专利名称：植物活化剂及其制备方法,活化方法、活性促进剂及其使用方法
技术领域：
本发明涉及植物活化剂及其制备方法，其目的是从哈茨木霉SK-5-5(Trichoderma hurzianum SK-5-5)菌的培养基提取物中获得具有抗丝状菌及细菌性的物质。
另外，涉及植物的活化方法及植物的活性促进剂及其使用方法，其目的是通过哈茨木霉菌SK-5-5分生孢子的生成物给予植物的根、茎、叶等对病原菌的抵抗性。
近来大力提倡降低农药保全生态系统的病害防治策略，特别是，由于考虑到生物防治方法对环境负荷的影响要小，所以进行了努力研究。
将从植物的根和根际分离出的细菌和真菌中有植物生长促进作用的菌分别称之为植物生长促进根部菌(plant growth-promotingrhizobacteria，PGPR)、植物生长促进真菌(plant growth-promotingfungi，PGPF)。
已知上述根际微生物PGPR和PGPF不仅促进植物的生长，而且抑制各种土壤病害。另外，最近有事实表明它们不仅可抑制土壤病害而且可抑制地上病害，上述PGPR和PGPF与诱导植物全身的抵抗性相关(1999年6月，《今月の农业》)。
另外有报道表明，从朝鲜矮草(コウラ亻氵バ)分离筛选出的基点霉(Phoma)、木霉菌属、镰刀菌属、青霉属、Sterile等菌诱导黄瓜对炭疽病的抵抗性(1999年6月，《今月の农业》)。
本发明以获得对植物病原菌有抗菌性的物质为课题进行了研究，从北海道十胜地方的土壤中分离出Trichoderma hurzianum SK-5-5(哈茨木霉SK-5-5)。该菌对占植物病原菌80％的土壤传染性病原丝状菌有广泛的拮抗性，现在作为矮草(芝)的ブラウンバツチ、ラ-ジバツチ等抗丝核菌(Rhizoctonia)类微生物农药(活菌制剂)正在开发中。上述哈茨木霉菌的拮抗作用是通过互相接触菌丝发生共连接，促使细胞质凝集而使之死亡的。从其外在观察经过看，并没有如青霉菌(Penicillium sp)等生产的抗生素那样在培养基上显示抑菌圈那么高的活性，推测是菌丝间接触而表达的物质。
认为上述细胞质凝集作用是由哈茨木霉菌SK-5-5生产的什么物质所引起的，对此进行研究证明，将之作为第一目标。
本发明中所使用的哈茨木霉菌SK-5-5株保藏于日本国通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(地址日本国茨城县筑波市东1丁目1番3号)(生命研)，保藏号为“微工研菌寄第13327号”(保藏日1992年12月9日；保藏者株式会社北海道绿兴产)。根据布达佩斯条约由原保藏转移到保藏的请求是在1992年12月9日进行的，保藏号为BP-4346。
因为以往的PGPR和PGPF对炭疽病的有效性限于特定植物(例如黄瓜)，所以今后的研究结果是，通过改善其使用方法等，判断其对其它植物、病原菌有效的可能性，所针对的具体植物、病原菌是今后的课题。
但是以往生物农药的思考模式是仅仅杀灭病原菌，应该向赋予的抵抗性波及到植物根茎这样的方向转变，这包含今后植物栽培上重要的提示。
本发明对哈茨木霉菌株SK-5-5反复进行各种实验的过程中，想到了要与上述生物农药的将来性一致，还选定、研究了使用方法、对象植物等，完成了本发明。本发明非常有望对将来植物栽培产生很大的影响，无疑是支持将来农业的重要手段之一。
另外，本发明通过在植物栽培时，让哈茨木霉菌SK-5-5的分生孢子共存于土壤中使之增殖，可以确认其生成物赋予各种植物的根茎活性、提高其耐菌性，本发明发展改善了以往存在的问题，确立了其实用性。
即，有关活化剂的发明是，植物活化剂，其特征为用固体培养基培养哈茨木霉菌SK-5-5，提取物为对丝状菌具有抵抗性。另外，另一发明是植物活化剂，其特征为用液体培养基培养哈茨木霉菌SK-5-5，提取物对细菌的一种金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus 209p)具有抗菌力。
有关制备方法的发明是植物活化剂的制备方法，其特征为将哈茨木霉菌SK-5-5接种到固体培养基上，25-30℃静置培养7-15天以后，抽提，得到上述活性剂。还有，植物活化剂的制备方法，其特征为将哈茨木霉菌SK-5-5接种到液体培养基上，25-30℃静置培养4-10天以后，抽提，得到上述活性剂。
本发明中所使用的固体培养基为米培养基。米培养基是由米100％，大豆粕3％，灭菌水10％构成的固体培养基，为了不让培养中培养基表面干燥，添加了灭菌水。
本发明中所使用的液体培养基为葡萄糖3％-5％，聚胨0.5％，NaCl 0.8％，酵母提取物0.2％，碳酸钙1.0％。
上述固体培养基和液体培养基具有各自的特性，可生成不同的物质。产生该结果的机制尚不清楚，仔细考虑是由于对哈茨木霉菌SK-5-5刺激及其它作用的不同且与培养基构成物质相关的特性，而生成不同的物质，充分研究用上述米培养基和液体培养基之外成分的培养基培养也可生成同样的物质，而且提高生成效率等今后的研究课题很多。
活化方法的发明是植物活化方法，其特征为栽培植物时施加哈茨木霉菌SK-5-5分生孢子的施用手段，使之共存于赋予上述植物活性的土壤中；植物活化方法，栽培植物时施加哈茨木霉SK-5-5菌分生孢子的施用手段，使之共存于赋予上述植物活性的土壤中，发生增殖，持续生成对丝状菌具有抗菌力的物质的植物活化方法。另外，特征为栽培植物时施加哈茨木霉SK-5-5菌分生孢子的施用手段，使之共存于赋予上述植物活性的土壤中，同时施加上述分生孢子增殖促进条件的植物活化方法，分生孢子的施用手段为植物的种子处理、土壤和分生孢子的混和、分生孢子的撒布、灌水或埋没等。再者，增殖促进条件为土壤温度15-30℃、水分30％以上的条件；其它的增殖促进条件为给土壤赋予可增殖的通气性或含气性。
其它发明是植物活化促进剂，其特征为将哈茨木霉SK-5-5菌分生孢子附着到多孔性陶瓷粒子等其它载体上；植物活化促进剂，其特征为将哈茨木霉SK-5-5菌分生孢子与无菌处理的无机粒子混和，或将哈茨木霉SK-5-5菌分生孢子附着到无机粒子，使上述无机粒子与其它粒子混和。另外，植物活化促进剂，其特征为培养哈茨木霉SK-5-5菌的分生孢子，将之与培养基一起适量等份分离，与营养成分(例如壳聚糖)一起附着到无菌的多孔质粒子上后，对每个包装定量；植物活化促进剂，其特征为用液体培养基使哈茨木霉SK-5-5菌分生孢子增殖，与营养成分一起附着到无菌的多孔质粒子上后，将多孔质粒平均定量包装。
其它的发明是，植物活化促进剂的使用方法，其特征为将上述植物活化促进剂混入育苗土壤中，或育苗时将之撒布到土壤中或撒布到苗圃中。此时，活化促进剂的使用量为每1平方米撒布5g-100g 5×104/g-5×109/g的哈茨木霉SK-5-5菌，或者每1立方米栽培土混入5g-100g。
上述发明中的植物为甜菜、甜瓜、玉米、水稻、甘蓝和洋葱等，确认对采集根、茎、叶及果实的植物有何效果，明确其效果除收量增加、糖度增加外还有其它的作用。
上述发明中，培养哈茨木霉SK-5-5菌分生孢子，检测其分离纯化产物时，根据UV吸收光谱、质谱及NMR测定结果，判定为含Aib(α-氨基异丁酸，α-Aminoisobutyric acid)的多肽的肽醇(Peptibols)类。肽醇类抗生素的特征为氨基酸序列中含有α-氨基异丁酸(Aib)，N末端为乙酰基，C末端为氨基醇键(多为苯丙氨醇(Phenylalaniol)基)。其纯化产物有A成分、B成分、D成分，通过质谱，推测其部分氨基酸序列如下，与已经存在的肽醇类的氨基酸序列检索的结果是，没有与其结构一致的物质，推测它为新型肽醇类。因为E的氨基酸序列推测比较困难，所以不能判断。
UV吸收波长4种成分均为末端吸收A成分＝1933B成分＝1949或1964D成分＝1810E成分＝1829推测结构A成分Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-Aib-Gln-Aib-Aib-……B成分Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Val-Aib-Gln-Aib-Aib-……D成分Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-……如前所述，生成物质的氨基酸序列是新序列，由植物的根吸收，到达茎和叶，然后消失。因此，尽管不知收获时植物的根、茎、叶是否均有残留，但推测在最初(发芽以后的幼茎等)被植物吸收的阶段，使植物的DNA发生什么变化或者残留下来。不知为什么，一旦植物获得抗菌性，不管其分化生成根、茎等，抗菌性能够持续。因此，与赋予免疫性(活化)类似，在幼苗时或比较幼小的植物(基本上植物的增殖期)时施用，没必要再使用，一旦具有活性，其效力能持续植物的一生。
本发明的哈茨木霉SK-5-5菌分生孢子，在植物幼苗时期或在播种时期混入到覆土中，伴随分生孢子的增殖，生成物质也增加，被根吸收到达茎、叶，使整体活化(有如赋予免疫力)，因此，即便当采摘植物生长的根或果实时期(例如，播种后1-6个月)，也能保持上述抗菌性。因此，许多植物均可通过一次处理(撒布及其它的手段)赋予其活性后，有效达到其目的。
本发明中分生孢子的载体是多孔陶瓷粒子(例如，麦饭石的粒子)，它是在壳聚糖溶液中浸渍，将水蒸发而形成的。粒子的大小无特殊限制，为了处理容易，优选直径为0.5mm-5mm左右。上述载体不限定于多孔陶瓷粒子(天然或人工)，可使用对分生孢子无不良影响的物质。
将预先培养的哈茨木霉SK-5-5菌以5×104/g-5×109/g附着到上述多孔质粘粒子上，使每1m2撒布5g-100g。此时，有时与水一起撒布，但灌水有时是为了供给水分时，有时是均等浸透分生孢子，使之在土壤中均匀分布。
当上述哈茨木霉SK-5-5菌的量不足5×104/g时，若上述菌的繁殖未受到抑制，是会增殖的，但有时不知什么原因不发生增殖，这是一个目标。但细菌的增殖因环境的不同而有显著差异，所以通过使用后的环境整理，即便再少量(例如不满5g)的菌，也要按植物的发育使之增殖，以得到必要量的生产物质。
另一方面，菌量的上限在5×109/g以下时，不必要从上述生产物质的关系进行考虑。菌增殖条件较差时，要施用较高浓度，但不必要超过5×109/g。
本发明的哈茨木霉SK-5-5菌通常以分生孢子施用，但当施用的环境恶劣(例如高温时、寒冷时)时，优选施用厚膜孢子。
用固体培养基或液体培养基或其它培养基培养本发明的哈茨木霉SK-5-5菌，抽提其生成物，将之以植物活化剂施用时，0.1-1g/m2是必要的。
另外，当撒布分生孢子时，该分生孢子的增殖下限菌数(例如5×109/g)是必要的。
本发明的植物活化剂为菌时，只施用1次即可，到收获前没必要施用。这一点与普通农药不同，其机制不明，但推测可能对植物的DNA产生某种程度的影响，或生成物质微量残留到植物的根、茎、叶中，发挥上述特性。
上面在施用分生孢子时，在苗圃等中，分生孢子充分增殖，一旦达到饱和，分生孢子急速丧失活性，随后消失。有时，可以认为还有一部分分生孢子残留，当增殖条件良好时也可再度增殖。
用固体培养基或液体培养基培养本发明的哈茨木霉SK-5-5菌，分离、纯化其生成物质中的A、B、C、D、E成分，活性物质为具有新型氨基酸序列的新物质，其分子量为A成分＝192，B成分＝206，C成分＝168，D1＝154，D2＝220，推测该氨基酸及其附近物质对植物的活化有效。
于是，通过在所设定的浓度(例如1g中5×105以上)以上施用哈茨木霉SK-5-5菌的分生孢子(混用到土壤中，或撒布到有根植物的根际中)，可证实达到预期目的。大致按不同植物的最适成分或混用的比例即可。
于是，用传统的方法大量培养哈茨木霉SK-5-5菌，抽提、纯化其生成物质，可得到植物的活化剂。证明上述生成物质为上述A成分、B成分、C成分、D成分和E成分。
上述发明对各种植物有效，根据实验结果证实在水稻、玉米、甜菜、甜瓜、马铃薯、甘薯、草莓、洋葱、甘蓝等有效。
用固体培养基培养本发明的哈茨木霉SK-5-5菌时，可以看到如表2所示，它对丝状菌显示抗菌性。
用液体培养基培养本发明的哈茨木霉SK-5-5菌时，可以看到如表2所示，它对细菌有效。
根据本发明，在植物的发育初期，将哈茨木霉SK-5-5菌每适量混入到床土中，或通过发育时的撒布等施用到根际，可活化植物，改善其根、茎、叶，防止罹患疾病，对病原菌产生耐性。这样不仅可大大减少发育时期的发病，而且有促进植物的发育，提高收成，增加糖度等多种效果。
但上述效果推测是哈茨木霉SK-5-5菌分生孢子的生成物质(例如，新型氨基酸)所致，由于看到上述分生孢子在增殖后，或上述生成物质，到植物的成长终期有些消失，无任何有意义的影响，且连续使用也未见到任何不良影响。再者，因为看到上述生成物质为新型氨基酸及其周边物质，所以微量残留到植物的叶茎也无害。
另外，可以看到这样的特性由于本发明的哈茨木霉SK-5-5菌在土壤中增殖，当环境条件适于增殖时，即使当初撒布浓度不足时，通过补给增殖产生的必要量的生成物质也可达到预期目的，然后自然消失。不必说对人体的影响，对土壤、植物及其它环境破坏的忧虑皆无。再者可以预测，对连续栽培不良的作物也能解除其连续栽培带来的不利影响。
图2
图1的放大图。
图3A成分的UV吸收波长图。
图4A成分的1H-NMR(CD3OD)。
图5(a)(b)A成分的质谱图。
图6B成分的UV吸收波长图。
图7
B成分的1H-NMR图。
图8(a)(b)B成分的质谱图。
图9D成分的UV吸收波长图。
图10D成分的1H-NMR图。
图11(a)(b)D成分的质谱图。
图12E成分的UV吸收波长图。
图13E成分的1H-NMR图。
图14(a)(b)E成分的质谱图。
图15A成分的UV吸收波长图。
图16A成分的HPLC图。
图17
图16检测出的A峰的质谱图。
图18B成分的UV吸收波长图。
图19B成分的HPLC图。
图20
图19检测出的A峰的质谱。
图21C成分的UV吸收波长图。
图22C成分的HPLC图。
图23图22检测出的A峰的质谱图。
图24C成分的质谱图。
图25C成分峰的1H-NMR(CD3OD)图。
图26C成分的结构图。
图27D成分的UV吸收波长图。
图28D成分的HPLC图。
图29(a)表示UVλ230nm处检测出的D1成分显示图。
(b)表示UV末端吸收的D1成分和RT差0.6处检测出的D2成分的图。
图30(a)图29检测出的D1成分的质谱图。
(b)图29检测出的D2成分的质谱图。
图31米培养基的培养提取物纯化过程系统图。
图32B培养基I的培养提取物纯化过程系统图。
图33新物质(MW198)1、2、3的衍生物的结构图。
图34施用于洋葱时，越冬前的发育调查部分的说明图。
图35洋葱鳞茎直径和叶面积的相关图。
斜面培养基的组成燕麦 5.0％蔗糖5.0％琼脂1.0％28℃培养5天后，冷藏保存。
(培养)培养用500ml三角烧瓶，用米培养基(A培养基)和液体培养基(B培养基I)2种。A培养基的条件是28℃静置培养(培养途中添加10ml灭菌水)，B培养基I的培养是28℃下270rpm振荡培养。
培养基组成A培养基米100％大豆粕3％灭菌水10％培养基组成 B培养基I葡萄糖5.0％聚胨 0.5％NaCl 0.8％酵母提取物0.2％碳酸钙1.0％
(检测方法)检测均用纸盘平板法体外进行，供试菌应用下述菌。
(1)立枯丝核菌Rhizoctonia solani(AG-1IA)用由PDA(Nissui)1.3％、氯霉素0.002％构成的培养基作检测用培养基。将用钻孔器选出的丝核菌(Rhizoctonia)菌丝的前端涂到平板培养基的中央，放置到浸透了肉汤的纸盘中，观察菌丝的伸长情况。
(2)灰葡萄孢Botrytis cinerea用土豆-提取物20.0％、蔗糖2.0％、琼脂1.5％构成的培养基作检测用培养基。检测是将样品放到纸盘中风干后，涂到平皿中，将平皿放到培养箱中培养，观察纸盘周围是否形成抑制环。
(3)抗菌谱检测菌用下述检测菌测定抗菌谱枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ATCC6633Micrococcus luters ATCC6633金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus 209P大肠埃希氏菌Escherichia coli NIHJ酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae SHY3白假丝酵母Candida albicans M9001伪热带假丝酵母Candida pseudotropicalis M9035新型隐球酵母Cryptococcus neoformans M9010汉逊德巴利酵母Debaryomyces hansenii M9011三角酵母Trigonopsis variabilis M9031粟酒裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe M9025Hansenula schneggi IAM4269(培养方法)(1)A培养基培养方法立枯丝核菌Rhizoctonia solani(AG-1IA)活性产物分离纯化丝状菌Rhizoctonia solani(AG-1IA)的A培养基培养提取液中的活性物质。
将米100g和大豆粕3g加入到1只含A培养基(米培养基1kg)500ml的三角烧瓶中，制备相同条件下的10份培养基。灭菌后用エ-ゼ接种霉菌，28℃静置培养10天(为了使菌增殖良好，途中可振荡烧瓶。另外，若培养基的表面干涸，添加灭菌水)，然后加入2升50％丙酮水抽提。于是得到2升培养物50％丙酮的抽提液。
(2)B培养基培养方法金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus 209P活性物分离纯化细菌金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus 209P的B培养基培养提取液中的活性物质。
表1培养基讨论 为了更多生产液体培养基B培养基I的抗细菌活性成分，对比研究培养基组成中氮源和碳源比例不同的I-IV 4种培养基。各培养基用2只500ml三角烧瓶，培养5天后将培养液5倍浓缩，进行测定。
(3)B培养基I培养方法根据培养基检测的结果进行用B培养基I的纯化培养。
在500ml三角烧瓶中制备100mlB培养基(葡萄糖5.0％，聚胨0.5％，NaCl0.8％，酵母提取物0.2％，碳酸钙1.0％)。灭菌后种植细菌，28℃振荡培养5天。加入与1.5L培养液等量的丙酮，得到3L 50％丙酮提取液。
(纯化方法)(1)A培养基培养提取物纯化方法蒸去A培养基培养的2L 50％丙酮提取液的丙酮后，将其1L全部通过HP-20-Sephadex柱(60.0cm×4.5cmφ)，使之吸附。用等量的水洗涤后，用等量的50％丙酮洗脱，然后用等量的100％丙酮洗脱。用检测菌Rhizoctonia solani(AG-1IA)分别测定各级分后，可以确认活性物质是在100％丙酮洗脱部分中。接着，将100％丙酮洗脱部分浓缩到1L，得到1098mg的粗纯化物。将其中的100mg上展开剂为甲醇体系的LH-20柱(100.0cm×2.0cmφ)。测定级分，确认为活性级分。回收这些活性级分，然后用硅胶TLC(乙酸乙酯∶醋酸∶水＝5∶1∶1)展开，进行钼硫酸显色反应后，检测出Rf＝0.3附近的点。同时，在无活性级分的展开部分未检测出这些点。由此可以推测，活性物质为在Rf＝0.3附近可检测出的点，再进行纯化。硅胶PTLC展开(乙醋酸∶醋酸∶水＝5∶1∶1)，甲醇抽提后，用HPLC进行分离纯化。用仪器分析对分离纯化物进行鉴定(图31)。
(2)B培养基I培养提取物纯化方法蒸去B培养基培养的3L 50％丙酮提取液的丙酮后(1.5L)，将其1.5L全部通过活性炭吸附柱(60.0cm×2.0cmφ)，使之吸附。用等量的水洗涤后，用等量的50％丙酮洗脱，然后用等量的100％丙酮洗脱。用检测菌Staphylococcus aureus 209P分别测定各级分后，可以确认活性物质是在100％丙酮洗脱部分中。将100％丙酮洗脱部分浓缩到1.5L，用乙醋酸进行分配抽提，然后过用甲醇作展开剂的LH-20，用HPLC进行分离纯化。用仪器分析对分离纯化物进行鉴定(图32)。
(分离纯化物的生物活性法)(1)A培养基分离纯化物评价方法
4成分的生物评价法用由PDA(Nissui)1.3％、氯霉素0.002％构成的培养基作检测用培养基。将用钻孔器选出的Rhizoctonia solani(AG-1IA)菌丝的前端涂到平板培养基的中央，放上浸透了大小经过调整的分离物质的纸片，观察菌丝的伸长情况。(2)B培养基I纯化物评价方法C成分的生物评价法(MW168)分离纯化的C成分(MW168)为新物质，具有极单纯的结构。为了保持其作为母核的兴趣，扩大生物评价的范围。(3)细菌属的评价生物分析将加入了试验菌的琼脂培养基加入到平皿中，凝固。将含有样品的纸片放到其上，37℃培养18小时后，确认形成抑菌圈。(a)使用菌株使用Staphylococcus aureus 209P、Pseudomonas syringal(烟草野火病菌)、野油菜黄单胞菌柑橘致病变种XanthomonoasCampestris pv.Citri(柑橘溃疡病)、欧文氏菌Erwinia sp.(梅溃疡病)4菌株。(b)使用培养基预培养中使用肉汤培养基(DIFCO)，培养过夜后，稀释到×102，将之以0.5％混到上层培养基中，菌测定培养基用MYCIN AGAR(ミクニ化学)。上层--向MYCIN AGAR1.5％(ミクニ化学)+肉汤2％培养基(DIFCO)中加入0.5％的培养过夜后，稀释到102的培养液。下层--MYCIN AGAR(ミクニ化学)(c)抗菌测定用调整成1000ppm，500ppm，250ppm的分离纯化物浸透纸盘，风干后放到平皿中，37℃培养18小时，观察有无抑菌圈形成。(4)对葡萄球菌抗菌力(MIC)的测定
(a)使用菌株使用S.aureus 209P JC-1，第一代保存的临床分离的金黄色葡萄球菌20株(MSSA，MRSA各10株)及标准菌株E.coli NIHJ JC-2共22株。
(b)使用的抗菌药MW168，甲氧西林(DMPPC，注射用Staphcillin，批号FSB 19900ug/mg，万有制药)，万古霉素)(VCM，Lot.No.41HO457，10750 SIGMA)(c)使用培养基抗菌力测定中，使用Muller-Hinton agar(MIADifco)，预培养用Muller-Hinton肉汤(MHBDifco)。
(d)抗菌力测定按照日本化学疗法学会标准法，用琼脂平板稀释法测定各药物对使用菌株的最小发育抑制浓度(MIC)。将菌株涂到MHA上，37℃培养过夜，生长的菌落37℃在MHB上培养过夜，将其菌液稀释100倍(只有E.coli稀释1000倍)，为接种菌液。
(结果)(1)测定菌的结果A培养基和B培养基I的培养液活性如表2所示。用下述测定菌测定抗菌谱。
表2 A培养基培养抽提液中的检测结果是，观察到Rhizoctoniasolani(AG-1IA)的菌丝避开A培养基培养抽提物的纸盘。推测该菌生成的A培养基培养液中的活性物质为妨碍菌丝生长的物质。因此，尝试从A培养基培养液，以对Rhizoctonia solani(AG-1IA)具有抑制活性的物质为指标进行分离纯化。
另外，B培养基I的培养抽提液中的检测结果是，对Botrytiscinerea、Rhizoctonia solani未发现活性，仅对细菌有抑菌圈形成。这表明，该菌具有拮抗作用以外的抗菌力，可能生成抗生素。尤其是，因为对金黄色葡萄球菌Staphylococus aureus 209P形成的抑菌圈很清楚，所以以对细菌Staphylococus aureus 209P的活性物质为指标对B培养基I进行分离纯化。A培养基培养物与B培养基I培养物的抗菌谱不同，考虑生成各个系统不同的物质。分别对各活性物质进行分离纯化。
(2)培养结果(a)A培养基培养结果将10份A培养基(米培养基1kg)500ml的三角烧瓶28℃静置培养10天，得到培养物的50％丙酮抽提液2L。(b)B培养基讨论与培养结果表1所示的B培养基I和B培养基II中可见到活性，B培养基I中可见到较强活性的菌株，在缺少氮源的条件下能生成活性物质。由此，用B培养基I28℃振荡培养5天。
(3)纯化结果(a)A培养基纯化结果将硅胶PTLC处理后的活性级分作为粗纯化物，用HPLC(含0.05％TFA的MeOH/H2O)进行纯度确定。分析是0-30分钟0-100％甲醇的梯度，再从30分钟开始用100％甲醇，以1ml/min的流速进行。在RT(保留时间)32.5分(Fr65)检测(
图1)。虽然看起来是检测出单一物质的峰，但由放大可以看出存在多个峰(图2)。RT从前到后的称为A、B、C、D、E(图2)，其中分离纯化了4种成分。分离纯化物的量为，A成分7.2mg，B成分12.1mg，D成分3.5mg，E成分4.5mg。C峰的量很少，未进行纯化。(c)B培养基I纯化结果通过对各级分的活性检测确定Fr41-54具有活性，回收。用HPLC(含0.05％TFA的MeOH/H2O)进行分取、分析，检测出的峰的RT从前到后有A、B、C、D、E 5种成分。其中分离纯化出C成分8.1mg。分析结果(4)仪器分析结果(a)A培养基分离纯化物通过UV吸收光谱、质谱和NMR测定结果(图3-14)判断是含有Aib(α-氨基异丁酸)多肽和肽醇类。肽醇类抗生素的特征是，其氨基酸序列中含有α-氨基异丁酸(Aib)，N末端为乙酰基，C末端结合有氨基醇(多数为苯丙氨醇)。通过质谱，A成分、B成分、D成分一部分的氨基酸序列如下所示，其部分结构与已知的肽醇类氨基酸序列检索的结果是，无一致的物质，所以推断为新型肽醇类。因氨基酸序列推定困难，所以未判断E的。
UV吸收波长4成分均为末端吸收(图3、图6、图9、
图12)A成分＝1933(图5)B成分＝1949或1964(图8)D成分＝1810(
图11)E成分＝1829(
图14)推定结构A成分Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-Aib-Gln-Aib-Aib-......
B成分Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Val-Aib-Gln-Aib-Aib-......
D成分Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-......(b)B培养基I(液体培养基)活性产物仪器分析的结果是C成分为分子量168(C8H8O4)的新型物质。其它成分的分离纯化非常困难，不可能进行判断，所以进行了LC/MS。A成分的UV吸收波长为末端吸收(
图15)。HPLC的条件是用Capcelpac C18 UG120(2×150mm)柱，1％醋酸∶乙腈＝98∶2，流速0.2ml/min，加温进行。在RT 7.48分钟检测出A成分(
图16)。对检测出的级分进行质谱的结果是，A成分的分子量为192(
图17)。对B成分进行了同样的分析，B成分的UV吸收波长也为末端吸收(
图18)，HPLC的RT为12.45分钟(
图19)。质谱的结果是，分子量为206(图20)。C成分是可进行分离纯化的级分。C成分的UV吸收波长为270nm(图21)，HPLC的RT为15.92分钟(图22)。质谱的结果是，分子量为168(图23、24)。另外，用溶剂CD3OD溶解，进行NMR测定(图25)、解析时，推测它是含有五元环、具有共价键的新型物质。推测的结构如图26所示。D成分的UV吸收波长在230nm附近(图27)，HPLC的RT为30.28分钟(图28)。但再度进行HPLC时，UV检测器的波长在末端和230nm处进行分析时发现，RT差0.6分钟，存在两个成分(D1，D2)(图29)。分别对其进行质谱，结果RT在先的成分UV吸收为230nm的分子量为154(D1)。RT迟0.6分钟检测出的成分的分子量为220(D2)(图30)。将这些分子量明确的成分按分子量的大小进行排序的话是154(D1)、168(C)、192(A)、206(B)、220(D2)。(5)生物评价结果(a)A培养基培养分离纯化物生物评价结果4成分的生物评价结果从5000ppm开始稀释，在5000ppm、2500ppm、1250ppm、625ppm测定A、B、C、D 4种成分。结果，A、E成分在1250ppm仍可抑制Rhizoctonia solani菌丝的伸长；B、D成分在625ppm仍可抑制Rhizoctonia solani菌丝的伸长。
(b)B培养基I培养分离纯化物生物评价结果(i)细菌属的评价结果从B培养物(MW168)对细菌有无抑菌圈形成的生物活性来考虑其有无抗菌力及抗菌力的强弱。
(ii)对葡萄球菌抗菌力(MIC)的测定结果如表3所示。如表3所示，该次测定的浓度中，B培养物(MW168)无抗菌力，说明它对葡萄球菌无抗菌力或抗菌力极弱。
表3
测定浓度 MW168 50～0.10μg/mlDMPP(甲氧西林)12.5～0.10μg/mlVCM(万古霉素) 6.25～0.10μg/ml讨论从A培养基培养物分离纯化出的成分中分离出4种含Aib(α-氨基异丁酸)的肽醇系成分。木霉菌(Trichoderma)产生的肽醇类已经有若干报道，但这次分离纯化出的与这些物质均不一致。另外，各成分的氨基酸序列分析的结果推定3种成分为新序列(只有E成分的序列测定不能进行)。In vitro试验中，观察到抑制立枯丝核菌Rhizoctonia solani(AG-11A)的菌丝。由此结果可以表明，该菌的米培养基抽提物中产生抑制立枯丝核菌Rhizoctonia solani(AG-11A)的菌丝伸长的物质。虽然不能断言，该菌的拮抗作用是通过与对手菌丝接触而表达了促进细胞质凝集使细胞死亡的物质，但可以表明该菌的米培养基抽提物中产生抑制菌丝伸长的物质。
另外，由B培养基I培养而分离纯化出的成分为MW168的新物质(3-(3-羟基环戊烯-5-酮-2-基)-2-丙烯酸)，实施的几个生物活性测定中均无活性，或极弱。推测活性体为MW168的周边化合物，MW168为活性物的副产物。另外，MW168周边化合物的分子量为MW154，MW192，MW206，MW220，分子量的差异分别为14。这与1个甲基的分子量相同，可以认为是甲基的增减造成活性的差异。另外，虽然MW168具有新型结构，但通过结构检索已报道了几个类似的化合物。其中，与MW168结构最接近(图33)的是岛取大学的PGR活性筛选中发现的，由丝状菌变幻青霉Penicillium valiabile SOPP代谢而分离纯化出的，用化学式C8H8O5(MW168)表示的新型物质，活性很弱。
实施例2在农地中施用本发明的植物活性促进剂时，其对银河瓜(ぎんがメロン)的结果如下。
实施场所 北海道常吕郡训子府町弥生田川农场实施期间 平成11年4月23日-同年7月29日实施条件 以50g/m2的比率将アグロミツクSK-10(哈茨木霉SK-5-5菌的商标，下同)撒布到瓜地中。
将5×107/g分生孢子附着到直径1-2mm的麦饭石上。试验区、对照区共200m2，两区的不同仅在于有无アグロミツクSK-10的撒布。农药、追肥一切皆无。
上述アグロミツクSK-10于平成11年4月23日撒布，平成11年4月26日定苗，同年7月29日开始收获。银河瓜的平均重量和糖度如表4所示。
表4 ()内为采收后10天的糖度调查经过的特征(1)初期阶段的特征根活力显著，叶形大，茎粗，花大。
(2)中期阶段的特征藤的状态健壮，与对照区有很大的差异，不用说使用农药，什么均不用也没有苗的枯萎、藤裂病、藤枯萎病的征兆。
(3)收获时的特征果实大，形态饱满，网粗，张力强。
(4)检查食味，果实整体糖度均等，外皮紧密，果肉柔软，糖分高，而且晾干后具有上等品味(与对照区的瓜的确有差异)。
(5)果实收获后能保存相当长的一段时期(对照区的1.5倍以上)。
实施例3实验场所 明治制果株式会社生物科学研究所实施期间 平成11年4月-同年8月实施条件 4月6日播种4月8日-22日发芽、育苗5月7日定苗，撒布アグロミツクSK-102×107/g、30-40g/m26月4日-7日交配7月12日-23日收获上述过程中适当施肥、浇灌。按以上实施，得到表5的结果。
表5糖度 结果施用区的糖度高1.5％。通过施用SK-10可提高蔗糖含量，抑制葡萄糖、果糖等。施用SK-10一次可提高糖度是赋予根际通过相互作用转变光合左右产物及其它活性的结果。实施例4将本发明的植物活化剂施用给甜菜时得到如下结果。实验场所 北海道斜里町朱丹实施期间 平成11年3月12日-同年10月7日实施条件 对约30kg罐上部土混和处理アグロミツクSK-55(哈茨木霉SK-5-5菌的商标)。分生孢子在2×108/g以上。对覆土进行灭菌处理。为了使菌固定，在3月下旬-4月中旬每周灌溉一次。7月30日，将アグロミツクSK-55的100倍液与株元一起喷洒到叶面上，2L/m2。处理区与对照区的不同是，未进行灭菌处理，未进行アグロミツクSK-55的处理，施肥量、施肥方法及其它均相同。结果按上面进行实施，平成10年7月29日收获时得到表6的实际数值和表7的比率。
表6实际值
表7比例 按照上面的实施例，根重增加32％，糖量增加40％。因此，同一面积可增收40％，惊人的成果。
按照上面的实施例，从发芽时的混和到7月30日アグロミツクSK-55的撒布，可看到收获量显著提高，因此可以推测，アグロミツクSK-55通过活化甜菜的根茎，造成养分吸收等合理、且增强，细胞分裂也顺调。
应用给甜菜时，可通过研究种子的处理、土壤混和、中间撒布等今后的使用量和时机使其优越性突出。
实施例5将本发明的植物活化剂施用给水稻时得到如下结果。实验场所 北海道札幌市清田(佐佐木农场)北海道夕张郡田仁町(樋山农场)北海道雨龙郡北童町(高桥农场)实施期间 平成11年5月6日-同年9月16日实施条件 品种名称ほレのゆめ さらら397アグロミツクSK-10(哈茨木霉SK-5-5菌的商标)撒布量 A… 50g/m2、分生孢子2×108/gB… 100g/m2、分生孢子2×108/g对照区撒布タチガレンエ-ス液，除追肥(传统方法)之外，其它相同。
在上述条件下栽培水稻，得到表8(佐佐木农场)、表9(樋山农场)、表10(高桥农场)的结果。
表8(佐佐木农场) 品种名はレのゆめ垫坪/77株，收获日平成11年9月2日表9(樋山农场) 品种名さらら397，罐坪/80株，收获日平成11年9月3日蛋白含有量少的味美。
表10(高桥农场) 品种名さらら397垫坪/80株，收获日平成11年9月16日按上述实施例，对于さらら397，蛋白质比传统区低4-6点，比支链淀粉有1-3点的差别(1点为0.5)。
测定味度时，平均为91.0。而测定市售的所谓的味道好的米时最高为88.0，是目前最高的味度。
根据上述结果进行判断，可以确认它是通过活化水稻而避开病原菌、害虫的低农药有机栽培法，其特征是不仅可通过调动植物本身的能力来改善味道，而且可增加收获量(20-50％)。实施例6将本发明的植物活化剂施用给玉米时得到如下结果。
实验场所明治制果株式会社生物科学研究所实施期间平成11年4月-同年8月30日使用菌アグロミツクSK-10(2×107/g)施用法发芽第2周撒布土壤、灌水150ml/pot施用说明以上述条件为基础，按表11设计的进行。
表11 环境自然光(室外)、白天25-38℃、夜间25-28℃、地温25-34℃按上述进行栽培、收获，得到表12的结果。
表12 如前所述，可看到果实肥大，糖度增加的效果。几乎看不到因施用量的多少导致的显著性差异。即施用量为20g/m2与200g/m2之间没有差异。可以推测，施用给玉米时，通过发芽后施用1次使之活化后，可持续到收获。
因此，通过アグロミツクSK-10生成的新氨基酸的量只要能充分赋予活性，其施用量即使在20g/m2以下也能充分发挥效力。
通过上述理由可知，土壤具有アグロミツクSK-10增殖所必要的条件时，即使在20g/m2以下也能充分发挥效力。也许由可能增殖条件的下限确定。于是考虑在发芽后一定时期，以アグロミツクSK-10的增殖条件为基础培育玉米的方法。实施例7将アグロミツクSK-10(哈茨木霉SK-5-5菌的商标)施用到洋葱的育苗床土上，如下检测其对苗及移栽后的发育促进效果。(1)试验材料(a)供试种子未进行超ハィゴ-ルド药物处理的种子(b)供试材料アグロミツクSK-10(Trichoderma harzianum SK-5-5菌的5×108CFU的活菌剂，北海道绿兴产株式会社提供)(c)供试场所千叶县木更津市下郡今间(2)供试方法(a)苗床的准备在千叶县下的山砂土，用前面制备的栽培甜玉米的苗圃作育苗床。因为是pH6.0左右的弱酸性土壤，所以在撒布アグロミツクSK-10前15天施用消石灰50g/m2、成熟堆肥(牛粪为主的加入谷壳的堆肥)1kg、CDU20g，施肥、耕耘，兼调整pH。
(b)アグロミツクSK-10施用及方法施用日平成11年9月11日在播种4日前，将供试材料颗粒剂アグロミツクSK-10 50g/m2撒布到准备的育苗床上，充分混和到表层3-5cm的深度，用自来水进行洒水，注意土壤水分不要过湿(用手握时形成团的潮湿程度，即增殖培养丝状菌的最佳湿度条件)。
(c)播种及アグロミツクSK-10施用后的管理播种日平成11年9月15日因为秋老虎气候，高温、干燥，所以木霉菌在育苗床上增殖、定着良好，为了使洋葱出芽良好，要尽可能地将地温保持在20-25℃，并且为了稳定水分条件，两区内均铺上2-3cm厚的黑麦秸，其上放上防寒纱。
洋葱种子按条播在50cm内播种70粒左右，覆土后，适当洒水，直到开始出芽，按上述方法被覆。
出芽后除去麦秸，用寒冷纱条被覆1个月左右。除去上述纱条，准备移栽，将与堆肥混和的CDU化肥20g/m2浅浅施用到条间。以苗大小为直径0.5-0.6cm×叶长5-6cm的成熟苗为目标进行育苗。
(d)定苗定苗日平成11年11月7日(播种后第53天)苗圃的土壤为冲积土，是pH6.0左右的弱酸性土壤，甘薯后制作。将消石灰60kg/10a、完熟堆肥500kg、骨粉60kg、米粕60kg充分混和，作为堆肥，施用、耕耘。一周后，制作宽1米、3条井道的畦，将CDU 20kg和过磷酸钙10kg与完熟堆肥300kg充分混和，沟渠施肥。按苗大小，将苗定为株间15cm。(3)调查结果(a)出芽及发育状况在未处理区、处理区出芽情况几乎无差异，一周后，在未处理区稍微有苗枯萎发生。其后的发育是，到第25天左右看不到差异，但通过除去纱条、追肥后(播种后第35天)，处理区叶色浓密，目视生长旺盛，二者之间可观察到差异。
(b)苗的生长调查(i)定苗前苗的生长情况调查日为平成11年11月7日(播种后第53天)，详细的数据如表13所示。好苗(大及中苗数)处理区为78％，未处理区为65％。通过施用アグロミツクSK-10，好苗比率增加13％。没有苗径为0.7mm以上的苗。促进效果如表13所示。アグロミツクSK-10处理区生长指数高，生长旺盛，根量也多。比较生长促进率时发现SK-10处理区比未处理区增加27％。
(ii)定苗后苗的生长情况调查越冬前的生长情况。调查方法用图34的方法进行调查。
结果详细的结果如表14所示。
アグロミツクSK-10处理区与未处理区相比，出叶数多0.4叶，生长促进率为152.5％，鳞茎直径的增加率为154.7％。通过目视观察也能观察到明显的促进效果。アグロミツクSK-10处理区与未处理区相比，根量多，根张力良好，土充分附着到根上，根毛多。另外，アグロミツクSK-10处理区可看到叶面积与鳞茎直径的相关性(图35、表15、表16)。
表13定苗前苗的生长情况(播种后第53天，50cm株间的株数)
a)平均生长指数为苗颗数×指数的合计/合计颗数b)平均促进率为平均生长指数/未处理区平均生长指数×100表14越冬前的生长情况(调查日平成11年12月23日)
表15处理区鳞茎径与叶面积的相关系数
相关系数显示5％显著性(两侧)表16
实施例8将アグロミツクSK-10施用到甘蓝的育苗床土上，如下检测其对苗及定苗后的发育促进效果。(1)使用材料(a)供试种子未进行药物处理的种子(b)供试材料アグロミツクSK-10(Trichoderma harzianum SK-5-5菌的5×108CFU，北海道绿兴产株式会社提供)(2)供试场所千叶县成田市吉田农场(3)施用概要(a)施用日平成11年9月15日(b)播种日平成11年9月19日(c)床土为将pH6.0左右的砂壤土调整为中性，散布消石灰50g/m2。2周前施用1kg/m2的完熟堆肥，施肥、耕耘。
播种前撒布50g/m2左右的アグロミツクSK-10。然后，与表层5cm的土壤混和，洒水3L/m2左右，达到土壤水分不过湿的程度(用手握成团的程度)。(4)调查日平成11年12月23日(播种后94日)上述调查日中可以看到，处理区的叶色浓密，厚叶密实，结球性迅速。
权利要求
1.植物活化剂，其特征在于，它是用固体培养基培养哈茨木霉SK-5-5而提取出的物质，对丝状菌具有抗菌性。
2.植物活化剂，其特征在于，它是用液体培养基培养哈茨木霉SK-5-5而提取出的物质，对细菌的一种(金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus 209p)具有抗菌性。
3.权利要求1或2的植物活化剂，其特征在于，提取出的物质为下述A成分、B成分、C成分和D成分，A成分Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-Aib-Gln-Aib-Aib-......，分子量192B成分Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Val-Aib-Gln-Aib-Aib-......，分子量206C成分 ……分子量168D成分Ac-Aib-Ala-Aib-Aib-Aib-......，分子量154或220
4.植物活化剂的制备方法，其特征在于，将哈茨木霉SK-5-5接种到固体培养基上，25-30℃静置培养7-15天后，抽提，得到权利要求1的物质。
5.植物活化剂的制备方法，其特征在于，将哈茨木霉SK-5-5接种到液体培养基上，25-30℃振荡培养4-10天后，抽提，得到权利要求2的物质。
6.植物活化的方法，其特征在于，栽培植物时，附加施用哈茨木霉SK-5-5分生孢子的手段，从而赋予上述植物活性。
7.植物活化的方法，其特征在于，栽培植物时，附加施用哈茨木霉SK-5-5分生孢子的手段，从而生成使上述植物活化的物质。
8.植物活化的方法，其特征在于，栽培植物时，附加施用哈茨木霉SK-5-5分生孢子的手段，在生成使上述植物活化的物质的同时，附加促进上述分生孢子增殖的条件。
9.权利要求6、7、8任一项的植物活化的方法，其特征在于，分生孢子的施用手段是，将分生孢子附着到植物的种子上，将覆土与分生孢子混和，或撒布适量的分生孢子，灌溉水或埋没。
10.权利要求8的植物活化的方法，其特征在于，增殖促进条件是，土壤温度15-30℃，水分30％以上。
11.权利要求7的植物活化的方法，其特征在于，增殖促进条件是，赋予土壤增殖可能的通气性或含气性。
12.植物活化剂，其特征在于，将哈茨木霉SK-5-5的分生孢子附着到无菌处理的多孔性陶瓷及其它载体粒子上。
13.植物活化剂，其特征在于，将哈茨木霉SK-5-5的分生孢子与无菌处理的无机粒子混和，或将附着了SK-5-5的无机粒子与其它粒子混和。
14.植物活化剂，其特征在于，培养哈茨木霉SK-5-5的分生孢子，与培养基一起将之平均适量分离，与无菌多孔性粒子及营养成分构成的填料混和，然后定量平均分装。
15.植物活化剂，其特征在于，用液体培养基使哈茨木霉SK-5-5的分生孢子增殖后，定量平均分装。
16.植物活化剂的施用方法，其特征在于，将权利要求11、12、13任一项中的植物活化剂混入育苗土壤，或在育苗时散布到土壤中，或者散布到苗圃中。
17.权利要求16的植物活化剂施用方法，其特征在于，活化剂的用量是散布5×104/g-5×109/g的哈茨木霉SK-5-5菌5g-100g/m2，或按5g-100g/m3混入到栽培土壤中。
全文摘要
本发明的目的在于以哈茨木霉SK－5－5(Trichoderma harzianumSK－5－5)菌的生成物赋予及促进植物活性。将哈茨木霉SK－5－5以固体培养基培养,提取出其生成物,或者施用上述菌的分生孢子,达到赋予及促进植物活性的目的。
文档编号A01N63/04GK1350541SQ00807600
公开日2002年5月22日 申请日期2000年4月6日 优先权日1999年4月8日
发明者佐佐木康晴 申请人:佐佐木康晴, 株式会社北海道绿兴产