专利名称：一种真菌菌株及其用于防除杂草的方法
技术领域：
本发明为一种真菌菌株及其用于防除杂草的方法，属于微生物应用于农业植物保护、防除农田杂草的技术领域，专用于农田杂草马唐(Digitaria sp.)及其稗草(Echinochloa sp.)和狗尾草(Setaria sp.)的防除。
随着人们对化学除草剂残留、环境污染以及耐药和抗药性杂草发展的认识、绿色食品和有机农业的大力推广，研制真菌除草剂防除杂草已成为生产实际的迫切需求；也是一个新兴的技术和杂草防除最活跃的研究领域。它具有投资少、研制周期短、专一性强、对环境安全和不产生污染等优点。被认为是未来化学除草剂的替代产品。目前，商业化的生物除草剂品种有80年代初研制出的DeVine andCollego以及90年代末推出的Comperico and Biochon。这些除草剂在控制相对的目标杂草上起到了重要作用，甚至是唯一的选择。如DeVine的持效性可以保证使用一次，2-3年无须再除草。有希望商业化的生物除草剂项目有数十项，其中防除稗草、野荸荠等杂草的生物除草剂品种具有十分诱人的前景。
马唐是玉米、高粱、大豆、花生等秋熟旱作物田的恶性杂草，对棉花、烟草、麻类、甘蔗等幼苗生长危害严重，也是蔬菜田、果园、草坪和园艺作物田的优势杂草。在中国，马唐的危害面积大约6千万公顷左右，由其引起的作物损失占秋熟旱作物田杂草总损失的一半以上。马唐的分布范围广泛，是世界热带和温带地区广布种。在美国，马唐每年引起农产品价值损失10％-20％，近几年每年损失高达200亿美元。该杂草繁殖能力强，生长速度快，生长期长，消耗地力，遮光，耐药性强，人工、机械防除比较困难。化学防除虽然有效，但是，化学除草剂的使用引起抗性杂草的产生和严重的环境污染，严重的引起土地退化。研制生物除草剂防除马唐不仅可以有效防除该杂草，而且对环境安全性高。目前，关于马唐真菌除草剂的研究，美国已申请了用弯孢霉属(Curvularia)菌株生物控制马唐的专利，专利号为5,635,444和5,952,264。该专利文献中提出其所使用的技术、生产方法对大豆、棉花比较安全，但未提及对玉米和水稻安全性及其使用。经我们测试该专利菌株也感染玉米和水稻。国内外尚没有其它真菌防除马唐的生物除草剂报道。本发明是利用双曲孢霉属(Nakataea)菌株发展生物除草剂控制马唐，该菌株对主要农作物安全性高，应用范围广，因而比美国的专利优越。该专利将有极为显著的前景和社会、经济效益。
本发明的目的是针对玉米、大豆等秋熟旱作物田以及蔬菜田、果园、草坪和园艺作物田的恶性杂草马唐，筛选一种真菌菌株，用于生物防除草害，能安全有效的控制和防治恶性杂草，尤其马唐杂草，成本低，无污染，对农作物安全。
本发明为一种真菌菌株及其用于防除杂草的方法，其内容和实施方案如下一种真菌菌株QZ-2000，(保藏单位中国微生物菌种保藏委员会；保藏日期2001年10月8日，保藏号CGMCC NO.0640)。一种真菌菌株QZ-2000，半知菌类(Fungi Imperfecti)，丛梗孢目(Moniliales)，丛梗孢科(Moniliaceae)，双曲孢霉属(Nakataea Hara)，PDA培养基上QZ-2000的菌落呈橄榄色或墨绿色；分生孢子梗单生或丛生，直立，橄褐色或黑色，有隔膜，48～196×4～6微米，单枝或偶尔在顶部分枝，细长；分生孢子连续形成，新孢子生在前一个孢子下方生出的新枝顶端，孢子大小为30～36×5～21微米，梭形，向一方微弯或不弯，两端细胞小而圆尖，无色或淡色，中部两个细胞大，色深，有时会产生四个油球。菌核球形。
将上述双曲孢霉属菌株QZ-2000用于防除杂草的方法为用浓度为3-50g/L的双曲孢霉属菌株QZ-2000的分生孢子或者菌丝对杂草进行叶面喷施或种子处理。
该菌的分生孢子可以与各类辅助剂配合使用；或者用该菌的分生孢子与1/8至1/20常规用量的化学除草剂配合使用；或者用该菌的分生孢子与从马唐上分离到的其它寄生菌联合使用；或者用该菌的分生孢子与胶胞炭疽菌婆婆纳专化型(Colletotrichum gloeosporioides f.sp.veronicae Sheng Qiang et Qing Zeng)、百日草链格孢(Alternaria zinniae)联合使用同时防除棉花、大豆、玉米、花生等农作物幼苗期杂草马唐、稗草、狗尾草、婆婆纳、猪殃殃、苍耳等。
辅助剂主要指褐藻酸纳、吐温、植物油、卵磷脂、葡萄糖、淀粉、N酮、小4204、N肥；上述化学除草剂主要指乙草胺、甲草胺、异丙甲草胺、异丙草胺、萘丙酰胺、异丙隆、绿麦隆、赛克津、恶草灵、敌草隆、果尔、玉农乐、拿扑净、盖草能、高盖草能、禾草克、精禾草克、喹禾灵、精喹禾灵、稳杀得、精稳杀得、恶唑禾草灵、精恶唑禾草灵、苯达松、使它隆、2甲4氯、百草敌、虎威、杂草焚、克阔乐；上述其它寄生菌主要指梨孢菌(Pyricularia Sacc)、弯孢霉(Curvularia)、链格孢(Alternaria)、长蠕孢(Helminthosporium)、镰孢霉菌(Fusarium)。其配合使用方法都是本领域技术人员所掌握的常规技术。
发明人在对马唐的生物防治研究过程中发现了田间马唐的自然发病现象，故对其寄生真菌进行筛选研究，结果发现分离得到的一种菌株对作物和其它大多数植物安全，但对马唐有很强的致病率，一周后的控制效果在85％以上。此外，还感染稗草和狗尾草。菌剂的培养条件、大批量生产方法均已进行了详细的研究。该菌的感染致病条件也进行了专门的研究工作。显示出该菌有较大的潜力开发成商品化生物除草剂。可用于大多数作物田控制杂草马唐以及稗草和狗尾草。
本发明采集到的马唐罹病植株叶片上均可见大小不等的紫色或紫红色病斑，病斑中间发白，周围为紫色或紫红色。病斑初为圆点状，后扩大为椭圆形或不规则形状，严重时多个病斑联合，致使叶片整个坏死。在光镜下观察病叶可见粗细不等的菌丝从叶片伸出，还可见到零星分布的分生孢子。经过分离后得到6种真菌，其培养特性与致病特征如下经观察，PDA培养基上QZ-2000的菌落呈橄榄色或墨绿色；分生孢子梗单生或丛生，直立，橄褐色或黑色，有隔膜，48～196×4～6微米，单枝或偶尔在顶部分枝，细长分生孢子连续形成，新孢子生在前一个孢子下方生出的新枝顶端，孢子大小为30～36×5～21微米，梭形，向一方微弯或不弯，两端细胞小而圆尖，无色或淡色，中部两个细胞大，色深，有时会产生四个油球。自然界采回的马唐病叶自下而上病症逐渐加重，上面叶片具有许多椭圆形紫红色病斑，下部叶则大片至整片黄化烂死，在一定湿度条件下，表面可见许多黑色或灰褐色霉层，做病叶镜检可见大量与培养条件相同的分生孢子。
双曲孢霉属菌株QZ-2000纯培养产生的孢子在马唐上的致病症状为叶片最初出现紫红色病斑，圆点状，随后数量增加似麻斑，最后叶大片或整片死亡。如果叶心受感染，则导致整个植株很快死亡。病叶上可见黑色或褐色的霉层。经观察，病叶表面的孢子与所喷施的双曲孢霉属孢子一样。
以上实验条件下的发病症状与自然病症相似。
按其特征鉴定为半知菌类(Fungi Imperfecti)，丛梗孢目(Moniliales)，丛梗孢科(Moniliaceae)，双曲孢霉属(Nakataea Hara)。该菌主要侵染马唐属植物以及稗草、狗尾草，对水稻、玉米、棉花、小麦、大豆、花生、豇豆等作物免疫，对阔叶作物和杂草免疫，故可用于以上作物田防治杂草。
QZ-2000培养方法为可用以下培养基培养并诱导产生分生孢子PDA培养基——马唐浸汁琼脂培养基——马铃薯200g马唐茎叶60g(洗净晾干、粉碎、过滤)葡萄糖20g 琼脂10g琼脂 20g 蒸馏水 1L水1LMDYEA培养基—— 马唐浸汁—PDA培养基——玉米粉20g 马唐茎叶60g(洗净晾干、粉碎、过滤)葡萄糖20g 马铃薯 200g酵母浸膏 2g葡萄糖 20g琼脂 20g 琼脂10g蒸馏水1L水 1LCDA培养基—— MSSA培养基——NaNO3 2g玉米粉15gK2HPO4 1g黄豆粉15gKCL 0.5g 蔗糖 15gMgSO4 0.5g 琼脂 20gFeSO4 0.01g 水1L蔗糖 30g MMA培养基——琼脂 10g 玉米粉 20g水1L 琼脂 20g水1LPCA培养基——
马铃薯20g(煮沸1小时、用细筛过滤)胡萝卜20g(煮沸1小时、用细筛过滤)琼脂 20g水1L玉米粉-豆粉-蔗糖液体培养基，按玉米粉豆粉蔗糖固体培养基配方，但去除琼脂。
该菌的大批量生产可以采用固体或液体-固体联合培养方法。固体培养方法将QZ-2000接种子装有15ml上述任何固体培养基的培养皿中，加盖置于20瓦的紫外灯下，每天照射12h培养(灯距离培养皿20cm)，培养8天后，用无菌水洗下孢子即得到孢子液。或用旋转蒸发器收集孢子置于CaCl2干燥器中干燥即得干孢子粉(可湿性粉剂)。液体-固体培养方法将上述经过固体培养基培养的菌落小块接种于玉米粉-豆粉-蔗糖液体培养基中振荡培养6天，滤去培养残液后，用无菌水冲洗三遍，得到菌丝体，菌丝体可以直接用于生产，也可以将其置于电磨机上粉碎，持续60秒，即获得菌丝体片段悬浮液，再倒在平底锅或培养皿中，厚度为1mm左右，置于40瓦日光灯下(距离20cm)连续照射36h，即可得孢子用于生产。
本发明与现有技术相比，其主要优点和积极效果如下1.使用本发明马唐双曲孢霉菌剂用于防除杂草，不但能防除大豆、棉花双子叶作物田块杂草，对大豆、棉花比较安全，而且对玉米和水稻安全，能防除玉米和水稻单子叶作物田块杂草，优于现有技术中的美国专利。
2.使用本发明马唐双曲孢霉菌剂用于防除杂草，尤其可以在单子叶作物田块杀害单子叶杂草，优于常规防单子叶杂草的化学除草剂，几乎不能在单子叶作物与杂草间进行选择。另外在阔叶作物田可放心使用。在其寄主范围测试研究表明该菌对小麦、大豆、棉花、豇豆、向日葵、玉米、花生、水稻等作物的小苗都安全，只对杂草狗尾草、稗草有轻微感染。该菌的寄主范围相对专一，对农业生产是安全的。(见表1)3.本发明用生物除草，是利用活的生物本身，出自于所使用的环境，其降解产物均为可循环有机物，不会因使用导致污染，因而，对环境安全，可用于生产绿色或有机农产品。
4.在潮湿条件下或与相关助剂配合使用，该菌对目标杂草(马唐、稗草、狗尾草)控制效果可以达到85％-100％，特别是3叶龄以下的植株。(见表2)表1马唐双曲孢霉属菌株QZ-2000的寄主范围测定
注NS表示没有反应； SS表示严重感病表2马唐叶龄对双曲孢霉属菌株QZ-2000致病力的影响
(A-B为处理与对照之间的差异显著性；E-J为全部病指的差异显著性)实施例1从自然发生于南京地区马唐病害植株上采集分离出数种真菌，对它们的致病性进行了试验。
从野外采集到马唐的病叶，记录植株发病症状，镜检。用马唐汁培养基进行病原真菌的分离。在显微镜下挑取各菌株的单孢子，分别接种在PDA培养基上，于黑暗、28℃下培养，观察病原真菌纯培养的菌落特征。另取直径6mm的各菌落圆片接种在PDA平板中央，分别于7天后测量各菌落直径。(表3)分别用不同浓度的各种病原真菌孢子悬浮液喷施马唐，观察各真菌的致病特性(表4)。
表3马唐病原真菌菌落特征的比较
D表示6mm菌落圆片7d后形成的菌落直径表4不同浓度的马唐病原真菌对1.5-3.5叶龄期马唐的致病性
实施例2将QZ-2000菌株在PDA培养基上用紫外灯照射(12小时/天)培养7天，用玻片轻轻刮培养基表面，用无菌水冲洗通过纱布过滤，收集滤液并镜检孢子浓度(10g/L)；用手持喷雾器喷施滤液，接种到1叶1心至3叶1心期的马唐上，保湿12小时。在处理五天后，对该草的防除效果达到90％以上。实施例3按实施例2的方法，配制出浓度为10g/L的双曲孢霉属菌株QZ-2000、菌株2001、菌株2002、菌株2003，再将等体积的各种孢子悬浮液按以下配方混合F1菌株QZ-2000+菌株2001；F2菌株QZ-2000+菌株2002；F3菌株QZ-2000+菌株2003；F4菌株QZ-2000+菌株2001+菌株2002；F5菌株QZ-2000+菌株2001+菌株2003；F6菌株QZ-2000+菌株2002+菌株2003；F7菌株QZ-2000+菌株2001+菌株2003+菌株2004，然后分别喷施到1.5-4.5叶龄期的马唐上。保湿12小时，平均温32℃，各5个重复。处理三天后，菌株2001、菌株2002、菌株2003对双曲孢霉属菌株QZ-2000有显著的增效作用，使马唐的致病率由83.7％增至92.3％、85.6％和87.7％；菌株QZ-2000+菌株2001+菌株2002、菌株QZ-2000+菌株2001+菌株2002、菌株QZ-2000+菌株2002+菌株2003使马唐的致病率增至95.7％、96.3％、89.7％；四种真菌的孢子一起加入后增效更大，致病率增至98.3％。实施例4按实施例2的方法，生产出孢子悬浮液，添加一些表面活性剂或辅助剂(褐藻酸纳、卵磷脂、吐温、植物油、葡萄糖、淀粉、N酮、小4204、N肥等)，处理马唐、稗草、狗尾草等杂草，结果明显提高杀草的速度，减少5-12小时的保湿时间。
双曲孢霉QZ-2000的分生孢子与微量表面活性剂或辅助剂配合使用，可以加快该真菌的侵染发病速度，减少对湿度的依赖性。在浓度分别为50g/L、5g/L、0.5g/L的双曲孢霉QZ-2000的孢子悬浮液加入油-卵磷脂-葡萄糖乳剂(三者浓度分别为3‰、1‰、2‰)，混匀后喷施到田间生长了14天的马唐上(叶龄处于1.5-4.5叶期)，15天后检查并记录病害程度。日均温为30℃，各5个重复。
表5助剂与不同浓度的双曲孢霉菌株QZ-2000混用对田间马唐的致病性
在每列中数据跟不同大、小写字母的分别表示有显著差异和极显著差异(P＜0.05和P＜0.01)实施例5马唐、婆婆纳(Veronica sp.)、苍耳(Xanthium sp.)常常混生于玉米、花生、棉花、大豆等农作田及蔬菜、果园田，将双曲孢霉属菌株QZ-2000的孢子悬浮液与胶孢炭疽菌波斯婆婆纳专化型、百日草链格孢联合使用于上述农田，结果持续地抑制或部分的杀死这些农田的马唐、婆婆纳、苍耳等杂草，且对稗草和狗尾草具有控制作用。实施例6实施例2的方法生产出孢子悬浮液，添加常规用量的1/20-1/5倍的乙草胺、甲草胺、异丙甲草胺、异丙草胺、萘丙酰胺、异丙隆、绿麦隆、赛克津、恶草灵、敌草隆、果尔、玉农乐等，均匀喷施在1.0-2.5叶龄期的马唐上，分别保湿12小时和不保湿两组处理。在处理后2天，保湿一组的马唐被控制率达100％，未保湿一组的马唐被控制率达70-90％。实施例7铺有滤纸的培养皿高压灭菌后，每皿中放50粒马唐种子。将双曲孢霉属菌株QZ-2000的孢子或菌丝悬浮液施于培养皿中，每皿2毫升，重复5个。另设无菌水处理皿中马唐作为对照。4天后，对照马唐种子萌发及长势均正常，而菌液处理的马唐种子刚萌发即被侵染全部死亡。实施例8实施例2的方法生产出孢子悬浮液，添加常规用量的1/20-1/5倍的拿扑净、盖草能、高盖草能、禾草克、精禾草克、喹禾灵、精喹禾灵、稳杀得、精稳杀得、恶唑禾草灵、精恶唑禾草灵等，均匀喷施在3-4.5叶龄期的马唐上，分别保湿1天和不保湿两组处理。在处理后2天，保湿一组的马唐被控制率达99.5％以上，未保湿一组的马唐被控制率达85-90％。实施例9实施例2的方法生产出孢子悬浮液，添加常规用量的苯达松、使它隆、2甲4氯、百草敌、虎威、杂草焚、克阔乐等，均匀喷施在3-6叶龄期的马唐、稗草、及多种阔叶杂草如鳢肠、铁苋菜、马齿苋等上，在处理后7天，杂草的控制效果在75-90％。
权利要求
1.一种真菌菌株，其特征在于一种双曲孢霉真菌菌株(QZ-2000)，保藏单位中国微生物菌种保藏委员会，保藏日期2001年10月8日，保藏号CGMCC 0640；半知菌类(FungiImperfecti)，丛梗孢目(Moniliales)，丛梗孢科(Moniliaceae)，双曲孢霉属(NakataeaHara)，PDA培养基上QZ-2000的菌落呈橄榄色或墨绿色；分生孢子梗单生或丛生，直立，橄褐色或黑色，有隔膜，48～196×4～6微米，单枝或偶尔在顶部分枝，细长；分生孢子连续形成，新孢子生在前一个孢子下方生出的新枝顶端，孢子大小为30～36×5～21微米，梭形，向一方微弯或不弯，两端细胞小而圆尖，无色或淡色，中部两个细胞大，色深，有时会产生四个油球。菌丝呈球形。
2.将权利要求1所述真菌菌株用于防除杂草的方法，其特征在于用浓度为3-50g/L的双曲孢霉属菌株(QZ-2000)的分生孢子或者菌丝悬浮液对杂草进行叶面喷射或种子处理。
3.根据权利要求2所述的真菌菌株用于防除杂草的方法，其特征在于其所述双曲孢霉属菌株(QZ-2000)的分生孢子或者菌丝悬浮液可以与常规用量或常规用量的1/5-1/20的各类辅助剂、化学除草剂、其它马唐寄生菌、胶胞炭疽菌婆婆纳专化型、百日草链格孢菌配合使用防除杂草。
4.根据权利要求2或3所述的真菌菌株用于生物除草的方法，其特征在于辅助剂指的是褐藻酸纳、吐温、植物油、卵磷脂、葡萄糖、淀粉、N酮、小4204、N肥；化学除草剂指的是乙草胺、甲草胺、异丙甲草胺、异丙草胺、萘丙酰胺、异丙隆、绿麦隆、赛克津、恶草灵、敌草隆、果尔、玉农乐、拿扑净、盖草能、高盖草能、禾草克、精禾草克、喹禾灵、精喹禾灵、稳杀得、精稳杀得、恶唑禾草灵、精恶唑禾草灵、苯达松、使它隆、2甲4氯、百草敌、虎威、杂草焚、克阔乐。
全文摘要
本发明为一种真菌菌株及其用于生物除草的方法,属于微生物应用于农业植物保护领域。该菌株(QZ－2000),(保藏单位:中国微生物菌种保藏委员会;保藏日期:2001年10月8日,保藏号:CGMCC NO.0640)。用该菌株的分生孢予以及菌丝的浓度为3－50g/L,或者用该菌的分生孢子与一些表面活性剂或辅助剂(如吐温、卵磷脂、植物油、褐藻酸纳、N酮、小4204等)配合使用用于生物除草,可以在玉米田、大豆田、棉花田、花生田、蔬菜田及果园中安全使用,无污染,并能同时控制马唐、狗尾草、稗草等杂草。对目标杂草控制效果可达到85%以上。该菌株还可以与其它控制阔叶杂草的菌株配合应用,同时控制多种杂草。也可以与化学除草剂配合使用,控制杂草。
文档编号A01N63/00GK1341710SQ0113400
公开日2002年3月27日 申请日期2001年10月8日 优先权日2001年10月8日
发明者强胜, 朱云枝 申请人:南京农业大学