1的14和44.3kDa多肽在荧光假单胞菌中的单基因异源表达、纯化、和生物检测通过标准DNA克隆方法，分别将来自PS149B1的14kDa和44.3kDa多肽基因插入质粒载体，并转化荧光假单胞菌。只表达PS149B1的14kDa基因的重组荧光假单胞菌菌株称为MR1253。只表达PS149B1的44.3kDa基因的重组荧光假单胞菌菌株称为MR1256。
将单独表达上述二元蛋白质之一的MR1253和MR1256在1L发酵罐中进行培养。然后将部分培养物离心沉淀，用溶菌酶裂解，并用DNaseI处理，以获得半纯的蛋白质包涵体。然后通过于4℃温和摇动1小时，将这些包涵体溶于50mM柠檬酸钠(pH3.3)。14kDa蛋白质可容易的溶于此缓冲液，而44.3kDa蛋白质部分溶解。然后将溶解部分以15,000xg离心20分钟，并保留上清液。
通过离子交换层析进一步纯化14kDa蛋白质。将溶解的14kDa蛋白质结合到Econo-S柱上，并用NaCl 0-1M梯度洗脱。
然后单独或一起(45kDa蛋白质∶14kDa蛋白质摩尔比1∶10)测试层析纯的MR1253(14kDa蛋白质)和溶于柠檬酸钠(pH3.3)的MR1256制备物(45kDa蛋白质)对玉米根虫的活性。观察到每种蛋白质单独的死亡率不超过背景水平(水/对照样品)，但是，它们以上述比例组合在一起时死亡率为87％(见表11)。
实施例16-其它新的14kDa和44.3kDa毒素基因通过总B.t.基因组DNA杂交和RFLP的鉴定使用Qiagen DNEasy 96孔组织试剂盒，由每种隔离群制备总基因组DNA。在印渍之前，通过向80μ1无菌蒸馏水中加入10μl每种DNA样品和10μl 4M NaOH，使96孔板中的DNA变性。将样品于70℃温育1小时，然后向每个孔加入100μl 20xSSC。将PS149B1的总基因组DNA与每组94个样品一起温育，作为阳性杂交对照；并将cryB一总基因组DNA与每组94个样品一起温育，作为阴性杂交对照。使用两个48孔狭线印渍装置(Hoefer Scientific)将每组96个样品加到Magnacharge尼龙膜上，随后用10xSSC清洗2次。将膜于80℃烘烤1小时，并在使用前保持干燥。将膜在标准甲酰胺溶液(50％甲酰胺/5x SSPE/5x Denhardt氏溶液/2％ SDS/100μg/ml单链DNA)中于42℃进行预杂交和杂交。将膜在两种条件下清洗2x SSC/0.1％ SDS，42℃(低严谨度)和0.2x SSC/0.1％ SDS，65℃(中至高严谨度)。将膜用使用正向引物SEQ ID NO8和序列为SEQ ID NO46(5’-GTAGAAGCCAGAACAAGAAGGTATT3’)的反向引物由pMYC2429扩增的PS149B1的44.3kDa基因大约1.3kbp的PCR片段进行探查。探针使用Prime-it II试剂盒(Stratagene)和32P-dCTP进行了放射性标记，在Sephadex柱上纯化，于94℃变性，然后加到新鲜的杂交溶液中。通过将膜暴露于X射线胶片，鉴定了包含与PS149B1探针具有同源性的基因的菌株。
通过阳性杂交反应鉴定了下列菌株PS184M2、PS185GG，PS187G1，PS187Y2，PS201G，PS201HH2，PS242K10，PS69Q，KB54A1-6，KR136，KR589，PS185L12，PS185W3，PS185Z11，PS186L9，PS187L14，PS186FF，PS131W2，PS147U2，PS158T3，PS158X10，PS185FF，PS187F3，PS198H3，PS201H2，PS201L3，PS203G2，PS203J1，PS204C3，PS204G4，PS204I11，PS204J7，PS210B，PS213E8，PS223L2，PS224F2，PS236B6，PS246P42，PS247C16，KR200，KR331，KR625，KR707，KR959，KR1209，KR1369，KB2C-4，KB10H-5，KB456，KB42C17-13，KB45A43-3，KB54A33-1，KB58A10-3，KB59A54-4，KB59A54-5，KB53B7-8，KB53B7-2，KB60F5-7，KB60F5-11，KB59A58-4，KB60F5-15，KB61A18-1，KB65A15-2，KB65A15-3，KB65A15-7，KB65A15-8，KB65A15-12，KB65A14-1，KB3F-3，T25，KB53A71-6，KB65A11-2，KB68B57-1，KB63A5-3，和KB71A118-6.
使用32P标记的探针和此实施例中上述杂交条件，进行了总基因组DNA制备物中新毒素基因的进一步鉴定和分类。如上所述或用QiagenGenomic-tip 20/G制备总基因组DNA，而且在Southern分析中根据用于革兰氏阳性细菌的方案使用了基因组DNA缓冲液组(Qiagen公司，Valencia，CA)。对于Southern印渍，取大约1-2μg经狭线印渍分析鉴定的每种菌株的总基因组DNA，用DraI和NedI进行消化，在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳，并使用标准方法(Maniatis等人)固定在支持尼龙膜上。杂交后，将膜在低严谨度(2x SSC/0.1％ SDS，42℃)下进行清洗，并暴露于胶片。使用BioRad Chemidoc系统软件估计DNA片段大小。利用限制性片段长度多态性将44kDa毒素编码基因分类。表12列出了这些分类。
实施例17-其它二元毒素基因的DNA测序设计简并寡核苷酸用于扩增经上述149B1 PCR产物杂交鉴定的B.t.菌株的完整或部分14和44.3kDa基因。寡核苷酸是根据经来自PS149B1、PS167H2、和PS80JJ1的14kDa或44.3kDa基因比对鉴定的保守序列块设计的。这两种基因的正向引物均设计成以ATG起始密码子开始。反向引物设计成尽可能接近每一相应基因的3’末端。
设计用于扩增14kDa基因的引物如下149DEG1(正向)5′-ATG TCA GCW CGY GAA GTW CAY ATT G-3′(SEQ ID NO47)149DEG2(反向)5′-GTY TGA ATH GTA TAH GTH ACA TG-3′ID NO48)这些引物的扩增产物为大约340bp。
设计用于扩增44.3kDa基因的引物如下149DEG3(正向)5′-ATG TTA GAT ACW AAT AAA RTW TAT G-3′(SEQ ID NO49)149DEG4(反向)5′-GTW ATT TCT TCW ACT TCT TCA TAH GAA G-3′(SEQ ID NO50)这些引物的扩增产物为大约1,100bp。
用于扩增基因产物的PCR条件如下95℃ 1min，1个循环；95℃ 1min，50℃ 2min，72℃ 2min，重复35个循环；72℃ 10min，1个循环。
将PCR产物在1％琼脂糖凝胶上进行分离，并使用Qiaexll试剂盒(Qiagen)由凝胶基质进行纯化。使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen)将产生的纯化片段连接到pCRTOPO克隆载体中。连接后，用一半连接反应液转化XL10 Gold超感受态细胞(Stratagene)。然后通过PCR使用载体引物1212和1233筛选转化体。将包含插入片段的克隆在LB/羧苄青霉素培养基中进行培养，使用Qiagen质粒DNA微量制备试剂盒(Qiagen)制备质粒。然后使用Applied Biosystems的自动化测序系统和相关软件对克隆的PCR衍生片段进行测序。SEQ ID NO51-126列出了与来自PS80JJ1和PS149B1的全型14和44.3kDa毒素相关的其它新的二元毒素基因和多肽的序列。上文的“序列简述”部分提供了这些序列的进一步说明。
使用上述步骤(及下文注明的差异)还对来自其它3种B.t.菌株PS137A、PS201V2、和PS207C3的14kDa型毒素和基因进行了测序。进行了使用149 DEG1(正向)和149DEG2(反向)引物的PCR。这些引物的扩增产物为大约340bp。以下面的条件进行PCR1. 95℃ 3min2. 94℃ 1min3. 42℃ 2min4. 72℃ 3min+5sec/循环5. 第2-4步重复29个循环将PCR产物使用Qia快速凝胶提取试剂盒(Qiagen)进行凝胶纯化，使用TOPO-TA试剂盒(Invitrogen)将纯化片段连接到pCR-TOPO克隆载体中，随后转化XL10-Gold超感受态E.coli细胞(Stratagene)。如上所述制备转化体DNA。如上所述分别获得这3种新菌株的14kDa毒素基因的序列。所附序列表提供了下列核苷酸序列和多肽序列PS137A(SEQ ID NO149和150)、PS201V2(SEQ ID NO151和152)、和PS207C3(SEQ ID NO153和154)。实施例18-PS149B1毒素转基因和植物转化分别设计了14和44.3kDa毒素成分经玉蜀黍密码子使用率优化的合成转基因。合成基因设计成使得鸟嘌呤和胞嘧啶密码子使用达到植物DNA中更通常的水平。优选的植物优化转基因描述于SEQ ID NO127-128。用于两种转基因表达的启动子区域是玉蜀黍遍在蛋白启动子加上玉蜀黍外显子1和玉蜀黍内含子1(A.H.Christensen等人(1992)植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)18675-689)。用于两种转基因的转录终止子是马铃薯蛋白酶抑制剂II(PinII)终止子(G.An等人(1989)植物细胞(Plant Cell)1115-122)。
使用膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)作为植物转化的选择标记。膦丝菌素乙酰转移酶基因(pat)由细菌产绿色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)(P.Eckes等人，1989)分离得到。PAT蛋白质使膦丝菌素或其前体去甲基膦丝菌素乙酰化，赋予对化学合成的膦丝菌素(诸如除草剂草铵膦)的耐受性。乙酰化将膦丝菌素转变成对玉米植物不再有毒的非活性形式。草铵膦是广谱、非全身性、非选择性除草剂。通过将PAT掺入再生培养基或通过将除草剂喷洒到叶子上，可以容易的鉴定耐受草铵膦除草剂的再生玉米组织或单个玉米植株。
为了将鸟嘌呤和胞嘧啶密码子用法修正成植物DNA中更通常的水平，制备了pat基因的合成版本。用于pat基因的启动子是花椰菜花叶病毒35S转录本的CaMV启动子(Pietrzak等人，1986)。转录终止子是CaMV 35S终止子。
为对玉蜀黍组织转化，由完整质粒切下包含PS149B1的14和44.3kDa和pat选择标记编码序列以及表达必须的调控成分的线性部分DNA。将称为插入片段的此线性部分DNA用于转化过程。
基本如Klein等人(1987)所述，通过微弹轰击法，使用BioRad制造的Biolistics PDS-100He基因枪，获得了包含PS149B1的14kDa和44.3kDa转基因的玉蜀黍植株。将授粉后大约15天后收获的玉米穗分离得到的未成熟胚在愈伤组织初始培养基中培养3-8天。在转化当天，用纯化DNA包被显微钨颗粒，并加速进入培养胚，在此将插入片段DNA掺入细胞染色体。轰击6天后，将轰击胚转移到含草铵膦(Bialaphos)作为选择试剂的愈伤组织初始培养基中。获得健康的抗性愈伤组织，并再次转移到新鲜的选择培养基中，培养大约12周。再生植株，并转移到温室中。总共获得了436株再生植株。采集叶片样品用于分子分析，通过PCR确认转基因的存在，并通过ELISA确认外源蛋白质的表达。然后使用玉米幼芽根叶甲对植株进行全植株生物检测。将阳性植株与近交系杂交，从而由最初的转化植株获得种子。发现这些植株在温室和田间试验中对玉米根虫的伤害都有抵抗力。实施例19-进一步的生物检测如实施例13所述，使用基本表面施药检测方法，检测了来自经实施例16鉴定的菌株的蛋白质制备物对玉米幼芽根叶甲的活性。结果显示于表13。

实施例20-来自苏云金芽孢杆菌PS201L3菌株的新的二元内毒素基因的分子克隆、表达、和DNA序列分析使用Qiagen Genomic-tip 500/G试剂盒和基因组DNA缓冲液组(Qiagen公司，Valencia，CA)，根据用于革兰氏阳性细菌的方案，由在摇瓶培养中生长的细胞制备PS201L3的基因组DNA。由经Sau3AI部分消化的PS20113 DNA构建基因文库。将部分限制性消化物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离。将9.3-23kbp的DNA片段由凝胶上切下，由凝胶片电洗脱，在Elutip-D离子交换柱(Schleicher and Schuell，Keene，NH)上进行纯化，并通过乙醇沉淀回收。将Sau3AI插入片段连接到经BamHI消化的LambdaGem-11(Promega，Madison，WI)中。使用GigapackIII XL包装提取物(Stratagene，La Jolla，CA)包装重组噬菌体，并铺在E.coli KW251细胞上。将噬菌斑浸提到Nytran尼龙转移膜(Schleicher and Schuell，Keene，NH)上，并用二元毒素编码序列的32P-dCTP标记基因探针进行探查。此基因探针是使用基因组PS201L3 DNA模板和寡核苷酸“15kfor1”和“45krev6”扩增得到的大约1.0kb PCR产物。
用于PCR和测序的寡核苷酸的序列如下15kfor1(SEQ ID NO131) ATGTCAGCTCGCGAAGTACAC45krev6(SEQ ID NO132) GTCCATCCCATTAATTGAGGAG将膜与探针于65℃杂交过夜，然后用1xSSPE/0.1％SDS清洗3次。放射自显影鉴定出13个噬菌斑。随后挑取这些噬菌斑，并在1ml SM缓冲液+10μl CHCl3中浸泡过夜。将噬菌体铺在KW251宿主细胞上进行汇合裂解，将6块汇合板浸泡在SM中，并用于大量噬菌体DNA制备。将纯化噬菌体DNA用多种酶进行消化，并进行0.7％琼脂糖凝胶电泳。通过Southern印渍将凝胶转移到Nytran膜上，并用上述相同的PCR扩增DNA片段进行探查。鉴定出大约6.0kb的杂交XbaI条带，并亚克隆到E.coli/B.t.穿梭载体pHT370(0.Arantes、D.Lereclus基因(Gene)108115-119)中，产生pMYC2476。用pMYC2476转化的XL10 Gold超感受态大肠杆菌细胞(Stratagene)命名为MR1506。随后通过电穿孔用pMYC2476转化无晶体CryB，并在DM3+20μg/ml红霉素平板上于30℃进行选择。重组CryB[pMYC2476]称为MR561。
MR1506的传代培养物于2000年6月1日保存于专利培养物收藏中心(NRRL)的永久收藏中心，Regional Research Center，1815 NorthUniversity Street，Peoria，Illinois，61604美国。编号是NRRLB-30298。
通过免疫印渍法检验B.t.菌株MR561中PS201L3二元毒素蛋白质的表达。将细胞在液体NYS-CAA培养基+10μg/ml红霉素中于30℃培养过夜。然后将培养物离心沉淀，将部分细胞沉淀重悬，并进行SDS-PAGE电泳。当分别用PS149B1 14kDa或44kDa特异性抗体进行探查时，Western印渍显示14kDa和44kDa蛋白质。
使用ABI377自动化测序仪进行pMYC2476上编码的毒素基因的DNA测序。PS201L3的14kDa基因的DNA序列显示于SEQ ID NO133。PS201L3的14kDa毒素的推导肽序列显示于SEQ ID NO134。PS201L3的44kDa基因的DNA序列显示于SEQ ID NO135。PS201L3的44kDa毒素的推导肽序列显示于SEQ ID NO136。
下表显示了来自201L3和149B1的二元基因和蛋白质的序列相似性和同一性。使用BESTFIT程序(GCG软件包的一部分)进行了这些比较。BESTFIT使用Smith和Waterman的局部同源性算法(应用数学进展(Advances in Applied Mathematics)2482-489，1981)。
表14201L3相比149B1 ％相似性％同一性14kDa核苷酸序列- 71.114kDa肽序列 63.954.145kDa核苷酸序列- 76.145kDa肽序列 70.962.7实施例21-来自苏云金芽孢杆菌PS187G1、PS201HH2、和KR1369菌株的新的δ-内毒素基因的分子克隆和DNA序列分析由在Luria Bertani(LB)肉汤中生长至可见光600nm光密度为0.5-1.0的苏云金芽孢杆菌PS187G1、PS201HH2、和KR1369菌株制备总细胞DNA。使用Qiagen Genomic-tip 500/G试剂盒和基因组DNA缓冲液组(Qiagen公司，Valencia，CA)，根据用于革兰氏阳性细菌的方案，提取DNA。分别使用PS187G1、PS201HH2、和KR1369总细胞DNA经NdeII部分消化的插入片段在SuperCos1载体(Stratagene)中构建了PS187G1、PS201HH2、和KR1369粘粒文库。用包装的粘粒转染XL1-BlueMR细胞，以获得羧苄青霉素和卡那霉素抗性克隆。对于每种菌株，将576个粘粒集落在96孔板中在1ml LB+100μg/ml羧苄青霉素+50μg/ml卡那霉素中于37℃培养18小时，并将板复制到尼龙滤膜上进行杂交筛选。
由PS187G1、PS201HH2、或KR1369基因组DNA，使用为扩增二元同源物设计的下列引物，扩增得到包含大约1000bp的PS187G1、PS201HH2、或KR1369的14kDa和44kDa毒素操纵子的PCR扩增子15kfor15′-ATG TCA GCT CGC GAA GTA CAC-3′(SEQ ID NO131)45krev65′-GTC CAT CCC ATT AAT TGA GGA G-3′(SEQ ID NO132)将DNA片段使用Qia快速提取试剂盒(Qiagen)进行凝胶纯化。将探针使用32P-dCTP和Prime-it II试剂盒(Stratagene)进行放射性标记，并与集落浸提滤膜一起在杂交水溶液(6x SSPE/5x Denhardt氏溶液/0.1％ SDS/0.1mg/ml变性DNA)中于65℃温育16小时。将集落浸提滤膜用0.5x SSC/0.1％ SDS于室温简单的清洗1次，随后用0.5xSSC/0.1％ SDS于65℃ 10分钟再清洗2次。然后将滤膜暴露于X射线胶片20分钟(PS187G1和PS201HH2)或1小时(KR1369)。每种菌株选择一个与探针强杂交的粘粒克隆，进行进一步的分析。通过使用上述引物的PCR扩增，确认了这些粘粒克隆包含大约1000bp的14kDa和44kDa毒素基因目标。PS187G1的粘粒克隆称为pMYC3106；包含pMYC3106的重组E.coli XL1-Blue MR细胞称为MR1508。PS201HH2的粘粒克隆称为pMYC3107；包含pMYC3107的重组E.coli XL1-Blue MR细胞称为MR1509。KR1369的粘粒克隆称为pMYC3108；包含pMYC3108的重组E.coliXL1-Rlue MR细胞称为MR1510。MR1509和MR1510的传代培养物于2000年8月8日保存于专利培养物收藏中心(NRRL)的永久收藏中心，Regional Research Center，1815 North University Street，Peoria，Illinois，61604美国。编号依次是NRRL B-30330和NRRL B-30331。
使用ABI377自动化测序系统和相关软件，分别对pMYC3106、pMYC3107、和pMYC3108上编码的PS187G1、PS201HH2、和KR1369的14kDa和44kDa毒素基因进行测定。
PS187G1的14kDa和44kDa核苷酸和推导多肽序列显示于SEQ IDNO137-140。14kDa和44kDa毒素基因序列都是完整的开放阅读框架。与编码杀虫蛋白质的其它毒素基因相比，PS187G1的14kDa毒素开放阅读框架核苷酸序列、44kDa毒素开放阅读框架核苷酸序列、和相应的推导氨基酸序列是新的。
PS201HH2的14kDa和44kDa核苷酸和推导多肽序列显示于SEQ IDNO141-144。14kDa毒素基因序列是完整的开放阅读框架。44kDa毒素基因序列是部分基因序列。与编码杀虫蛋白质的其它毒素基因相比，PS201HH2的14kDa毒素开放阅读框架核苷酸序列、44kDa毒素部分开放阅读框架核苷酸序列、和相应的推导氨基酸序列是新的。
KR1369的14kDa和44kDa核苷酸和推导多肽序列显示于SEQ ID NO145-148。14kDa和44kDa毒素基因序列都是完整的开放阅读框架。与编码杀虫蛋白质的其它毒素基因相比，KR1369的14kDa毒素开放阅读框架核苷酸序列、44kDa毒素开放阅读框架核苷酸序列、和相应的推导氨基酸序列是新的。实施例22-包含PS149B1的14kDa和44kDa二元毒素基因的杂合基因融合物的构建和表达设计了来自PS149B1的14kDa和44kDa基因的5’和3’末端的寡核苷酸引物。这些寡核苷酸设计用于通过SOE-PCR(“通过重叠延伸的基因剪接使用PCR剪接基因”，生物技术(Biotechniques)8528-535，1990年5月)产生基因融合物。两种基因以与天然二元毒素操纵子中发现的相反顺序融合在一起(即44kDa基因在前，14kDa基因在后)。
用于SOE-PCR的寡核苷酸序列如下F1newAAATATTATTTTATGTCAGCACGTGAAGTACACATTG(SEQ IDNO155)R1newtctctGGTACCttaTTAtgatttatgcccatatcgtgagg(SEQ ID NO156)F2newagagaACTAGTaaaaaggagataaccATGttagatactaataaag(SEQ ID NO157)R2newCGTGCTGACATAAAATAATATTTTTTTAATTTTTTTAGTGTACTTT(SEQ ID NO158)寡核苷酸“F1new”设计用于指导由14kDa基因5’末端的扩增，并可与44kDa基因3’末端杂交。寡核苷酸“R1new”设计用于指导由14kDa基因3’末端的扩增。此引物设计成包含2个终止密码子，以确保翻译的终止。它还设计成包含KpnI位点，用于定向克隆到荧光假单胞菌的质粒表达载体中。寡核苷酸“F2new”设计用于指导由44kDa基因5’末端的扩增。它还包含核糖体结合序列和SpeI克隆位点。寡核苷酸“R2new”设计用于指导由44kDa基因3’末端的扩增，并可与14kDa基因5’末端杂交。
首先由PS149B1基因组DNA单独扩增这两种基因；14kDa基因使用“F1new”和“R1new”，44kDa基因使用“F2new”和“R2new”。然后将产物加到一个PCR管中，并使用“R1new”和“F2new”一起扩增。此时，使用Herculase TM增强型聚合酶混和物(Stratagene，La Jolla，CA)，退火温度48℃，扩增包含基因融合物的大约1.5kb DNA片段。随后将此DNA片段用KpnI和SpeI进行消化，在琼脂糖凝胶上进行分离，通过电洗脱进行纯化。质粒载体也用KpnI和SpeI进行消化，在琼脂糖凝胶上进行分离，通过电洗脱进行纯化，并用磷酸酶进行处理。然后将载体和插入片段于14℃一起连接过夜。通过电穿孔用连接DNA片段转化MB214 P.f.细胞，并在LB+30μg/ml四环素平板上培养过夜进行选择。通过诊断性PCR鉴定包含基因融合物的菌株，并测序以确认成功的基因剪接。包含克隆基因融合物的一个代表性菌株称为MR1607；重组质粒称为pMYC2475。
MR1607的传代培养物于2000年8月8日保存于专利培养物收藏中心(NRRL)的永久收藏中心，Regional Research Center，1815 NorthUniVersity Street，Peoria，Illinois，61604美国。编号是NRRLB-30332。培养MR1607，并通过SDS-PAGE和免疫印渍确认蛋白质的产生。当用14kDa毒素或44kDa毒素特异性抗体对Western印渍进行探查时，确认有代表44kDa+14kDa融合产物的大约58kDa蛋白质条带。
58kDa融合蛋白的序列显示于SEQ ID NO159。基因融合物的DNA序列显示于SEQ ID NO160。实施例23-二元同源物的混和研究同源菌株的培养选择了4种菌株，每种主要二元毒素家族各选一种——149B1、80JJ1、201L3、和167H2。为了减少纯化各毒素蛋白质花费的时间，改为培养下列荧光假单胞菌(P.f.)克隆MR1253(149B1的14kDa)和MR1256(149B1的44kDa)。类似的，使用B.t.克隆MR541(表达80JJ1的14kDa)和MR542(80JJ1的44kDa)。将B.t.菌株如实施例1所述进行培养。将沉淀用水清洗3次，并冻存于-20℃直到使用。使用标准步骤在Biolafitte发酵罐中以10L批次培养P.f菌株。将沉淀冻存于-80℃直到使用。
毒素的提取和纯化167H2、MR541、MR542、201L3的纯化。使用100mM柠檬酸钠缓冲液(pH范围3.0-5.5)进行细胞沉淀的提取。在典型提取中，用最初培养物体积的1/10-1/3体积的缓冲液对沉淀进行提取。将沉淀悬于缓冲液，并置于摇床中于4℃一段时间(2.5小时-过夜)。将提取物离心，并保留上清液。对于每种菌株重复此步骤，直至每种蛋白质获得了至少大约10mg。使用NuPAGE Bis/Tris凝胶系统(Invitrogen)的SDS-PAGE确认提取物中蛋白质毒素的存在与否。根据制造商的指示制备样品，并加到4-12％凝胶上，然后用MES电泳缓冲液形成电泳图谱。此步骤的例外是所有201L3样品的样品制备。将这些样品用BioRad的Laemmli样品缓冲液稀释2倍，并于95℃加热4分钟，由此制备样品。通过激光扫描凝胶测光密度法进行蛋白质定量，以BSA作为标准(Molecular Dynamics Personal Densitometer SI)。将提取物通过0.2μm滤膜进行澄清，并保存于4℃。
MR1253和MR1256的纯化。以溶解的包涵体形式制备分别对应于149B1的14和44kDa蛋白质的重组蛋白质MR1253和MR1256。使用标准步骤制备包涵体。将包涵体溶于1mM EDTA/50mM柠檬酸钠pH5.3。
单一毒素167H2和201L3的纯化。混和已知含有14、44kDa或其二者的所有提取物。将此混合提取物在100mM柠檬酸钠/150mM NaCl pH4中进行透析。透析袋购自Pierce(Snakeskin 10k MWCO)。样品通常透析大约6小时，然后在新鲜缓冲液中再次透析过夜。
然后将提取物用Centriprep 10或Centricon Plus-20(Biomax-5，5000NMWL)离心滤器(Millipore)进行浓缩，对14kDa和44kDa蛋白质进行定量，并进行凝胶过滤层析。
在用于层析的制备中，将所有样品和缓冲液经0.2μm滤器过滤并除气。然后将样品加到用2倍柱床体积的分离缓冲液(100mM柠檬酸钠/150mM NaCl pH4.0)平衡的HiPrep 26/60 Sephacryl S-100凝胶过滤柱上。样品体积的范围为5-10ml。使用AKTA纯化仪100FPLC系统(Amersham Pharmacia)进行控制。于环境温度进行层析。层析过程中缓冲液过柱流速维持在0.7ml/min。通过监控280nm的UV吸光值来检测蛋白质。收集流出液并保存于4℃。合并含有14或44kDa蛋白质的收集液，如上所述通过SDS-PAGE检查纯度。
对于167H2样品，检测到两个大且于基线很好地分开的峰。收集液的SDS-PAGE显示每个峰对应于一种蛋白质毒素。
在201L3样品中，检测到3个很好地分开的峰和一个肩峰。SDS-PAGE揭示，第一个峰代表100kDa蛋白质和80kDa蛋白质。第二个峰代表44kDa蛋白质，肩峰是40kDa蛋白质。第三个峰是14kDa蛋白质。将来自两个样品含有44kDa的部分合并，同样合并含有14kDa蛋白质的所有级分。
由P.f.克隆MR1253和MR1256分别获得了149B1单个蛋白质，因此不需要进一步纯化。类似的，80JJ1重组体MR541和MR542产生单个的14和44kDa蛋白质，因此不用进一步纯化。
用于wCRW LC50生物检测的样品制备透析。将单个二元毒素蛋白质样品在6L 20mM柠檬酸钠pH4.0中进行透析。第一次透析进行几个小时，然后将样品转移到新鲜缓冲液中并透析过夜。最后，将样品转移到新鲜缓冲液中并再透析几个小时。蛋白质样品的来源是合并的凝胶过滤收集液(167H2、201L3)、沉淀提取物(MR541、MR542)、或包涵体沉淀提取物(MR1253、MR1256)。将所有样品滤过0.2μm膜以除菌。
浓缩。使用Centricon Plus-20(Biomax-5，5000 NMWL)离心滤器(Millipore)将样品浓缩。
定量。如上所述对样品进行蛋白质定量。为了达到LC50生物检测的要求，用于各种组合的每种毒素蛋白质至少需要6.3mg，浓度范围0.316-1.36mg/ml。如果需要，如上所述将样品浓缩，或用缓冲液(20mM柠檬酸钠pH4.0)稀释，并重新进行定量。
二元混和/LC50生物检测。对于4种菌株的每一种，将14kDa蛋白以1∶1的质量比与每种菌株的44kDa蛋白进行组合。混和物的表面施药量是50μg/cm2，203L1的14kDa蛋白质的混和物例外，此蛋白质混和物的表面施药量只有44μg/cm2。作为对照，单独施用每种蛋白质，以及提取缓冲液(20mM柠檬酸钠pH4.0)。还测试了天然组合(即149B1的14kDa+44kDa蛋白)。所有毒素组合和缓冲液对照针对玉米幼芽根叶甲的生物检测都进行了3次，而单个毒素只测试了1次。
表15(毒素组合的LC50结果)和表16(菌株潜力与149B1的比较)列出了结果。
结果还以图的形式展示于图3。
除了201L3，天然组合都具有针对玉米幼芽根叶甲的高度活性。然而，当与167H2或149B1的14kDa蛋白组合时，201L3的44kDa也具有活性。其它活性组合是149B1的14kDa蛋白与80JJ1或167H2的44kDa蛋白组合，后者显得比天然149B1混和物更有活性。单个蛋白质或者缓冲液或水对照都没有记录到剂量应答。实施例24-使用PS149B1的14kDa蛋白控制黄瓜十一星叶甲由重组荧光假单胞菌MR1253菌株分离得到包含大约50％(wt/wt)的最初在苏云金芽孢杆菌PS149B1菌株中发现的14kDa δ-内毒素的粉末。使用下列步骤评价此粉末的杀虫活性。
将人工昆虫食物(R.I.Rose和J.M.McCabe(1973)“用于饲养玉米根虫的实验室饲养技术”，经济昆虫学杂志(J.Econ.Entomol.)66(2)398-400)以大约0.5ml/孔分散到128孔生物检测盘(C-DInternational，Pitman，NJ)中，产生大约1.5cm2的表面积。将14kDa蛋白质粉末的缓冲液(10mM磷酸钾pH7.5)悬浮液以50μl/孔加到人工昆虫食物的表面，并使食物表面干燥。每次测试中还包括缓冲液对照。每个孔中放入一条新生的黄瓜十一星叶甲(Diabroticaundecimpunctata howardi)，并用与盘子一起提供的盖子将孔封闭。生物检测于28℃持续6天，然后对每种处理的存活幼虫作为一组进行称重。如下计算百分比生长抑制(存活对照昆虫体重-存活处理昆虫体重)/对照体重×100％。计算5次测试(每种处理16只昆虫)的生长抑制，并在各次测试间平均。
结果证明14kDa蛋白质以浓度依赖方式抑制黄瓜十一星叶甲的生长。表17显示了PS149B1的14kDa蛋白质对黄瓜十一星叶甲的生长抑制。
表17.
处理浓度(μg ai/cm2) ％生长抑制14kDa蛋白质13214kDa蛋白质35514kDa蛋白质978ai＝活性成分实施例25-使用PS149B1二元毒素控制欧洲玉米螟和谷实夜蛾分别由重组荧光假单胞菌MR1253和MR1256菌株分离得到包含54％的14kDa δ-内毒素的粉末和包含37％的44kDa δ-内毒素的粉末(最初都是在苏云金芽孢杆菌PS149B1菌株中发现的)。使用下列步骤评价这些粉末的混和物的杀虫活性。
将人工昆虫食物(R.I.Rose和J.M.McCabe(1973)“用于饲养玉米根虫的实验室饲养技术”，经济昆虫学杂志(J.Econ.Entomol.)66(2)398-400)以大约0.5ml/孔分散到128孔生物检测盘(C-DInternational，Pitman，NJ)中，产生大约1.5cm2的表面积。将蛋白质粉末的缓冲液(10mM磷酸钾pH7.5)悬浮液混和，然后以50μl/孔加到人工昆虫食物的表面。使食物表面干燥。每次测试中还包括缓冲液对照。每个孔中放入一条新生幼虫，并用与盘子一起提供的盖子将孔封闭。测试用属于鳞翅目的欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)和谷实夜蛾(Helicoverpa zea)进行。生物检测于28℃持续6天，然后对每种处理的存活幼虫作为一组进行称重。如下计算百分比生长抑制(存活对照昆虫体重-存活处理昆虫体重)/对照体重×100％。计算4次测试(每种处理14-16只昆虫)的生长抑制，并在各次测试间平均。
结果证明14kDa蛋白质以浓度依赖方式抑制欧洲玉米螟和谷实夜蛾的生长。表18显示了PS149B1的蛋白质混和物对谷实夜蛾(CEW)和欧洲玉米螟(ECB)的生长抑制。
表18.
14kDa蛋白质+44kDa蛋白质浓度 ％生长抑制(μg ai/cm2) CEWECB3.7+11 425911+33 577733+100 6189ai＝活性成分实施例26-45kDa蛋白的进一步定性分析和用于鉴定其它多核苷酸和蛋白质的引物设计本发明不仅包括具体例示的序列。本发明基因和毒素的部分可以用于鉴定其它相关毒素和基因。由此，本发明包括编码包含例如所附序列表中和此处所述任何二元型蛋白质或多肽的至少10个连续氨基酸的蛋白质或多肽的多核苷酸。其它实施方案包括编码例如此处例示的蛋白质的至少20、30、40、50、60、70、80、90、和100个连续氨基酸的多核苷酸；这些数目还类似的应用于例示的多核苷酸的连续核苷酸。本发明包括由这些多核苷酸编码的蛋白质。同样的，本发明包括包含连续核苷酸(编码包含这些大致大小的肽的蛋白质和多肽)的多核苷酸。
虽然差异仍然很大，与本发明毒素“最密切的”毒素被认为是球形芽孢杆菌的51和42kDa杀蚊蛋白质。所附图4和图5是51和42kDa的球形芽孢杆菌毒素和基因与45kDa的149B1毒素和基因的蛋白质比对和核苷酸序列比对。
核苷酸比对中标明的两个序列块可以用于设计引物。下文显示了例示性PCR引物对(5’-3’方向，45kD3’rc以互补物显示)。这些引物已经成功的用于鉴定45kDa二元家族的其它成员。下文还显示了完全冗余序列和预示的配对。
45kD5′GAT RAT RAT CAA TAT ATT ATT AC(SEQ ID NO161).
45kD3′rcCAA GGT ART AAT GTC CAT CC(SEQ ID NO162).
序列的所示形式及其反向互补序列都是有用的(03和04与例示的反向引物45 kD3’rc互补)。
45kD5′01GAT GATGrTmrAk wwATTATTrC A(SEQ ID NO163).
45kD5′02GAT GATGrTmrAT ATATrATTrC A(SEQ ID NO164).
45kD3′03GGAwG krCdyTwdTm CCwTGTAT(SEQ ID NO165).
45kD3′04GGAwG kACryTAdTA CCTTGTAT(SEQ ID NO166).
关于鉴定球形芽孢杆菌毒素的方式，使用149B1的45kDa蛋白质的BLAST(Altschul等人，1997“缺口BLAST和PSI-BLAST新一代蛋白质数据库搜索程序”，核酸研究(Nucleic Acids Res.)253389-3402)数据库搜索，发现与42kDa的球形芽孢杆菌包涵体蛋白质(期望得分3×1014)和51kDa的球形芽孢杆菌结晶状包涵体蛋白质(期望得分3×109)相匹配。
45kDa的149B1肽序列与42kDa的球形芽孢杆菌结晶状包涵体蛋白质的比对得出，325个残基具有26％的同一性。比对得分比100种随机比对的平均得分高27.2sd。45kDa的149B1肽序列与42kDa的球形芽孢杆菌结晶状包涵体蛋白质的相似分析得出，229个残基具有29％的同一性。比对得分比100种随机比对的平均得分高23.4sd。比对得分比随机比对平均值高10sd被认为是显著的(D.J.Lipman和W.R.Pearson(1985)“快速和灵敏的相似性搜索”，科学(Science)2271435-1441；R.F.Doolittle(1987)of URFs and ORFsa primer onhow to analyze derived amino acid sequence，University ScienceBooks，Mill Valley，CA)。
为了参考，以相同方式比较了结构相似的Cry1Aa、Cry2Aa、和Cry3Aa蛋白质序列。Cry2Aa与Cry1Aa和Cry2Aa与Cry3Aa分别在214和213个氨基酸中具有29％和27％的同一性，比对得分比100种随机比对的平均得分高32.2sd和29.5sd。149B1的45kDa蛋白质序列与Cry2Aa蛋白质序列的比对得出比对得分比100种随机比对的平均得分高1sd。
还记录了下面的比较
*根据100种随机化为了其它比较目的和为了其它引物设计，记录了下面的参考文献Oei等人(1992)，“纯化的球形芽孢杆菌二元毒素及其删除衍生物与致倦库蚊肠道的结合功能性结合结构域的阐释”，普通微生物学杂志(Journal of General Microbiology)138(7)1515-26。
51kDa蛋白35-448有活性；45-448无活性；4-396有活性；4-392无活性。
42kDa蛋白18-370有活性；35-370无活性；4-358有活性；4-349无活性。
用经纯化和凝血酶切割的GST融合物进行工作。用其它完整亚基进行所有截短物的检测。所有删除都有一些活性损失。P51ΔC56结合但不使42内在化。P51ΔN45不结合。只有42kDa+51kDa可内在化。N末端和C末端无毒性的42kDa蛋白质不能结合51kDa蛋白质或51kDa受体复合物。
Davidson等人(1990)，“球形芽孢杆菌的杀蚊子幼虫蛋白质的相互作用”，加拿大微生物学杂志(Can.J.Microbiol.)36(12)870-878。由球形芽孢杆菌得到的经SDS-PAGE纯化的蛋白质的N末端。68-74kDa复合物(未还原)中的51kDa的S29和N31及42kDa的S9。来自51kDa条带(未还原)的51的S9和S29及42的N31。在还原凝胶中，45kDa条带含有51kDa蛋白的S29和N31，39kDa条带含有42kDa蛋白质的S9。
Baumann等人(1988)，“编码球形芽孢杆菌2362和2297的51.4和41.9kDa蛋白质的杀蚊毒素基因的序列分析”，细菌学杂志(J.Bacteriol.)1702045-2050。来自球形芽孢杆菌蛋白酶D5的41.9kDa蛋白的N末端和来自胰凝乳蛋白酶的I11；C末端跟随胰蛋白酶的R349。鉴定到相似性增强的区域对应于许多上述区域。相似序列块A-D在51和42kDa蛋白质之间。
总而言之，本发明并不想包括上文讨论的球形芽孢杆菌毒素(事实上，它们被特异排除在外)。在那个方面，趋异连续序列，如上文讨论的比对(图4和图5)中例示的，可以作为引物使用，以鉴定此处暗示但未具体例示的独特毒素。然而，保守连续序列，如比对中所示，也可以根据本发明使用，以鉴定其它新的15/45kDa型二元毒素(对玉米根虫和其它害虫有活性)。实施例27-毒素基因在植物中的插入和表达本发明的一个方面是用表达本发明蛋白质的本发明多核苷酸转化植物。经转化的植物对目的害虫攻击具有抵抗力。
可以将此处所述新的玉米根虫活性基因进行优化，用于在其它有机体中表达。例如，经玉蜀黍优化的14和44kDa的PS80JJ1毒素编码基因序列分别显示于SEQ ID NO44和45。
使用多种本领域众所周知的技术，可以将此处公开的杀虫毒素编码基因插入植物细胞中。例如，可以获得大量的包含E.coli的复制系统和可用于进行转化细胞选择的标记的克隆载体，用于将外源基因插入到高等植物中。载体包括例如pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184、等等。相应的，可以将B.t.毒素编码序列插入载体的合适限制性位点。用产生的质粒转化E.coli。将E.coli细胞在合适的营养培养基中进行培养，然后收获并裂解。回收质粒。通常进行序列分析、限制性分析、电泳、和其它生化-分子生物学方法作为分析方法。每步操作后，可以将所用DNA序列切下，并与下一个DNA序列连接。每种质粒序列可以克隆到相同或其它质粒中。取决于将期望基因插入植物的方法，其它DNA序列可能是必需的。例如，如果使用Ti或Ri质粒转化植物细胞，那么必需至少连接Ti或Ri质粒T-DNA的右边界序列，但是经常同时连接右和左边界序列，作为将要插入的基因的侧翼区域。
使用T-DNA转化植物细胞，已经进行了深入研究并充分描述于EP120 516；Hoekema(1985)二元植物载体系统，Offset-durkkerijKanters B.V.，Alblasserdam，第5章；Fraley等人，植物科学评论(Crit.Rev.Plant Sci.)41-46；和An等人(1985)欧洲分子生物学杂志(EMBO J)4277-287。
一旦插入的DNA已经整合到基因组中，它在那儿将相对稳定，并且原则上不再出来。它通常包含选择标记，以赋予经转化的植物细胞以对杀生物剂或抗生素(诸如卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素、或氯霉素及其它)的抗性。单独应用的标记应当相应的能够选择经转化细胞，而非不含插入DNA的细胞。
可以获得大量的技术用于将DNA插入到植物宿主细胞中。那些技术包括使用根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)作为转化剂用T-DNA转化、融合、注射、biolistics(微粒轰击)、或电穿孔、以及其它可能的方法。如果使用土壤杆菌进行转化，要插入的DNA必需克隆到特殊质粒即中间载体或二元载体中。由于中间载体包含与T-DNA中的序列同源的序列，所以它可以通过同源重组整合到Ti或Ri质粒中。Ti或Ri质粒还包含T-DNA转移必需的vir区。中间载体自身在土壤杆菌中不能复制。通过辅助质粒的方法(接合)，中间载体可以转移到根瘤土壤杆菌中。二元载体自身可以在E.coli和土壤杆菌中复制。它们包含侧翼为T-DNA右和左边界区的选择标记基因和接头或多克隆位点。它们可以直接转化到土壤杆菌中(Holsters等人Mol.Gen.Genet.163181-187)。作为宿主细胞使用的土壤杆菌要包含携带vir区的质粒。vir区对于将T-DNA转移到植物细胞中是必需的。还可以包含其它T-DNA。这样转化的细菌被用于转化植物细胞。植物外植体可以方便的与根瘤土壤杆菌或发根土壤杆菌一起进行培养，从而将DNA转移到植物细胞中。然后由经感染的植物材料(例如叶片、茎段、根，还有原生质体或悬浮培养的细胞)，可以在合适的培养基(可以含有抗生素或杀生物剂用于选择)中再生成完整植株。然后可以测试这样得到的植物中插入DNA的存在。注射和电穿孔对质粒没有特殊要求。可以使用普通质粒，诸如pUC衍生物。
经转化细胞以常规方式在植物内生长。它们可以形成种系细胞，并将性状遗传给后代植株。这样的植物可以以常规方式进行培养，并可以与具有相同转化遗传因子或其它遗传因子的植物杂交。产生的杂合体个体具有相应的表型性状。
在本发明的优选实施方案中，用经植物密码子使用率优化的基因转化植物。参阅美国专利5,380,831，此处引用作为参考。同样的，可以有利的使用编码截短毒素的植物。截短毒素通常将编码全长毒素的大约55％-大约80％。本领域已知产生用于植物的合成B.t.基因的方法。实施例28-将B.t.基因克隆到昆虫病毒中已知有大量的病毒可感染昆虫。这些病毒包括例如杆状病毒和昆虫痘病毒。在本发明的一个实施方案中，此处所述编码杀虫毒素的基因可以置于昆虫病毒的基因组中，由此增强病毒的致病性。用于构建包含B.t.毒素基因的昆虫病毒的方法，对于本领域技术人员是众所周知且容易实践的。这些步骤描述于例如A.T.Merrywwather、U.Weyer、M.P.G.Harris、M.Hirst、T.Booth、R.D.Possee(1990)普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)711535-1544)和J.W.M.Martens、G.Honee、D.Zuidema、J.W.M.van Lent、B.Visser、J.M.Vlak(1990)应用环境微生物学(Appl.Environmental Microbiol.)56(9)2764-2770。
此处提及或引用的所有专利、专利申请、临时中请、和出版物，均全文引入作为参考文献，它们与本说明书的具体教导不相矛盾。
应当这样理解，此处描述的实施例和实施方案只是为了例示目的，而且本领域的技术人员根据本发明可以领会各种修饰和变化，这些是包括在本申请的精神和范围之内及所附权利要求的范围之内的。
序列表<110>Mycogen公司<120>杀虫蛋白<130>MA-703C3<140>09/378，088<141>1999-08-20<160>166<170>patentIn Ver.2.1<210>1<211>5<212>PRT<213>未知有机体<220><223>未知有机体的描述肽<400>1Met Leu Asp Thr Asn1 5<210>2<211>25<212>PRT<213>未知有机体<220><223>未知有机体的描述蛋白质<400>2Met Leu Asp Thr Asn Lys Val Tyr Glu Ile Ser Asn Leu Ala Asn Gly1 5 10 15Leu Tyr Thr Ser Thr Tyr Leu Ser Leu20 25<210>3<211>24<212>PRT<213>未知有机体<220><223>未知有机体的描述蛋白质<400>3Ser Ala Arg Glu Val His Ile Glu Ile Asn Asn Thr Arg His Thr Leu1 5 10 15Gln Leu Glu Ala Lys Thr Lys Leu20<210>4<211>25<212>PRT<213>未知有机体<220><223>未知有机体的描述蛋白质<400>4Met Leu Asp Thr Asn Lys Val Tyr Glu Ile Ser Asn His Ala Asn Gly1 5 10 15Leu Tyr Ala Ala Thr Tyr Leu Ser Leu20 25<210>5<211>50<212>PRT<213>未知有机体<220><223>未知有机体的描述蛋白质<220><221>不确定<222>(35)<223>未确定氨基酸<400>5Ser Ala Arg Glu Val His Ile Asp Val Asn Asn Lys Thr Gly His Thr1 5 10 15Leu Gln Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu Asp Gly Gly Arg Trp Arg Thr20 25 30Ser Pro Xaa Asn Val Ala Asn Asp Gln Ile Lys Thr Phe Val Ala Glu35 40 45Ser 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acttctttag aattatatcg atataacggt acagaaatta agataatgga 1500catagaaact tcagatcatg atacttacac tcttacttct tatccaaatc ataaagaagc 1560attattactt ctcacaaacc attcgtatga agaagtagaa gaaataacaa aaatacctaa 1620gcatacactt ataaaattga aaaaacatta ttttaaaaaa taaaaaacat aatatataaa 1680tgactgatta atatctctcg aaaaggttct ggtgcaaaaa tagtgggata tgaaaaaagc 1740aaaagattcc taacggaatg gaacattagg ctgttaaatc aaaaagttta ttgataaaat 1800atatctgcct ttggacagac ttctcccctt ggagagtttg tccttttttg accatatgca 1860tagcttctat tccggcaatc atttttgtag ctgtttgcaa ggattttaat ccaagcatat 1920ccgaatacgc tttttgataa ccgatgtctt gttcaatgat attgtttaat attttcacac 1980gaattggcta ctgtgcggta tcctgtctcc tttat2015<210>31<211>360<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>31atgtcagctc gcgaagtaca cattgaaata aacaataaaa cacgtcatac attacaatta 60gaggataaaa ctaaacttag cggcggtaga tggcgaacat cacctacaaa tgttgctcgt 120gatacaatta aaacatttgt agcagaatca catggtttta tgacaggagt agaaggtatt 180atatatttta gtgtaaacgg agacgcagaa attagtttac attttgacaa tccttatata 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ataaaattta tgaaataagt aattatgcta atggattaca tgcagcaact 1020tatttaagtt tagatgattc aggtgttagt ttaatgaata aaaatgatga tgatattgat 1080gactataatt taaggtggtt tttatttcct attgatgata atcaatatat tattacaagc 1140tacgcagcga ataattgtaa ggtttggaat gttaataatg ataaaataaa tgtttcaact 1200tattcttcaa caaactcgat acagaaatgg caaataaaag ctaatgcttc ttcgtatgta 1260atacaaagta ataatgggaa agttctaaca gcaggaaccg gtcaatctct tggattaata 1320cgtttaacgg atgaatcacc agataatccc aatcaacaat ggaatttaac tcctgtacaa 1380acaattcaac tcccaccaaa acctacaata gatacaaagt taaaagatta ccccaaatat 1440tcacaaactg gcaatataga caagggaaca cctcctcaat taatgggatg gacattaata 1500ccttgtatta tggtaaatga tccaaatata gataaaaaca ctcaaatcaa aactactcca 1560tattatattt taaaaaaata tcaatattgg caacaagcag taggaagtaa tgtagcttta 1620cgtccgcatg aaaaaaaatc atatgcttat gagtggggta cagaaataga tcaaaaaaca 1680actatcatta atacattagg atttcagatt aatatagatt cgggaatgaa atttgatata 1740ccagaagtag gtggaggtac agatgaaata aaaacacaat taaacgaaga attaaaaata 1800gaatatagcc gtgaaaccaa 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aacctgaata tgaagttatt actcaaagcg 300gatcaggaga taaatctcat gtgacatata cgattcagac 340<210>62<211>112<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>62Ser Ala Arg Glu Val His Ile Glu Ile Asn Asn Lys Thr Arg His Thr1 5 10 15Leu Gln Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu Ser Gly Gly Arg Trp Arg Thr20 25 30Ser Pro Thr Asn Val Ala Arg Asp Thr Ile Lys Thr Phe Val Ala Glu35 40 45Ser His Gly Phe Met Thr Gly Val Glu Gly Ile Ile Tyr Phe Ser Val50 55 60Asn Gly Asp Ala Glu Ile Ser Leu His Phe Asp Asn Pro Tyr Ile Gly65 70 75 80Ser ASn Lys Cys Asp Gly Ser Ser Asp Lys Pro Glu Tyr Glu Val Ile85 90 95Thr Gln Ser Gly Ser Gly Asp Lys Ser His Val Thr Tyr Thr Ile Gln100 105 110<210>63<211>1114<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>63atgttagata ctaataaaat ttatgaaata agcaatcttg ctaatggatt atatacatca 60acttatttaa gtcttgatga ttcaggtgtt agtttaatga gtaaaaagga tgaagatatt 120gatgattaca atttaaaatg gtttttattt cctattgata ataatcaata tattattaca 180agctatggag ctaataattg taaagtttgg aatgttaaaa atgataaaat aaatgtttca 240acttattctt caacaaactc tgtacaaaaa tggcaaataa aagctaaaga ttcttcatat 300ataatacaaa gtgataatgg aaaggtctta acagcaggag taggtcaatc tcttggaata 360gtacgcctaa ctgatgaatt tccagagaat tctaaccaac aatggaattt aactcctgta 420caaacaattc aactcccaca aaaacctaaa atagatgaaa aattaaaaga tcatcctgaa 480tattcagaaa ccggaaatat aaatcctaaa acaactcctc aattaatggg atggacatta 540gtaccttgta ttatggtaaa tgattcaaaa atagataaaa acactcaaat taaaactact 600ccatattata tttttaaaaa atataaatac tggaatctag caaaaggaag taatgtatct 660ttacttccac atcaaaaaag atcatatgat tatgaatggg gtacagaaaa aaatcaaaaa 720acaactatta ttaatacagt aggattgcaa attaatatag attcaggaat gaaatttgaa 780gtaccagaag taggaggagg tacagaagac ataaaaacac aattaactga agaattaaaa 840gttgaatata gcactgaaac caaaataatg acgaaatatc aagaacactc agagatagat 900aatccaacta atcaaccaat gaattctata ggacttctta tttatacttc tttagaatta 960tatcgatata acggtacaga aattaagata atggacatag aaacttcaga tcatgatact 1020tacactctta cttcttatcc aaatcataaa gaagcattat tacttctcac aaaccattct 1080tatgaagaac tagaacaaat tacaagggcg aatt 1114<210>64<211>371<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<220><221>不确定<222>(242)<223>推导的氨基酸序列中未确定<400>64Met Leu Asp Thr Asn Lys Ile Tyr Glu Ile Ser Asn Leu Ala Asn Gly1 5 10 15Leu Tyr Thr Ser Thr Tyr Leu Ser Leu Asp Asp Ser Gly Val Ser Leu20 25 30Met Ser Lys Lys Asp Glu Asp Ile Asp Asp Tyr Asn Leu Lys Trp Phe35 40 45Leu Phe Pro Ile Asp Asn Asn Gln Tyr Ile Ile Thr Ser Tyr Gly Ala50 55 60Asn Asn Cys Lys Val Trp Asn Val Lys Asn Asp Lys Ile Asn Val Ser65 70 75 80Thr Tyr Ser Ser Thr Asn Ser Val Gln Lys Trp Gln Ile Lys Ala Lys85 90 95Asp Ser Ser Tyr Ile Ile Gln Ser Asp Asn Gly Lys Val Leu Thr Ala100 105 110Gly Val Gly Gln Ser Leu Gly Ile Val Arg Leu Thr Asp Glu Phe Pro115 120 125Glu Asn Ser Asn Gln Gln Trp Asn Leu Thr Pro Val Gln Thr Ile Gln130 135 140Leu Pro Gln Lys Pro Lys Ile Asp Glu Lys Leu Lys Asp His Pro Glu145 150 155 160Tyr Ser Glu Thr Gly Asn Ile Asn Pro Lys Thr Thr Pro Gln Leu Met165 170 175Gly Trp Thr Leu Val Pro Cys Ile Met Val Asn Asp Ser Lys Ile Asp180 185 190Lys Asn Thr Gln Ile 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aatggaattt aatccctgta 420caaacaattt cactcccaca aaaacctaaa atagataaaa aattaaaaga tcatcctgaa 480tattcagaaa ccggaaatat agctactgga acaattcctc aattaatggg atggacatta 540gtaccttgta ttatggtaaa tgatccaaaa ataggtaaaa acactcaaat taaaactact 600ccatattata tttttaaaaa atatcaatac tggaaacgag caataggaag taatgtatct 660ttacttccac atcaaaaaaa atcatatgat tatgagtggg gtacagaaga aaatcaaaaa 720acaactatta ttaatacagt aggatttcaa attaatgtag attcaggaat gaagtttgag 780gtaccagaag taggaggagg tacagaagaa ataaaaacac aattaaatga agaattaaaa 840gttgaatata gcactgacac caaaataatg aaaaaatatc aagaacactc agagatagat 900aatccaacta atcaaacaac gaattctata ggatttctta cttttacttc tttagaatta 960tatcgatata acggttcgga aattcgtata atgagaatgg aaacttcaga taatgatact 1020tatactctga cctcttatcc aaatcataga gaagcattat tacttctcac aaatcattct 1080tatcaagaag taagccgaat tccagcacac tggcggccgt tactagtgga tccgagctcg 1140gtaccaagct tggcgtaatc atggtcatag stgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc 1200acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga 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thuringiensis<400>97atgtcagctc gtgaagtaca tattgaaata ataaatcata caggtcatac cttacaaatg 60gataaaagaa ctagacttgc acatggtgaa tggattatta cacccgtgaa tgttccaaat 120aattcttctg atttatttca agcaggttct gatggagttt tgacaggagt agaaggaata 180ataatttata ctataaatgg agaaatagaa attaccttac attttgacaa tccttatgca 240ggttctaata aatattctgg acgttctagt gatgatgatt ataaagttat aactgaagca 300agagcagaac atagagctaa taatcatgat catgtgacat atacaattca aac353<210>98<211>117<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>98Met Ser Ala Arg Glu Val His Ile Glu Ile Ile Asn His Thr Gly His1 5 10 15Thr Leu Gln Met Asp Lys Arg Thr Arg Leu Ala His Gly Glu Trp Ile20 25 30Ile Thr Pro Val Asn Val Pro Asn Asn Ser Ser Asp Leu Phe Gln Ala35 40 45Gly Ser Asp Gly Val Leu Thr Gly Val Glu Gly Ile Ile Ile Tyr Thr50 55 60Ile Asn Gly Glu Ile Glu Ile Thr Leu His Phe Asp Asn Pro Tyr Ala65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Tyr Ser Gly Arg Ser Ser Asp Asp Asp Tyr Lys Val85 90 95Ile Thr Glu Ala Arg Ala Glu His Arg Ala Asn Asn His Asp His Val100 105 110Thr Tyr Thr 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caaaactact 600ccatattata ttttaaaaaa atatcaatat tggcaacaag cagtaggaag taatgtagct 660ttacgtccgc atgaaaaaaa atcatatgct tatgagtggg gtacagaaat agatcaaaaa 720acaactatca ttaatacatt aggatttcag attaatatag attcgggaat ggaatttgat 780ataccagaag taggtggagg tacagatgaa ataaaaacac aattaaacga agaattaaaa 840atagaatata gccgtgaaac caaaataatg gaaaaatatc aggaacaatc agagatagat 900aatccaactg atcaatcaat gaattctata ggattcctca ctattacttc tttagaatta 960tatcgatata atggttcgga aattagtgta atgaaaattc aaacttcaga taatgatact 1020tacaatgtga cctcttatcc agatcatcaa caagctctat tacttcttac aaatcattca 1080tatgaacaag tacaagaaat aacaagggcg aatt 1114<210>110<211>371<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>110Met Leu Asp Thr Asn Lys Val Tyr Glu Ile Ser Asn Tyr Ala Asn Gly1 5 10 15Leu His Ala Ala Thr Tyr Leu Ser Leu Asp Asp Ser Gly Val Ser Leu20 25 30Met Asn Lys Asn Asp Asp Asp Ile Asp Asp Tyr Asn Leu Arg Trp Phe35 40 45Leu Phe Pro Ile Asp Asp Asn Gln Tyr Ile Ile Thr Ser Tyr Ala Ala50 55 60Asn Asn Cys Lys Val Trp Asn Val Asn Asn Asp 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agaagcagaa attagtttat attttgacaa tccttattca 240ggttctaata aatatgatgg gcattctaat aaaaatcaat atgaagttat tacccaagga 300ggatcaggaa atcaatctca tgtgacttat acgattcaca c 341<210>118<211>113<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<220><221>不确定<222>(242)<223>推导的氨基酸序列中未确定<400>118Met Ser Ala Arg Gln Leu His Ile Asp Val Asn Asn Lys Thr Gly His1 5 10 15Thr Leu Gln Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu Asp Gly Gly Arg Trp Arg20 25 30Thr Ser Pro Thr Asn Val Ala Asn Asp Gln Ile Lys Thr Phe Val Ala35 40 45Glu Ser His Gly Phe Met Thr Gly Thr Glu Gly Thr Ile Tyr Tyr Ser50 55 60Ile Asn Gly Glu Ala Glu Ile Ser Leu Tyr Phe Asp Asn Pro Tyr Ser65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Tyr Asp Gly His Ser Asn Lys Asn Gln Tyr Glu Val85 90 95Ile Thr Gln Gly Gly Ser Gly Asn Gln Ser His Val Thr Tyr Thr Ile100 105 110His<210>119<211>341<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>119atgtcaggtc gtgaagttca tattgatgta aataataaga caggtcatac attacaatta 60gaagataaaa caaaacttga tggtggtaga tggcgaacat cacctacaaa tgttgctaat 120gatcaaatta aaacatttgt agcagaatca 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thuringiensis<400>132gtccatccca ttaattgagg ag 22<210>133<211>399<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>133atgtcagcac gtgaagtaca cattgaaata ataaatcata caggtcatac cttacaaatg 60gataaaagaa ctagacttgc acatggtgaa tggattatta cacccgtgaa tgttccaaat 120aattcttctg atttatttca agcaggttct gatggagttt tgacaggagt agaaggaata 180ataatttata ctataaatgg agaaatagaa attcccttac attttgacaa tccttatgca 240ggttctaata aatattctgg acgttctagt gatgatgatt ataaagttat aactgaagca 300agagcagaac atagagctaa taatcatgat catgtaacat atacagttca aagaaacata 360tcacgatata ccaataaatt atgttctaat aactcctaa399<210>134<211>132<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>134Met Ser Ala Arg Glu Val His Ile Glu Ile Ile Asn His Thr Gly His1 5 10 15Thr Leu Gln Met Asp Lys Arg Thr Arg Leu Ala His Gly Glu Trp Ile20 25 30Ile Thr Pro Val Asn Val Pro Asn Asn Ser Ser Asp Leu Phe Gln Ala35 40 45Gly Ser Asp Gly Val Leu Thr Gly Val Glu Gly Ile Ile Ile Tyr Thr50 55 60Ile Asn Gly Glu Ile Glu Ile Pro Leu His Phe Asp Asn Pro Tyr Ala65 70 75 80Gly Ser Asn Lys 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g871<210>144<211>290<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>144Met Ile Glu Thr Asn Lys Ile Tyr Glu Ile Ser Asn Lys Ala Asn Gly1 5 10 15Leu Tyr Ala Thr Thr Tyr Leu Ser Phe Asp Asn Ser Gly Val Ser Leu20 25 30Leu Asn Lys Asn Glu Ser Asp Ile Asn Asp Tyr Asn Leu Lys Trp Phe35 40 45Leu Phe Pro Ile Asp Asn Asn Gln Tyr Ile Ile Thr Ser Tyr Gly Val50 55 60Asn Lys Asn Lys Val Trp Thr Ala Asn Gly Asn Lys Ile Asn Val Thr65 70 75 80Thr Tyr Ser Ala Glu Asn Ser Ala Gln Gln Trp Gln Ile Arg Asn Ser85 90 95Ser Ser Gly Tyr Ile Ile Glu Asn Asn Asn Gly Lys Ile Leu Thr Ala100 105 110Gly Thr Gly Gln Ser Leu Gly Leu Leu Tyr Leu Thr Asp Glu Ile Pro115 120 125Glu Asp Ser Asn Gln Gln Trp Asn Leu Thr Ser Ile Gln Thr Ile Ser130 135 140Leu Pro Ser Gln Pro Ile Ile Asp Thr Thr Leu Val Asp Tyr Pro Lys145 150 155 160Tyr Ser Thr Thr Gly Ser Ile Asn Tyr Asn Gly Thr Ala Leu Gln Leu165 170 175Met Gly Trp Thr Leu Ile Pro Cys Ile Met Val Tyr Asp Lys Thr Ile180 185 190Ala Ser Thr His Thr Gln Ile Thr Thr Thr Pro Tyr Tyr Ile Leu 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ctcaaataat cccaatcaac aatggaattt aacttctgta 420caaacaattc aacttccaca aaaacctata atagatacaa aattaaaaga ttatcccaaa 480tattcaccaa ctggaaatat agataatgga acatctcctc aattaatggg atggacatta 540gtaccttgta ttatggtaaa tgatccaaat atagataaaa atactcaaat taaaactact 600ccatattata ttttaaaaaa atatcaatat tggcaacgag cagtaggaag taatgtagct 660ttacgtccac atgaaaaaaa atcatatact tatgaatggg gaacagaaat agatcaaaaa 720acaacaatca taaatacatt aggatttcaa atcaatatag attcaggaat gaaatttgat 780ataccagaag taggtggagg tacagatgaa ataaaaacac aactaaatga agaattaaaa 840atagaatata gtcgtgaaac taaaataatg gaaaaatatc aagaacaatc tgaaatagat 900aatccaactg atcaaccaat gaattctata ggatttctta ctattacttc tttagaatta 960tatagatata atggctcaga aattcgtata atgcaaattc aaacctcaga taatgatact 1020tataatgtta cttcttatcc agatcatcaa caagctttat tacttcttac aaatcattca 1080tatgaagaag tagaagaaat aacaaatatt cctaaaagta cactaaaaaa attaaaaaaa 1140tattattttt aa 1152<210>148<211>383<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>148Met Leu Asp Thr Asn Lys Val Tyr Glu Ile Ser Asn His Ala Asn Gly1 5 10 15Leu Tyr Ala Ala Thr Tyr Leu Ser Leu Asp Asp Ser Gly Val Ser Leu20 25 30Met Asn Lys Asn Asp Asp Asp Ile Asp Asp Tyr Asn Leu Lys Trp Phe35 40 45Leu Phe Pro Ile Asp Asp Asp Gln Tyr Ile Ile Thr Ser Tyr Ala Ala50 55 60Asn Asn Cys Lys Val Trp Asn Val Asn Asn Asp Lys Ile Asn Val Ser65 70 75 80Thr Tyr Ser Ser Thr Asn Ser Ile Gln Lys Trp Gln Ile Lys Ala Asn85 90 95Gly Ser Ser Tyr Val Ile Gln Ser Asp Asn Gly Lys Val Leu Thr Ala100 105 110Gly Thr Gly Gln Ala Leu Gly Leu Ile Arg Leu Thr Asp Glu Ser Ser115 120 125Asn Asn Pro Asn Gln Gln Trp Asn Leu Thr Ser Val Gln Thr Ile Gln130 135 140Leu Pro Gln Lys Pro Ile Ile Asp Thr Lys Leu Lys Asp Tyr Pro Lys145 150 155 160Tyr Ser Pro Thr Gly Asn Ile Asp Asn Gly Thr Ser Pro Gln Leu Met165 170 175Gly Trp Thr Leu Val Pro Cys Ile Met Val Asn Asp Pro Asn Ile Asp180 185 190Lys Asn Thr Gln Ile Lys Thr Thr Pro Tyr Tyr Ile Leu Lys Lys Tyr195 200 205Gln Tyr Trp Gln Arg Ala Val Gly Ser Asn Val Ala Leu Arg Pro His210 215 220Glu Lys Lys Ser Tyr Thr Tyr Glu Trp Gly Thr Glu Ile Asp Gln Lys225 230 235 240Thr Thr Ile Ile Asn Thr Leu Gly Phe Gln Ile Asn Ile Asp Ser Gly245 250 255Met Lys Phe Asp Ile Pro Glu Val Gly Gly Gly Thr Asp Glu Ile Lys260 265 270Thr Gln Leu Asn Glu Glu Leu Lys Ile Glu Tyr Ser Arg Glu Thr Lys275 280 285Ile Met Glu Lys Tyr Gln Glu Gln Ser Glu Ile Asp Asn Pro Thr Asp290 295 300Gln Pro Met Asn Ser Ile Gly Phe Leu Thr Ile Thr Ser Leu Glu Leu305 310 315 320Tyr Arg Tyr Asn Gly Ser Glu Ile Arg Ile Met Gln Ile Gln Thr Ser325 330 335Asp Asn Asp Thr Tyr Asn Val Thr Ser Tyr Pro Asp His Gln Gln Ala340 345 350Leu Leu Leu Leu Thr Asn His Ser Tyr Glu Glu Val Glu Glu Ile Thr355 360 365Asn Ile Pro Lys Ser Thr Leu Lys Lys Leu Lys Lys Tyr Tyr Phe370 375 380<210>149<211>354<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>149atgtcagctc gcgaagttca tattgaaata ataaatcata caggtcatac cttacaaatg 60gataaaagaa ctagacttgc acatggtgaa tggattatta cacccgtgaa tgttccaaat 120aattcttctg atttatttca agcaggttct gatggagttt tgacaggagt agaaggaata 180ataatttata ctataaatgg agaaatagaa attaccttac attttgacaa tccttatgca 240ggttctaata aatattctgg acgttctagt gatgatgatt ataaagttat aactgaagca 300agagcagaac atagagctaa taatcatgat catgtgacat atacaattca aaca 354<210>150<211>113<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>150Met Ser Ala Arg Glu Val His Ile Glu Ile Ile Asn His Thr Gly His1 5 10 15Thr Leu Gln Met Asp Lys Arg Thr Arg Leu Ala His Gly Glu Trp Ile20 25 30Ile Thr Pro Val Asn Val Pro Asn Asn Ser Ser Asp Leu Phe Gln Ala35 40 45Gly Ser Asp Gly Val Leu Thr Gly Val Glu Gly Ile Ile Ile Tyr Thr50 55 60Ile Asn Gly Glu Ile Glu Ile Thr Leu His Phe Asp Asn Pro Tyr Ala65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Tyr Ser Gly Arg Ser Ser Asp Asp Asp Tyr Lys Val85 90 95Ile Thr Glu Ala Arg Ala Glu His Arg Ala Asn Asn His Asp His Val100105 110Thr<210>151<211>353<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>151atgtcagctc gtgaagttca tattgaaata ataaatcata caggtcatac cttacaaatg 60gataaaagaa ctagacttgc acatggtgaa tggattatta cacccgtgaa tgttccaaat 120aattcttctg atttatttca agcaggttct gatggagttt tgacaggagt agaaggaata 180ataatttata ctataaatgg agaaatagaa attaccttac attttgacaa tccttatgca 240ggttctaata aatattctgg acgttctagt gatgatgatt ataaagttat aactgaagca 300agagcagaac atagagctaa taatcatgat catgtaacat atacaattca aac353<210>152<211>113<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>152Met Ser Ala Arg Glu Val His Ile Glu Ile Ile Asn His Thr Gly His1 5 10 15Thr Leu Gln Met Asp Lys Arg Thr Arg Leu Ala His Gly Glu Trp Ile20 25 30Ile Thr Pro Val Asn Val Pro Asn Asn Ser Ser Asp Leu Phe Gln Ala35 40 45Gly Ser Asp Gly Val Leu Thr Gly Val Glu Gly Ile Ile Ile Tyr Thr50 55 60Ile Asn Gly Glu Ile Glu Ile Thr Leu His Phe Asp Asn Pro Tyr Ala65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Tyr Ser Gly Arg Ser Ser Asp Asp Asp Tyr Lys Val85 90 95Ile Thr Glu Ala Arg Ala Glu His Arg Ala Asn Asn His Asp His Val100 105 110Thr<210>153<211>353<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>153atgtcagcac gcgaagtaga tattgaaata ataaatcata caggtcatac cttacaaatg 60gataaaagaa ctagacttgc acatggtgaa tggattatta cacccgtgaa tgttccaaat 120aattcttctg atttatttca agcaggttct gatggagttt tgacaggagt agaaggaata 180ataatttata ctataaatgg agaaatagaa attaccttac attttgacaa tccttatgca 240ggttctaata aatattctgg acgttctagt gatgatgatt ataaagttat aactgaagca 300agagcagaac atagagctaa taatcatgat catgtgactt atacaattca aac353<210>154<211>113<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>154Met Ser Ala Arg Glu Val Asp Ile Glu Ile Ile Asn His Thr Gly His1 5 10 15Thr Leu Gln Met Asp Lys Arg Thr Arg Leu Ala His Gly Glu Trp Ile20 25 30Ile Thr Pro Val Asn Val Pro Asn Asn Ser Ser Asp Leu Phe Gln Ala35 40 45Gly Ser Asp Gly Val Leu Thr Gly Val Glu Gly Ile Ile Ile Tyr Thr50 55 60Ile Asn Gly Glu Ile Glu Ile Thr Leu His Phe Asp Asn Pro Tyr Ala65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Tyr Ser Gly Arg Ser Ser Asp Asp Asp Tyr Lys Val85 90 95Ile Thr Glu Ala Arg Ala Glu His Arg Ala Asn Asn His Asp His Val100 105 110Thr<210>155<211>37<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>155aaatattatt ttatgtcagc acgtgaagta cacattg 37<210>156<211>40<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>156tctctggtac cttattatga tttatgccca tatcgtgagg 40<210>157<211>45<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>157agagaactag taaaaaggag ataaccatgt tagatactaa taaag 45<210>158<211>46<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>158cgtgctgaca taaaataata tttttttaat ttttttagtg tacttt46<210>159<211>506<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>159Met Leu Asp Thr Asn Lys Val Tyr Glu Ile Ser Asn His Ala Asn Gly1 5 10 15Leu Tyr Ala Ala Thr Tyr Leu Ser Leu Asp Asp Ser Gly Val Ser Leu20 25 30Met Asn Lys Asn Asp Asp Asp Ile Asp Asp Tyr Asn Leu Lys Trp Phe35 40 45Leu Phe Pro Ile Asp Asp Asp Gln Tyr Ile Ile Thr Ser Tyr Ala Ala50 55 60Asn Asn Cys Lys Val Trp Asn Val Asn Asn Asp Lys Ile Asn Val Ser65 70 75 80Thr Tyr Ser Ser Thr Asn Ser Ile Gln Lys Trp Gln Ile Lys Ala Asn85 90 95Gly Ser Ser Tyr Val Ile Gln Ser Asp Asn Gly Lys Val Leu Thr Ala100 105 110Gly Thr Gly Gln Ala Leu Gly Leu Ile Arg Leu Thr Asp Glu Ser Ser115 120 125Asn Asn Pro Asn Gln Gln Trp Asn Leu Thr Ser Val Gln Thr Ile Gln130 135 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His Ser Tyr Glu Glu Val Glu Glu Ile Thr355 360 365Asn Ile Pro Lys Ser Thr Leu Lys Lys Leu Lys Lys Tyr Tyr Phe Met370 375 380Ser Ala Arg Glu Val His Ile Asp Val Asn Asn Lys Thr Gly His Thr385 390 395 400Leu Gln Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu Asp Gly Gly Arg Trp Arg Thr405 410 415Ser Pro Thr Asn Val Ala Asn Asp Gln Ile Lys Thr Phe Val Ala Glu420 425 430Ser Asn Gly Phe Met Thr Gly Thr Glu Gly Thr Ile Tyr Tyr Ser Ile435 440 445Asn Gly Glu Ala Glu Ile Ser Leu Tyr Phe Asp Asn Pro Phe Ala Gly450 455 460Ser Asn Lys Tyr Asp Gly His Ser Asn Lys Ser Gln Tyr Glu Ile Ile465 470 475 480Thr Gln Gly Gly Ser Gly Asn Gln Ser His Val Thr Tyr Thr Ile Gln485 490 495Thr Thr Ser Ser Arg Tyr Gly His Lys Ser500 505<210>160<211>1521<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>160atgttagata ctaataaagt ttatgaaata agcaatcatg ctaatggact atatgcagca 60acttatttaa gtttagatga ttcaggtgtt agtttaatga ataaaaatga tgatgatatt 120gatgattata acttaaaatg gtttttattt cctattgatg atgatcaata tattattaca 180agctatgcag caaataattg taaagtttgg aatgttaata atgataaaat aaatgtttcg 240acttattctt caacaaattc aatacaaaaa tggcaaataa aagctaatgg ttcttcatat 300gtaatacaaa gtgataatgg aaaagtctta acagcaggaa ccggtcaagc tcttggattg 360atacgtttaa ctgatgaatc ctcaaataat cccaatcaac aatggaattt aacttctgta 420caaacaattc aacttccaca aaaacctata atagatacaa aattaaaaga ttatcccaaa 480tattcaccaa ctggaaatat agataatgga acatctcctc aattaatggg atggacatta 540gtaccttgta ttatggtaaa tgatccaaat atagataaaa atactcaaat taaaactact 600ccatattata ttttaaaaaa atatcaatat tggcaacgag cagtaggaag taatgtagct 660ttacgtccac atgaaaaaaa atcatatact tatgaatggg gcacagaaat agatcaaaaa 720acaacaatta taaatacatt aggatttcaa atcaatatag attcaggaat gaaatttgat 780ataccagaag taggtggagg tacagatgaa ataaaaacac aactaaatga agaattaaaa 840atagaatata gtcatgaaac taaaataatg gaaaaatatc aagaacaatc tgaaatagat 900aatccaactg atcaatcaat gaattctata ggatttctta ctattacttc cttagaatta 960tatagatata atggctcaga aattcgtata atgcaaattc aaacctcaga taatgatact 1020tataatgtta cttcttatcc aaatcatcaa caagctttat tacttcttac aaatcattca 1080tatgaagaag tagaagaaat aacaaatatt cctaaaagta cactaaaaaa attaaaaaaa 1140tattatttta tgtcagcacg tgaagtacac attgatgtaa ataataagac aggtcataca 1200ttacaattag aagataaaac aaaacttgat ggtggtagat ggcgaacatc acctacaaat 1260gttgctaatg atcaaattaa aacatttgta gcagaatcaa atggttttat gacaggtaca 1320gaaggtacta tatattatag tataaatgga gaagcagaaa ttagtttata ttttgacaat 1380ccttttgcag gttctaataa atatgatgga cattccaata aatctcaata tgaaattatt 1440acccaaggag gatcaggaaa tcaatctcat gttacgtata ctattcaaac cacatcctca 1500cgatatgggc ataaatcata a 1521<210>161<211>23<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>161gatratratc aatatattat tac 23<210>162<211>20<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>162caaggtarta atgtccatcc 20<210>163<211>24<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>163gatgatgrtm rakwwattat trca24<210>164<211>24<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>164gatgatgrtm ratatattat trca24<210>165<211>23<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>165ggawgkrcdy twdtmccwtg tat 23<210>166<211>23<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>166ggawgkacry tadtaccttg tat 2权利要求
1.编码杀虫蛋白的分离多核苷酸，其中所述蛋白质包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO52、SEQ ID NO54、SEQ ID NO56、SEQ ID NO58、SEQ ID NO60、SEQ ID NO62、SEQ ID NO64、SEQ ID NO66、SEQ ID NO68、SEQ ID NO70、SEQ ID NO72、SEQ ID NO74、SEQ ID NO76、SEQ ID NO78、SEQ ID NO80、SEQ ID NO82、SEQ ID NO84、SEQ ID NO86、SEQ ID NO88、SEQ ID NO90、SEQ ID NO92、SEQ ID NO94、SEQ ID NO96、SEQ ID NO98、SEQ ID NO100、SEQ ID NO102、SEQ ID NO104、SEQ ID NO106、SEQ ID NO108、SEQ ID NO110、SEQ ID NO112、SEQ ID NO114、SEQ ID NO116、SEQ ID NO118、SEQ ID NO120、SEQ ID NO122、SEQ ID NO124、SEQ ID NO126、SEQ ID NO134、SEQ ID NO136、SEQ ID NO138、SEQ ID NO140、SEQ ID NO142、SEQ ID NO144、SEQ ID NO146、SEQ ID NO148、SEQ ID NO150、SEQ ID NO152、SEQ ID NO154、SEQ ID NO159，及其变体。
2.编码杀虫蛋白的分离多核苷酸，其中所述多核苷酸的互补链与选自下组的核苷酸序列可发生杂交SEQ ID NO46、SEQ ID NO47、SEQ ID NO48、SEQ ID NO49、SEQ ID NO50、SEQ ID NO51、SEQ ID NO53、SEQ ID NO55、SEQ ID NO57、SEQ ID NO59、SEQ ID NO61、SEQ ID NO63、SEQ ID NO65、SEQ ID NO67、SEQ ID NO69、SEQ ID NO71、SEQ ID NO73、SEQ ID NO75、SEQ ID NO77、SEQ ID NO79、SEQ ID NO81、SEQ ID NO83、SEQ ID NO85、SEQ ID NO87、SEQ ID NO89、SEQ ID NO91、SEQ ID NO93、SEQ ID NO95、SEQ ID NO97、SEQ ID NO99、SEQ ID NO101、SEQ ID NO103、SEQ ID NO105、SEQ ID NO107、SEQ ID NO109、SEQ ID NO111、SEQ ID NO113、SEQ ID NO115、SEQ ID NO117、SEQ ID NO119、SEQ ID NO121、SEQ ID NO123、SEQ ID NO125、SEQ ID NO131、SEQ ID NO132、SEQ ID NO133、SEQ ID NO135、SEQ ID NO137、SEQ ID NO139、SEQ ID NO141、SEQ ID NO143、SEQ ID NO145、SEQ ID NO147、SEQ ID NO149、SEQ ID NO151、SEQ ID NO153、SEQ ID NO155、SEQ ID NO156、SEQ ID NO157、SEQ ID NO158、SEQ ID NO160、SEQ ID NO161、SEQ ID NO162、SEQ ID NO163、SEQ ID NO164、SEQ ID NO165、和SEQ ID NO166。
3.一种分离的杀虫蛋白，其中所述蛋白质包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO52、SEQ ID NO54、SEQ ID NO56、SEQ ID NO58、SEQ ID NO60、SEQ ID NO62、SEQ ID NO64、SEQ ID NO66、SEQ ID NO68、SEQ ID NO70、SEQ ID NO72、SEQ ID NO74、SEQ ID NO76、SEQ ID NO78、SEQ ID NO80、SEQ ID NO82、SEQ ID NO84、SEQ ID NO86、SEQ ID NO88、SEQ ID NO90、SEQ ID NO92、SEQ ID NO94、SEQ ID NO96、SEQ ID NO98、SEQ ID NO100、SEQ ID NO102、SEQ ID NO104、SEQ ID NO106、SEQ ID NO108、SEQ ID NO110、SEQ ID NO112、SEQ ID NO114、SEQ ID NO116、SEQ ID NO118、SEQ ID NO120、SEQ ID NO122、SEQ ID NO124、SEQ ID NO126、SEQ ID NO134、SEQ ID NO136、SEQ ID NO138、SEQ ID NO140、SEQ ID NO142、SEQ ID NO144、SEQ ID NO146、SEQ ID NO148、SEQ ID NO150、SEQ ID NO152、SEQ ID NO154、SEQ ID NO159，及其变体。
4.包含分离多核苷酸的转基因宿主细胞，其中所述细胞是植物细胞或微生物细胞，而且所述蛋白质包含选自下组的氨基酸序列SEQID NO52、SEQ ID NO54、SEQ ID NO56、SEQ ID NO58、SEQ IDNO60、SEQ ID NO62、SEQ ID NO64、SEQ ID NO66、SEQ ID NO68、SEQ ID NO70、SEQ ID NO72、SEQ ID NO74、SEQ ID NO76、SEQ ID NO78、SEQ ID NO80、SEQ ID NO82、SEQ ID NO84、SEQ ID NO86、SEQ ID NO88、SEQ ID NO90、SEQ ID NO92、SEQ ID NO94、SEQ ID NO96、SEQ ID NO98、SEQ ID NO100、SEQ ID NO102、SEQ ID NO104、SEQ ID NO106、SEQ ID NO108、SEQ ID NO110、SEQ ID NO112、SEQ ID NO114、SEQ ID NO116、SEQ ID NO118、SEQ ID NO120、SEQ ID NO122、SEQ ID NO124、SEQ ID NO126、SEQ ID NO134、SEQ ID NO136、SEQ ID NO138、SEQ ID NO140、SEQ ID NO142、SEQ ID NO144、SEQ ID NO146、SEQ ID NO148、SEQ ID NO150、SEQ ID NO152、SEQ ID NO154、SEQ ID NO159，及其变体。
5.权利要求4的转基因宿主细胞，其中所述细胞表达分离的、大约10-15kDa的杀虫蛋白和分离的、大约40-50kDa的杀虫蛋白。
6.权利要求4的转基因宿主细胞，其中所述细胞是植物细胞。
7.权利要求4的转基因宿主细胞，其中所述宿主细胞是玉米细胞。
8.权利要求4的转基因宿主细胞，其中所述宿主细胞是玉米根细胞。
9.权利要求4的转基因宿主细胞，其中所述宿主细胞是微生物细胞。
10.控制非哺乳类害虫的方法，其中所述方法包括将所述害虫与分离的杀虫蛋白进行接触，其中所述蛋白质包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO52、SEQ ID NO54、SEQ ID NO56、SEQ ID NO58、SEQ ID NO60、SEQ ID NO62、SEQ ID NO64、SEQ ID NO66、SEQ ID NO68、SEQ ID NO70、SEQ ID NO72、SEQ ID NO74、SEQ ID NO76、SEQ ID NO78、SEQ ID NO80、SEQ ID NO82、SEQ ID NO84、SEQ ID NO86、SEQ ID NO88、SEQ ID NO90、SEQ ID NO92、SEQ ID NO94、SEQ ID NO96、SEQ ID NO98、SEQ ID NO100、SEQ ID NO102、SEQ ID NO104、SEQ ID NO106、SEQ ID NO108、SEQ ID NO110、SEQ ID NO112、SEQ ID NO114、SEQ ID NO116、SEQ ID NO118、SEQ ID NO120、SEQ ID NO122、SEQ ID NO124、SEQ ID NO126、SEQ ID NO134、SEQ ID NO136、SEQ ID NO138、SEQ ID NO140、SEQ ID NO142、SEQ ID NO144、SEQ ID NO146、SEQ ID NO148、SEQ ID NO150、SEQ ID NO152、SEQ ID NO154、SEQ ID NO159，及其变体。
11.权利要求10的方法，其中所述方法包括将所述害虫与大约10-15kDa的杀虫蛋白和40-50kDa的杀虫蛋白进行接触，其中至少一种所述蛋白质包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO52、SEQ IDNO54、SEQ ID NO56、SEQ ID NO58、SEQ ID NO60、SEQ ID NO62、SEQ ID NO64、SEQ ID NO66、SEQ ID NO68、SEQ ID NO70、SEQ ID NO72、SEQ ID NO74、SEQ ID NO76、SEQ ID NO78、SEQ ID NO80、SEQ ID NO82、SEQ ID NO84、SEQ ID NO86、SEQ ID NO88、SEQ ID NO90、SEQ ID NO92、SEQ ID NO94、SEQ ID NO96、SEQ ID NO98、SEQ ID NO100、SEQ ID NO102、SEQ ID NO104、SEQ ID NO106、SEQ ID NO108、SEQ ID NO110、SEQ ID NO112、SEQ ID NO114、SEQ ID NO116、SEQ ID NO118、SEQ ID NO120、SEQ ID NO122、SEQ ID NO124、SEQ ID NO126、SEQ ID NO134、SEQ ID NO136、SEQ ID NO138、SEQ ID NO140、SEQ ID NO142、SEQ ID NO144、SEQ ID NO146、SEQ ID NO148、SEQ ID NO150、SEQ ID NO152、SEQ ID NO154、SEQ ID NO159，及其变体。
12.权利要求10的方法，其中所述害虫是鞘翅目害虫。
13.权利要求10的方法，其中所述害虫是玉米根虫。
14.权利要求10的方法，其中所述害虫是玉米幼芽根叶甲。
15.权利要求10的方法，其中所述害虫是鳞翅目害虫。
16.一种分离的杀虫蛋白，其中所述蛋白质可由选自下组的苏云金芽孢杆菌分离物获得PS185GG、PS18761、PS187Y2、PS201G，PS201HH2，PS242K10，PS69Q，KB54A1-6，KR589，PS185L12，PS185W3，PS187L14，PS186FF，PS131W2，PS158T3，PS158X10，PS185FF，PS187F3，PS201H2，PS201L3，PS203G2，PS203J1，PS204C3，PS204G4，PS204I11，PS204J7，PS236B6，PS246P42，KR1209，和KR1369.
17.编码杀虫蛋白的分离多核苷酸，其中所述蛋白质可由选自下组的苏云金芽孢杆菌分离物获得PS185GG，PS187G1，PS187Y2，PS201G，PS201HH2，PS242K10，PS69Q，KB54A1-6，KR589，PS185L12，PS185W3，PS187L14，PS186FF，PS131W2，PS158T3，PS158X10，PS185FF，PS187F3，PS201H2，PS201L3，PS203G2，PS203J1，PS204C3，PS204G4，PS204I11，PS204J7，PS236B6，PS246P42，KR1209，和KR1369.
18.选自下组的苏云金芽孢杆菌分离物的生物学纯培养物PS185GG，PS187G1，PS187Y2，PS201G，PS201HH2，PS242K10，PS69Q，KB54A1-6，KR589，PS185L12，PS185W3，PS187L14，PS186FF，PS131W2，PS158T3，PS158X10，PS185FF，PS187F3，PS201H2，PS201L3，PS203G2，PS203J1，PS204C3，PS204G4，PS204I11，PS204J7，PS236B6，PS246P42，KR1209，和KR1369.
19.编码杀虫蛋白的分离多核苷酸，其中所述蛋白质包含选自下组的氨基酸序列的至少10个连续氨基酸SEQ ID NO52、SEQ ID NO54、SEQ ID NO56、SEQ ID NO58、SEQ ID NO60、SEQ ID NO62、SEQ ID NO64、SEQ ID NO66、SEQ ID NO68、SEQ ID NO70、SEQ ID NO72、SEQ ID NO74、SEQ ID NO76、SEQ ID NO78、SEQ ID NO80、SEQ ID NO82、SEQ ID NO84、SEQ ID NO86、SEQ ID NO88、SEQ ID NO90、SEQ ID NO92、SEQ ID NO94、SEQ ID NO96、SEQ ID NO98、SEQ ID NO100、SEQ ID NO102、SEQ ID NO104、SEQ ID NO106、SEQ ID NO108、SEQ ID NO110、SEQ ID NO112、SEQ ID NO114、SEQ ID NO116、SEQ ID NO118、SEQ ID NO120、SEQ ID NO122、SEQ ID NO124、SEQ ID NO126、SEQ ID NO134、SEQ ID NO136、SEQ ID NO138、SEQ ID NO140、SEQ ID NO142、SEQ ID NO144、SEQ ID NO146、SEQ ID NO148、SEQ ID NO150、SEQ ID NO152、SEQ ID NO154、SEQ ID NO159。
20.编码杀虫蛋白的分离多核苷酸，其中所述多核苷酸包含选自下组的核苷酸序列的至少10个连续核苷酸SEQ ID NO46、SEQ ID NO47、SEQ ID NO48、SEQ ID NO49、SEQ ID NO50、SEQ ID NO51、SEQ ID NO53、SEQ ID NO55、SEQ ID NO57、SEQ ID NO59、SEQ ID NO61、SEQ ID NO63、SEQ ID NO65、SEQ ID NO67、SEQ ID NO69、SEQ ID NO71、SEQ ID NO73、SEQ ID NO75、SEQ ID NO77、SEQ ID NO79、SEQ ID NO81、SEQ ID NO83、SEQ ID NO85、SEQ ID NO87、SEQ ID NO89、SEQ ID NO91、SEQ ID NO93、SEQ ID NO95、SEQ ID NO97、SEQ ID NO99、SEQ ID NO101、SEQ ID NO103、SEQ ID NO105、SEQ ID NO107、SEQID NO109、SEQ ID NO111、SEQ ID NO113、SEQ ID NO115、SEQ ID NO117、SEQ ID NO119、SEQ ID NO121、SEQ ID NO123、SEQ ID NO125、SEQ ID NO131、SEQ ID NO132、SEQ ID NO133、SEQ ID NO135、SEQ ID NO137、SEQ ID NO139、SEQ ID NO141、SEQ ID NO143、SEQ ID NO145、SEQ ID NO147、SEQ ID NO149、SEQ ID NO151、SEQ ID NO153、SEQ ID NO155、SEQ ID NO156、SEQ ID NO157、SEQ ID NO158、SEQ ID NO160、SEQ ID NO161、SEQ ID NO162、SEQ ID NO163、SEQ ID NO164、SEQ ID NO165、和SEQ ID NO166。
21.一种分离的杀虫蛋白，其中所述蛋白质包含选自下组的氨基酸序列的至少10个连续氨基酸SEQ ID NO52、SEQ ID NO54、SEQID NO56、SEQ ID NO58、SEQ ID NO60、SEQ ID NO62、SEQ IDNO64、SEQ ID NO66、SEQ ID NO68、SEQ ID NO70、SEQ ID NO72、SEQ ID NO74、SEQ ID NO76、SEQ ID NO78、SEQ ID NO80、SEQ ID NO82、SEQ ID NO84、SEQ ID NO86、SEQ ID NO88、SEQ ID NO90、SEQ ID NO92、SEQ ID NO94、SEQ ID NO96、SEQ ID NO98、SEQ ID NO100、SEQ ID NO102、SEQ ID NO104、SEQ ID NO106、SEQ ID NO108、SEQ ID NO110、SEQ ID NO112、SEQ ID NO114、SEQ ID NO116、SEQ ID NO118、SEQ ID NO120、SEQ ID NO122、SEQ ID NO124、SEQ ID NO126、SEQ ID NO134、SEQ ID NO136、SEQ ID NO138、SEQ ID NO140、SEQ ID NO142、SEQ ID NO144、SEQ ID NO146、SEQ ID NO148、SEQ ID NO150、SEQ ID NO152、SEQ ID NO154、SEQ ID NO159。
全文摘要
本发明涉及杀虫活性蛋白质的新种类，及编码这些蛋白质的多核苷酸序列。在优选的实施方案中，这些杀虫蛋白的分子量为大约40－50kDa和大约10－15kDa。
文档编号A01H1/00GK1408023SQ00801757
公开日2003年4月2日 申请日期2000年8月21日 优先权日1999年8月20日
发明者K·E·纳瓦, H·E·施奈普, M·克努斯, M·R·保拉德, G·A·卡迪尼奥, G·E·史瓦伯, T·E·米歇尔斯, 李 S·芬斯塔德, P·迪耶尔, J·杜吉洛, L·斯坦普, R·A·赫尔曼 申请人:麦考根公司