内生生防菌株及其制成的生防菌剂的制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种内生生防菌株及其制成的生防菌剂的制备方法与应用，所述菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis），己于2014年1月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNO.8812，生防菌剂浓度为1×108cfu/mL的内生生防菌株细胞悬液。能够有效的防止石榴的腐烂、无污染、抑菌率高。
【专利说明】内生生防菌株及其制成的生防菌剂的制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种生物菌种防治石榴腐烂的领域，尤其涉及一种内生生防菌株及其制成的生防菌剂的制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]石榴(Punica granatum)，别名安石榴，石榴科石榴属。原产于伊朗、阿富汗等国家，现已在亚洲、非洲、欧洲沿地中海各地，均作为果树栽培，而以非洲尤多。在我国，除了东北等极寒冷的少数省区外，均适合石榴栽培，我国已经形成了最有影响的石榴五大产区，分别为陕西临潼、山东枣庄、安徽怀远、四川会理和云南巧家。石榴是集食用、药用以及观赏于一体的水果，特别是石榴中富含抗氧化物质，是延缓衰老、预防动脉硬化且减缓癌变进程的高水平抗氧化剂。调查表明，我国石榴20%~30%在中秋节和国庆节消费，10%用于加工，50%飞0%经过储藏延长货架期在春节前后上市。但是石榴采后果实在贮藏过程中，受到多种致病菌共同作用导致果实腐烂变质，通常腐烂率是30%，严重时可达70%，严重影响了石榴的经济价值。对于贮藏期石榴果实腐烂病由什么病菌引起有两种观点:大部分学者(戴芳澜1934 ;周又生1999 ；Jin&Chang 2002，等)认为是由石榴干腐病菌石榴鲜壳孢(ZythiaVersoniana Sacc.)引起；2007 年付娟妮认为是葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)引起的。目前控制石榴采后腐烂的有效措施是低温贮藏结合化学防腐剂、热、辐射、气调等。常使用的化学防腐剂有甲基托布津(Thiophanate-Methyl )、多菌灵(Carbendazim)、敌霉烟剂(TBZ)等。化学防治是果蔬产后病害防治的主要途径，但随着发现有致癌作用，且污染环境的化学杀菌剂越来越多，使其在果品上的应用受到限制。另外，一些杀菌剂的频繁使用也使病菌产生抗性，防效大为降低，如葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、青霉菌(Penicillium sp.)、梨形毛 霉菌(Mufcor piriformis Fischer)早已对苯来特(Benlate)有抗性，由于在柑桔上长期使用苯并咪睡类杀菌剂(Benzimidazole fungicide),使原来对其不敏感的柑桔黑腐病菌(Alternaria citri Ellis et.Pierce)和柑桔酸腐病菌(Oosporacitriaurantii ex Persoon)种群上升成为新问题。随着消费者对无公害农产品、绿色食品和有机食品的强烈需求，开发高效、低毒、无残留的生物农药已成为迫切希望。生物农药是指利用生物产生的生物活性物质或生物活体作为农药，以及人工合成的与天然化合物结构相同的农药，是不污染环境的绿色农药，可望成为解决化学农药残留污染的有效途径之一。近年来植物根部、叶部病害生物防治的成功实例，大大激发人们将生物防治扩展到果蔬产后病害的防治研究领域。特别自1983年起美国农部以Wilson为主的一批美、以、澳、法等国科学家，在这方面做了大量的研究工作，在美国，已有防治核果类、仁果类、柑桔及一些蔬菜产后病害的几种拮抗菌取得了专利或正在审定。目前，将生物防治技术用于石榴贮藏防腐的研究，国内外没有相关报道。综上所述，筛选有效的生防细菌，开发新型、安全有效的微生物杀菌剂是控制石榴腐烂病的发生，减少贮藏期石榴的损失，促进石榴产业经济稳健发展的迫切需要。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种内生生防菌株及其制成的生防菌剂的制备方法与应用，能够有效的防止石榴的腐烂、无污染、抑菌率高。
[0004]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
一种内生生防菌株，所述菌株为枯草芽孢杆菌subtil is,己于2014年I月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC N0.8812。保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所。
[0005]一种根据所述菌株的制备方法，其特征是:第一步，内生生防菌株的分离和纯化，采集健康的石榴叶片称取3.0 g，用无菌水冲洗4飞次，无菌剪刀剪成4飞mm见方的小块后，依次用75%的酒精浸泡5 S，0.1 %的升汞浸泡50 S，无菌水冲洗3次，然后加30 mL无菌水在无菌研钵中研磨；研磨后静止分层，上清液作为浸出液备用，其浓度为0.1 g/mL，取上清液I mL进行梯度稀释至10_5，从10_3、10_4、10_5稀释悬液中各取0.2 mL涂布平板，以最后一次冲洗液0.2 mL涂布平板进行无菌检验，每处理3个重复。在37°C恒温培养箱中倒置培养24-48 h，挑取单菌落在牛肉膏蛋白胨平板培养基上采用平板划线法进行纯化；纯化后的菌株接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基，37°C培养24 h，4°C冰箱保存备用；第二步，内生生防菌株的筛选，首先将石榴腐烂病菌在马铃薯葡萄糖培养基平板上28°C培养至产生孢子，用接种环挑取少量的病原菌孢子点接到马铃薯葡萄糖培养基平板中央，在距平板中央3 cm的两条对称直线处划线接种已分离的内生菌株，以只接石榴腐烂病菌为对照，28 1:恒温培养箱中培养，待对照中病菌菌丝即将铺满全皿时，计算抑制率的大小，筛选出抑菌效果较好的菌株；第三步，将筛选出的内生生防菌株进行保存，第一种保存方法，将选择培养的内生菌株划线接种在牛肉膏蛋白胨斜 面上，培养24 h后置于4°C冰箱保存，半年转管一次防止培养基干涸菌种死亡，供临时使用，第二种保存方法为甘油保存:将内生生防菌株用无菌水悬浮，充分混匀制成菌悬液，取20 %的灭菌甘油与菌悬液在涡旋震荡器上充分混匀转入无菌的1.5 mL EP管中，于-80 °〇冷冻长期保存。
[0006]根据所述菌株的制备方法，其特征是:所述灭菌甘油与菌悬液的体积比为2:1。
[0007]—种根据所述的内生生防菌株生防菌剂，其特征是:生防菌剂浓度为IXlO8Cfu/mL的内生生防菌株细胞悬液。
[0008]一种根据所述生防菌剂的制备方法，其特征是:挑取活化的内生生防菌株少许，接种到10 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37 °C, 180 r/min摇床培养24 h，作为种子液；将种子液按1% (v/v)的比例接种于含200 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的IL三角瓶中，37 V,180 r/min摇床培养48 h,得到发酵液,2 500 r/min离心6 min,收集菌体用无菌水洗漆,用清水配成浓度为I X IO8 cfu/mL的内生生防菌株细胞悬液，即为内生生防菌株生防菌剂。
[0009]一种根据所述的生防菌剂在防治石榴贮藏期果实腐烂病的应用，其特征是:将石榴果实用清水洗净、风干，将石榴果实浸入生防菌剂中10 min，取出后浙干萼筒内的残留溶液并预冷至5°C左右，再用0.025、.03 mm厚的聚乙烯袋单果包装，装箱入库，保存温度为4~6°C，相对湿度为90%。
[0010]本发明的优点效果在于:本发明发现一株具有高活性的、稳定的内生细菌菌株一Bacillus subtilis NS04。该菌株培养方法简单，在PDA平板上对石榴干腐病菌有较好的抑制效果，抑制率为55.6%，对石榴贮藏期果实腐烂病有显著的防效，不同贮藏期的相对防效为100%~54.082%，商品率显著提高20%~12%，且该菌株为枯草芽孢杆菌UaciJAz1S来源于石榴叶片内部组织，完全没有因化学农药使用所带来的一系列问题，绿色、无毒、环保，明显将石榴果实的货架期显著延长了 90 d，提高了果农的经济收入。因此，菌株NS04作为石榴采后果实防腐的生防因子具有广阔的开发前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1为普通对照菌落的抑制效果图。
[0012]图2为内生生防菌株对石榴干腐病菌抑制作用图。
[0013]图3为内生生防菌株培养48h的形态图。
[0014]图4为内生生防菌株在显微镜下的形态图。
[0015]图5为内生生防菌株传代对石榴干腐病菌抑制的稳定性图。
【具体实施方式】
[0016]下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明:
实施例1:内生生防菌株NS04的筛选:
1.内生生防菌株的分离和纯化 采集健康的石榴叶片称取3.0 g，用无菌水冲洗4-5次，无菌剪刀剪成4飞mm见方的小块后，依次用75%的酒精浸泡5 S，0.1 %的升汞浸泡50 S，无菌水漂洗3次，然后加30 mL无菌水在无菌研钵中研磨；研磨后静止分层，上清液作为浸出液备用，其浓度为0.1 g/mL，取上清液I mL进行10倍梯度稀释至10_5，从10' 10_4、IO-5稀释悬液中各取0.2 mL涂布平板，以最后一次漂洗液0.2 mL涂布平板进行无菌检验，每处理3个重复。在37°C恒温培养箱中倒置培养24~48 h，观察，若对照没有菌落长出，说明表面灭菌彻底，所得到的菌株为内生生防菌株，挑取单菌落在牛肉膏蛋白胨培养基(NA)平板上采用平板划线法进行纯化；纯化后的菌株接种于NA斜面培养基，37°C培养24 h，4°C冰箱保存备用。
[0017]2.内生生防菌株的筛选
以大多数学者认为的腐烂病的病菌石榴鲜壳孢(Zythia Versoniana Sacc.)为指示菌，采用平板对峙法测定内生细菌对腐烂病菌的抑制作用。首先将石榴腐烂病菌在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)平板上28 1:培养至产生孢子，用接种环挑取少量的病原菌孢子点接到PDA平板中央，在距平板中央3 cm的两条对称直线处划线接种已分离的内生细菌，以只接石榴腐烂病菌为对照，每处理3个重复，28 °C恒温培养箱中培养，待对照中病菌菌丝即将铺满全皿时，计算抑制率的大小。
[0018]抑制率(％ )=[(对照菌落直径一处理菌落直径)/对照菌落直径]X 100 %，菌落直径单位:厘米(cm)。
[0019]通过石榴叶片内生菌的分离纯化和筛选，获得了一株对石榴腐烂病菌有较好抑菌活性的内生菌菌株，抑制率为55.6%，编号为NS04 (图1)。
[0020]实施例2:内生生防菌株NS04的保存方法
可以采用两种方法保存该菌种，将培养24 h的内生细菌划线接种在NA斜面上，培养24h后置4 1:冰箱保存，半年转管一次防止培养基干涸菌种死亡，供临时使用。甘油保存:将菌株用无菌水悬浮，充分混匀制成菌悬液，取20 %的灭菌甘油与菌悬液(Vws =Vea =2:1)涡旋震荡器上充分混匀转入无菌的1.5 mL EP管中，于-80 1:冷冻长期保存。
[0021 ] 实施例3:内生生防菌株NS04的鉴定
1.NS04菌株的形态学、生理生化特性
形态学和生理生化特性采用常规方法测定，测定结果表明NS04菌株在NA平板培养基上菌落直径约为0.76 cm,白色，不透明，不规则状，隆起，边缘裂叶状，随培养时间延长菌落表面出现褶皱(图2)。NS04单个细胞呈短杆状，0.63~0.87X 1.75~2.51 μ m，单生或对生(图3)，革兰氏染色阳性，有椭圆形或柱状芽孢。NS04菌株和枯草芽孢杆菌UaciJAz1Ssubtilis)的生理生化特性基本一致(表1)。
【权利要求】
1.一种内生生防菌株，所述菌株为枯草芽孢杆菌(ifeci77i/5.己于2014年I月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCN0.8812。
2.一种根据权利要求1所述菌株的制备方法，其特征是:第一步，内生生防菌株的分离和纯化，采集健康的石榴叶片称取3.0 g，用无菌水冲洗4飞次，无菌剪刀剪成4飞mm见方的小块后，依次用75%的酒精浸泡5 S，0.1 %的升汞浸泡50 S，无菌水冲洗3次，然后加30mL无菌水在无菌研钵中研磨；研磨后静止分层，上清液作为浸出液备用，其浓度为0.1 g/mL,取上清液I mL进行梯度稀释至10_5，从10' 10_4、10_5稀释悬液中各取0.2 mL涂布平板，以最后一次冲洗液0.2 mL涂布平板进行无菌检验，每处理3个重复；在37°C恒温培养箱中倒置培养24~48 h，挑取单菌落在牛肉膏蛋白胨平板培养基上采用平板划线法进行纯化；纯化后的菌株接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基，37°C培养24 h，4°C冰箱保存备用；第二步，内生生防菌株的筛选，首先将石榴腐烂病菌在马铃薯葡萄糖培养基平板上28°C培养至产生孢子，用接种环挑取少量的病原菌孢子点接到马铃薯葡萄糖培养基平板中央，在距平板中央3cm的两条对称直线处划线接种已分离的内生菌株，以只接石榴腐烂病菌为对照，28 °C恒温培养箱中培养，待对照中病菌菌丝即将铺满全皿时，计算抑制率的大小，筛选出抑菌效果较好的菌株；第三步，将筛选出的内生生防菌株进行保存，第一种保存方法，将选择培养的内生菌株划线接种在牛肉膏蛋白胨斜面上，培养24 h后置于4°C冰箱保存，半年转管一次防止培养基干涸菌种死亡，供临时使用，第二种保存方法为甘油保存:将内生生防菌株用无菌水悬浮，充分混匀制成菌悬液，取20 %的灭菌甘油与菌悬液在涡旋震荡器上充分混匀转入无菌的1.5 mL EP管中，于-80 °〇冷冻长期保存。
3.根据权利要求2所述菌株的制备方法，其特征是:所述灭菌甘油与菌悬液的体积比为 2:1。
4.一种根据权利要求1所述的内生生防菌株生防菌剂，其特征是:生防菌剂浓度为lX108cfu/mL的内生生防菌株细胞悬液。
5.一种根据权利要求4所述生防菌剂的制备方法，其特征是:挑取活化的内生生防菌株少许，接种到10 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37 °C, 180 r/min摇床培养24 h，作为种子液；将种子液按1% (v/v)的比例接种于含200 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的IL三角瓶中，37 °C, 180 r/min摇床培养48 h,得到发酵液,2 500 r/min离心6 min,收集菌体用无菌水洗涤，用清水配成浓度为I X IO8 cfu/mL的内生生防菌株细胞悬液，即为内生生防菌株生防菌剂。
6.一种根据权利要求4所述的生防菌剂在防治石榴贮藏期果实腐烂病的应用，其特征是:将石榴果实用清水洗净、风干，将石榴果实浸入生防菌剂中10 min，取出后浙干萼筒内的残留溶液并预冷至5°C左右，再用0.025、.03 mm厚的聚乙烯袋单果包装，装箱入库，保存温度为4~6°C，相对湿度为90%。
【文档编号】A01N63/02GK104017748SQ201410106089
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年3月21日 优先权日:2014年3月21日
【发明者】马耀华, 谭小艳 申请人:枣庄学院