专利名称：一种通过丛生芽诱变和筛选创造甜菜抗逆新种质的方法
技术领域：
本发明属农作物的生物工程育种领域，具体说，涉及一种通过丛生芽诱变和筛选创造甜菜抗逆新种质的方法。
采用细胞工程育种技术可望获得抗逆性大幅度提高和抗除草剂的工程植株，也可有效地获得耐低浓度营养元素的种质材料(其中部分为营养高效型)，并可缩短育种年限，为甜菜抗逆育种和营养高效型育种开辟了新途径。大量工作表明，植物组织或细胞培养过程中会出现高频率的广泛变异即体细胞无性系变异，如果再结合理化因素处理，则可大大提高变异范围及频率。选取其中对农业生产有利用价值的性状可达到植物改良的目的。
采用细胞工程技术创造作物新种质首先依赖于离体培养细胞或组织器官能否高频率地再生植株，其次取决于是否能有效地诱发和选择出细胞突变体，并获得再生植株。由于甜菜组织培养及细胞工程研究难度大，虽有大量工作，但只有少数实验室建立起可用于遗传操作的离体培养系统。甜菜愈伤组织诱导率低，在继代培养过程中易褐化，从愈伤组织再生植株难度大，成功率低，虽有一些成功的报道，但多数工作中只获得少量植株，且受基因型影响大。甜菜原生质体培养研究开始较早，但获得的愈伤组织很难再生植株，原生质体再生植株成功的报道只有4篇，且培养过程复杂，植株再生依赖于特定的基因型，限制了该技术在甜菜育种上的广泛应用。离体培养甜菜的顶芽、叶片、叶柄等外植体虽发生不定芽，但诱导和增殖频率都不高，只用于特异种质的繁殖和保存。到目前为止，利用甜菜离体培养系统进行细胞诱变并选择突变体的工作未有报道。
本发明的甜菜丛生芽诱变和筛选方法，主要步骤包括取甜菜花蕾期的幼嫩花序切段为外植体，在诱导培养基上诱导丛生芽发生，然后转移到增殖培养基上增殖，剥取丛生芽小叶及叶柄，裸露生长点，进行诱变处理，对诱变处理后的丛生芽块进行恢复培养和扩增，然后转入附加选择剂或降低某种营养成分的增殖培养基上连续培养数代，筛选出存活的小芽转入生根培养基中诱导生根，也可将未经诱变处理的丛生芽块直接转入筛选培养基进行筛选，生根小苗长大后，检测其抗逆性或利用营养的效能。
上述的甜菜是糖甜菜品种、饲用甜菜品种和兼用型品种以及特用型品种之一。
上述的选择剂是附加在培养基中的耐盐、耐旱、兼有耐盐耐旱、耐高pH值、耐低pH值、耐高铝浓度、分别耐不同除草剂、耐低磷、耐低钾及其它营养元素的筛选环境条件之一。
上述降低某种营养成分是指筛选培养基中减量或减去氮、磷、钾、硫、锌、锰、铁、硼、钼等营养元素。
上述诱变处理中使用的诱变剂是化学试剂或物理因子。
上述物理诱变因子是γ射线、χ射线、紫外线、热中子、慢中子之一。
上述的小芽在选择培养基上可连续筛选2---6代，也可间隔筛选3-12代，使用的选择剂浓度可随小苗不同生长时期的敏感程度而变化。
上述培养基的配方是，丛生芽诱导培养基的组成为MS培养基、蔗糖30-60g/L、100-500mg/L的水解酪蛋白(CH)、0.5-3.0mg/L的6-BA(6-苄基嘌呤)、0.1-0.8mg/L的NAA(萘乙酸)、琼脂6-9g/L，pH5.5-6.2；丛生芽增殖培养基组成为MS培养基、蔗糖30-70g/L、50-500mg/L的水解酪蛋白(CH)、0.5-2.0mg/L的6-BA及0.1-0.8mg/L的NAA、琼脂6-8g/L，pH5.5-6.2；生根培养基的组成为1/2MS培养基、蔗糖20-50g/L、50-300mg/L的水解酪蛋白和1.0-5.0mg/L的NAA、琼脂6-8g/L，pH5.5-6.2。
上述培养基的配方是，丛生芽诱导培养基的组成为MS培养基、蔗糖50g/L、200mg/L的水解酪蛋白(CH)、1.0mg/L的6-BA及0.25mg/L的NAA、琼脂7g/L，pH5.8；丛生芽增殖培养基的组成为MS培养基、蔗糖50g/L、200mg/L的水解酪蛋白(CH)、1.0-2.0mg/L的6-BA及0.25mg/L的NAA、琼脂7g/L，pH5.8；小苗生根培养基的组成为1/2MS培养基、蔗糖30-50g/L、200mg/L的水解酪蛋白和2.5mg/L的NAA、琼脂7g/L，pH5.8。
上述的甜菜丛生芽诱变和筛选方法在创造抗逆新种质中的应用，取花蕾期幼嫩花序顶端切段为外植体，在丛生芽诱导培养基上诱导丛生芽发生；丛生芽块扩增后，剥去小叶，将组织块切成2-3毫米大小，用5-30Gy的γ射线辐照，恢复培养3天后，转入补加1.5-2.5％的NaCl的增殖培养基进行选择，连续筛选3-4代，获得耐盐的小苗；将2-3cm的小苗转入生根培养基中生根，获得耐盐植株，植株移栽成活后自交结实，检测子代的耐盐性和农艺性状，选出耐盐新种质。
通过本发明的方法，获得了能耐2％NaCl的甜菜育种材料。
本发明的甜菜丛生芽诱变和筛选方法的优选技术方案取甜菜植株处于花蕾期的幼嫩花序顶端，切成1.0cm左右切段，灭菌后，再用解剖刀切成含3-5个花蕾的小段，接种于诱导培养基进行诱导培养。外植体灭菌程序为在无菌条件下用70％酒精消毒1-1.5分钟，0.1％HgCl2水溶液杀菌3-8分钟，无菌水冲洗3-5次。诱导培养基的组成为MS培养基、蔗糖30-60g/L、100-500mg/L的水解酪蛋白(CH)、0.5-3.0mg/L的6-BA及0.1-0.8mg/L的NAA、琼脂6-9g/L，pH5.5-6.2。小切段在26±5℃条件下暗培养1周后，放置1500-3000lx光照下培养，15--20天继代1次。继代培养基为丛生芽增殖培养基，培养基组成为MS培养基、蔗糖30-70g/L、50-500mg/L的水解酪蛋白(CH)、0.5-2.0mg/L的6-BA及0.1-0.8mg/L的NAA、琼脂6-8g/L，pH5.5-6.2。不同基因型的切段产生丛生芽的速率不同。一般在接种8-10天后开始在花蕾基部的花托上开始分化丛生芽，少数品种则在17天后才开始分化丛生芽。随着培养时间的延长，丛生芽大量产生，聚集成丛。继代培养3次后，外植体产生丛生芽频率一般在80％以上。在继代培养中每个丛生芽每一次又可产生4-8个次生芽。
剥去丛生芽长出的幼叶，将芽块切成2-3mm小块，放入培养皿中用于诱变处理。每小块由5-20个幼芽组成。若用射线进行辐照，先确定半致死剂量。然后选用接近半致死剂量的射线剂量进行诱变处理。丛生芽小块以3×3mm的间距放置在增殖培养基上生长2-3天时进行辐照。辐照后的丛生芽块在暗中恢复培养2天左右，再在光下培养1周，然后转入到筛选培养基上筛选。若用化学诱变剂进行诱变，首先根据诱变剂的理化性质选择合适的缓冲液和处理方法，处理并培养丛生芽小块，以半致死率为参考，确定合适的诱变剂浓度和处理时间以及洗涤时间和方法等。然后选取适宜参数进行规模化处理丛生芽小块。处理后芽块转入增殖培养基上暗中恢复培养2天，光下恢复培养3天，然后转入不同选择培养基进行筛选。
筛选培养基中的选择剂种类及浓度因所选材料的特点确定。如筛选耐盐变异体，培养基中添加NaCl或NaCl和Na2SO4的组合。NaCl浓度可分别为1.5％、2.0％、2.5％、3.0％。若选择耐旱变异体，培养基中添加聚乙二醇或聚乙二醇与甘露醇或山梨醇的适宜组合。聚乙二醇的浓度可为12-22％。若选择耐低磷或耐低钾的变异体，筛选培养基则去掉含磷化合物或含钾化合物。若选择耐低锌或其它营养元素的变异体，筛选培养基则不仅要去掉含锌化合物或含其它营养元素的化合物，而且用于制备培养基的无机盐应全部为分析纯或标定纯，水为无离子水或双蒸水，琼脂条必须经过金属络合物溶液浸泡和无离子水浸泡洗涤。
诱变处理后丛生芽块在筛选培养基上照光培养，每隔15--20天继代一次，连续筛选或间隔筛选2-6代(次)，以未诱变的丛生芽块为阴性对照，观察统计幼苗的长势及死亡情况。转移到加有选择剂的培养基上的经诱变处理的丛生芽块虽在筛选初期长势较弱，但一周后旺盛增生(在高选择剂浓度的培养基上增生相对较慢)，组织块不断增大，筛选半个月后，部分小芽生长变差或逐渐坏死。在第二次继代培养时(一般已筛选培养一个月以上)，切去丛生芽块坏死部分和叶片。在第二代筛选培养中，丛生芽块生长速率和小芽增殖情况取决于细胞所受的胁迫情况，选择浓度高，组织块坏死比例高，产生的小芽少。在第三代筛选培养中，若培养基中选择剂浓度适宜，多数组织块变褐或死亡，少数组织块有生长正常的区域和新生的小芽。若选择剂浓度过高，则全部组织块死亡。选择剂浓度过低，多数组织块存活，筛选出的高抗性材料比例低。在减去某种营养元素的筛选培养基上，经诱变处理的丛生芽块虽在筛选初期长势较弱，但一周后旺盛增生，组织块不断增大，继代时需切成小块转入新的筛选培养基。在第二代筛选培养中，丛生芽块生长速率和小芽增殖速率下降，下降幅度取决于缺失的养分种类和细胞所受的胁迫程度，大量元素的缺乏导致组织块生长明显变差，甚至出现局部细胞死亡。微量元素缺乏则造成生长速率下降，小芽数减少或生长不正常。在第三代筛选培养中，组织块生长慢并出现局部坏死，产生的小芽数少。在第四、五代筛选培养中，只有少数组织块的局部区域细胞能正常地增生和产生小芽。这些小芽可转入全组分的增殖培养基上生长和产生丛生芽。
从筛选培养基得到的小芽在转入增殖培养基后能迅速生长和产生大量的丛生芽。可将快速倍增的丛生芽用解剖刀分离成单芽或丛生芽小块，转移到6-BA0.5-2.0mg/L的增殖培养基上，待小苗长到3-5片小叶时转移到生根培养基上，在26±2℃下暗培养，诱导生根，15天继代一次。生根培养基的组成为1/2MS培养基、蔗糖20-50g/L、50-300mg/L的水解酪蛋白和1.0-5.0mg/L的NAA、琼脂6-8g/L，pH5.5-6.2。待小苗长出3-5条白色小根后，转移到2000-4000lx光强下照光培养约一周，再在自然散射光下照光三天，揭盖炼苗2天后，洗去根基部琼脂，移栽到上层蛭石下层壤土的花盆中，隔天浇灌一次营养液，连续两周。移栽后小苗稍遮阴，一周后可在阳光下生长。温度以夜间不低于15℃、白天不高于28℃最佳。移栽半月后，小苗产生新根系，一月后定植于大田。甜菜试管苗生根率因基因型不同而有明显的差异，均在75％以上，不同基因型的试管苗移栽成活率高达98％。
对移栽成活苗，根据育种目标可进行二次筛选或抗性鉴定，以未经筛选的幼苗为阴性对照。若选择抗除草剂植株，则以适宜浓度的除草剂喷洒小苗，选择抗性植株进行恢复培养，然后定植于田间。若选择耐盐或耐旱植株，可选择带5片叶子的健壮植株栽于沙盆中，分别用含不同浓度选择剂的营养液浇灌，连续浇灌15天。存活植株经恢复培养后定植于田间。若选择耐低磷或耐低锌植株，也以去掉含磷化合物或含锌化合物的营养液浇灌健壮生长于沙盆中的小植株，一般连续浇灌15天，选取长势较好和缺素症状不明显的植株进行恢复培养，然后定植于田间。
具体实施方式
实施例1甜菜耐盐突变体的筛选及利用1、丛生芽诱导和扩增选用甜菜品种KWS6441、KWS9306、KWS5075、酒引抗4号、工农201、7721，取植株处于花蕾期的幼嫩花序顶端1.0cm，用70％酒精消毒1分钟，0.1％HgCl2水溶液杀菌3-5分钟，无菌水冲洗3次。灭菌后，将茎段切成含3-5个花蕾的小段，接种于诱导培养基进行诱导培养。诱导培养基的组成为MS培养基、蔗糖50g/L、200mg/L的水解酪蛋白(CH)、1.0mg/L的6-BA及0.25mg/L的NAA、琼脂7g/L，pH5.8。小切段在26±2℃条件下暗培养1周后，放置1500lx光照下培养，18天继代1次。继代培养基为丛生芽增殖培养基，培养基组成为MS培养基、蔗糖50g/L、200mg/L的水解酪蛋白(CH)、1.0mg/L的6-BA及0.25mg/L的NAA、琼脂7g/L，pH5.8。
不同基因型的切段产生丛生芽的速率不同，一般在接种8天后在花蕾基部的花托上开始分化丛生芽。随着培养时间的延长，丛生芽大量产生，聚集成丛。继代培养3次后，外植体产生丛生芽频率在80％以上。在继代培养中每个丛生芽每一次又可产生4-8个次生芽。
2、诱变处理和筛选剥去丛生芽长出的幼叶，将芽块切成2-3mm小块，放入加有增殖培养基的培养皿中用于γ射线诱变处理。首先确定射线照射的半致死剂量。取600个丛生芽小块，放入60个培养皿中，分别用0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30Gyγ射线辐照，然后在暗中培养2天，光下培养30天左右，统计丛生芽块死亡数，求出半致死辐照剂量约为20Gy。然后选用20Gy剂量进行诱变处理。辐照后的丛生芽块在暗中恢复培养2天左右，再在光下培养1周，然后转入NaCl浓度分别为1.5％、2.0％、2.5％、3.0％的培养基进行筛选。丛生芽块在筛选培养基上照光培养，每隔15天继代一次，连续筛选3代(次)，以未诱变的丛生芽块为阴性对照，观察统计幼苗的长势及死亡情况。筛选初期，丛生芽块虽长势较弱，但一周后旺盛增生(在高盐浓度的培养基上增生相对较慢)，组织块不断增大，筛选15天后，部分小芽生长变差或逐渐坏死。在第二次继代培养时(一般已筛选培养30天)，切去丛生芽块坏死部分和叶片。在第二代筛选培养中，丛生芽块生长速率和小芽增殖情况取决于细胞所受的胁迫情况，选择浓度高，组织块坏死比例高，产生的小芽少。小苗受害程度可分为3类。A、死亡苗生长点变黑死亡，叶片发黄枯死。B、枯黄苗生长缓慢，叶面皱缩，叶片发黄，茎基部变黑，不再分化丛生芽。C、正常苗生长速率受影响不大，叶片舒展，能分化丛生芽。在第三代筛选培养中，若培养基中选择剂浓度适宜，多数组织块变褐或死亡，少数组织块有生长正常的区域和新生的小芽。若盐浓度过高，则全部组织块死亡。选择剂浓度过低，多数组织块存活，筛选出的高抗性材料比例低。
3、植株再生和抗性鉴定从筛选培养基得到的小芽在转入增殖培养基后能迅速生长和产生大量的丛生芽。可将快速倍增的丛生芽用解剖刀分离成单芽或丛生芽小块，转移到6-BA(6-苄基嘌呤)1.0mg/L的增殖培养基上，待小苗长到3-5片小叶时转移到生根培养基上，在26±2℃下暗培养，诱导生根，15天继代一次。生根培养基的组成为1/2MS培养基、蔗糖30g/L、200mg/L的水解酪蛋白和2.5mg/L的NAA(萘乙酸)、琼脂7g/L，pH5.8。待小苗长出3-5条白色小根后，转移到2000lx光强下照光培养约一周，再在自然散射光下照光3天，揭盖炼苗2天后，洗去根基部琼脂，移栽到上层蛭石下层壤土的花盆中，隔天浇灌一次营养液，连续两周。移栽后小苗稍遮阴，一周后可在阳光下生长。温度以夜间不低于15℃、白天不高于28℃最佳。移栽半月后，小苗产生新根系，甜菜试管苗生根率因基因型不同而有明显的差异，均在75％以上，不同基因型的试管苗移栽成活率高达98％。
对移栽成活苗，也可进行抗性鉴定。将带5片叶子的健壮植株栽于砂盆中，分别用含不同浓度NaCl(对应于初次筛选所用的盐浓度)1/2MS无机盐溶液浇灌，连续浇灌15天。存活植株用不含NaCl的1/2MS无机盐溶液浇灌一周左右，然后定植于田间。
4、耐盐植株的利用筛选出的耐盐植株经春化处理后抽薹开花，用含有1.5％或2.0％NaCl的水溶液浇灌8天，再用含有1.5％或2.0％NaCl的1/2MS无机盐溶液浇灌40天，此时，植株已有6片叶，定植于大田。只有当代和子代植株都表现出耐盐性的基因型，才是可用的耐盐突变体。获得的耐盐植株后代用于甜菜耐盐新品种选育。
权利要求
1.一种通过丛生芽诱变和筛选创造甜菜抗逆新种质的方法，主要步骤包括取甜菜花蕾期的幼嫩花序切段为外植体，在诱导培养基上诱导丛生芽发生，然后转移到增殖培养基上增殖，剥取丛生芽小叶及叶柄，裸露生长点，进行诱变处理，对诱变处理后的丛生芽块进行恢复培养和扩增，然后转入附加选择剂或降低某种营养成分的增殖培养基上连续培养数代，筛选出存活的小芽转入生根培养基中诱导生根，也可将未经诱变处理的丛生芽块直接转入筛选培养基进行筛选，生根小苗长大后，检测其抗逆性或利用营养的效能。
2.如权利要求1所述的通过丛生芽诱变和筛选创造甜菜抗逆新种质的方法，其特征在于，所述的甜菜是糖甜菜品种、饲用甜菜品种和兼用型品种以及特用型品种之一。
3.如权利要求1所述的通过丛生芽诱变和筛选创造甜菜抗逆新种质的方法，其特征在于，所述的选择剂是附加在培养基中的耐盐或耐旱特性、或兼有耐盐耐旱特性、或分别耐高pH值和低pH值、或耐高铝浓度、或分别耐不同除草剂、或分别耐低磷、低钾及其它营养元素的用于筛选的环境条件之一。
4.如权利要求1所述的通过丛生芽诱变和筛选创造甜菜抗逆新种质的方法，其特征在于，所述降低某种营养成分是指筛选培养基中减量或减去氮、磷、钾、硫、锌、锰、铁、硼、钼等营养元素。
5.如权利要求1所述的通过丛生芽诱变和筛选创造甜菜抗逆新种质的方法，其特征在于，所述诱变处理中使用的诱变剂是化学试剂或物理因子。
6.如权利要求5所述的通过丛生芽诱变和筛选创造甜菜抗逆新种质的方法，其特征在于，所述物理诱变因子是γ射线、χ射线、紫外线、热中子、慢中子之一。
7.如权利要求1所述的通过丛生芽诱变和筛选创造甜菜抗逆新种质的方法，其特征在于，所述的小芽在选择培养基上可连续筛选2～6代，也可间隔筛选3～12代，使用的选择剂浓度可随小苗不同生长时期的敏感程度而变化。
8.如权利要求1所述的通过丛生芽诱变和筛选创造甜菜抗逆新种质的方法，其特征在于，所述培养基的配方是，丛生芽诱导培养基的组成为MS培养基、蔗糖30-60g/L、100-500mg/L的水解酪蛋白、0.5-3.0mg/L的6-BA、0.1-0.8mg/L的NAA、琼脂6-9g/L，pH5.5-6.2；丛生芽增殖培养基组成为MS培养基、蔗糖30-70g/L、50-500mg/L的水解酪蛋白、0.5-2.0mg/L的6-BA及0.1-0.8mg/L的NAA、琼脂6-8g/L，pH5.5-6.2；生根培养基的组成为1/2MS培养基、蔗糖20-50g/L、50-300mg/L的水解酪蛋白和1.0-5.0mg/L的NAA、琼脂6-8g/L，pH5.5-6.2。
9.如权利要求8所述的通过丛生芽诱变和筛选创造甜菜抗逆新种质的方法，其特征在于，所述培养基的配方是，丛生芽诱导培养基的组成为MS培养基、蔗糖50g/L、200mg/L的水解酪蛋白、1.0mg/L的6-BA及0.25mg/L的NAA、琼脂7g/L，pH5.8；丛生芽增殖培养基的组成为MS培养基、蔗糖50g/L、200mg/L的水解酪蛋白、1.0-2.0mg/L的6-BA及0.25mg/L的NAA、琼脂7g/L，pH5.8；小苗生根培养基的组成为1/2MS培养基、蔗糖30-50g/L、200mg/L的水解酪蛋白和2.5mg/L的NAA、琼脂7g/L，pH5.8。
10.如权利要求1所述的一种通过丛生芽诱变和筛选创造甜菜抗逆新种质的方法，取花蕾期幼嫩花序顶端切段为外植体，在丛生芽诱导培养基上诱导丛生芽发生；丛生芽块扩增后，剥去小叶，将组织块切成2-3毫米大小，用5-30Gy的γ射线辐照，恢复培养3天后，转入补加1.5-2.5％的NaCl的增殖培养基进行选择，连续筛选3-4代，获得耐盐的小苗；将2-3cm的小苗转入生根培养基中生根，获得耐盐植株，植株移栽成活后自交结实，检测子代的耐盐性和农艺性状，选出耐盐新种质。
全文摘要
本发明公开一种通过丛生芽诱变和筛选创造甜菜抗逆新种质的方法，主要步骤包括取甜菜花蕾期的幼嫩花序切段为外植体，在诱导培养基上诱导丛生芽发生，然后转移到增殖培养基上增殖，剥取丛生芽小叶及叶柄，裸露生长点，进行诱变处理，对诱变处理后的丛生芽块进行恢复培养和扩增，然后转入附加选择剂或降低某种营养成分的增殖培养基上连续培养数代，筛选出存活的小芽转入生根培养基中诱导生根，也可将未经诱变处理的丛生芽块直接转入筛选培养基进行筛选，生根小苗长大后，检测其抗逆性或利用营养的效能。本发明为甜菜抗逆育种或营养高效育种创造了优异材料。
文档编号A01H1/00GK1404719SQ0213573
公开日2003年3月26日 申请日期2002年10月23日 优先权日2002年10月23日
发明者杨爱芳, 张举仁, 张可炜, 王海峰 申请人:山东大学