含昆虫病毒增效蛋白的化学农药及应用的制作方法

专利名称：含昆虫病毒增效蛋白的化学农药及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及化学农药杀虫剂及复合杀虫剂，更具体涉及一种含昆虫病毒增效蛋白的化学农药，本发明还涉及昆虫病毒增效蛋白在化学农药杀虫剂和复合杀虫剂中的应用。
背景技术：
1956年，Tanada等首次从美洲一星粘虫颗粒体病毒(Pseudaletia unipunctagranulosis virus，PuGV)分离出增效蛋白，并证实该蛋白对美洲粘虫核型多角体病毒(Pseudaletia unipuncta nuclear polyhedrosis virus，PuNPV)具有增强感染的作用(Tanada Y et al.，J Invertebr Pathol，1959，1215-231)。Hashimoto(HashimotoY et al.，J Gen Virol，1991，722645-2651)和Roelvink(Roelvink P W et al.，J GenVirol，1995，762693-2705)分别对粉纹夜蛾颗粒体病毒(Trichoplusia ni granulosisvirus，TnGV)、PuGV、棉铃虫颗粒体病毒(Heliothis armigera granulosis virus，HaGV)增效蛋白基因进行了克隆和序列分析，比较了它们的同源性。目前，已在9种颗粒体病毒、舞毒蛾核型多角体病毒(Lymantria dispar nuclear polyhedrosisvirus，LdNPV)和4种痘病毒中发现了昆虫病毒增效蛋白(Hayakawa T et al.，Gene，1996，177269-270)。
昆虫病毒增效蛋白是病毒基因编码的一种金属蛋白酶，分子量为89-110kDa，具有一个典型的金属蛋白酶锌-结合域HEXXH，位置十分保守，且对中肠围食膜的降解作用受到金属螯合剂的抑制(Lepore L S et al.，Invertebr Pathol，1996，68131-140)。
昆虫病毒增效蛋白能提高昆虫的敏感性，加速核型多角体病毒的感染进程(Tanada Y et al.，Insect Pathol，1959，1215-231)，同时能提高苏云金杆菌伴孢晶体对幼虫的毒力(Corsaro B G et al.，A parasites and pathogens of insectsII.Pathogens.San DiegoAcademic Press，1993.127-145)。昆虫病毒增效蛋白的作用机制有两种一种是增效蛋白能与中肠细胞膜上的特异位点结合，介导病毒囊膜与细胞质膜之间的融合，促进病毒进入宿主细胞内，从而增加病毒感染的效果。但增效蛋白与中肠细胞膜上的特异位点结合并不是增进病毒感染所必需的。另一种机制是增效蛋白通过降解肠粘蛋白IIM而破坏昆虫幼虫中肠围食膜，使病毒粒子更容易进入中肠细胞，同时提高了某些必须穿透围食膜而发生作用的生物杀虫剂的效能(Wang P et al.，Natl Acad Sci USA，1997，946977-6982)。
目前，获得昆虫病毒增效蛋白的方式有以下几种(1)从颗粒体病毒、核型多角体和痘病毒中分离纯化获得增效蛋白。(2)将增效蛋白基因重组在AcMNPV等广谱MNPV中，构建广谱高效的重组病毒。含增效蛋白基因的重组AcMNPV比野生型AcMNPV的感染能力略低，但当与野生型AcMNPV适当比例混合时，则其感染能力高于野生型病毒。(3)构建含增效蛋白基因的转基因植物，提高害虫对昆虫病毒的敏感。(4)在原核细胞和真核细胞中表达增效蛋白。
世界农业面临每年增加7000万人口的巨大压力，而耕地是有限的。化学农药在农业发展、有害生物综合治理和农业可持续发展中发挥了巨大作用，是现代农业必需的生产资料。在提高现有耕地的质量和单位面积产量的情况下，用化学农药来防治虫害对农业生产的危害，避免损失，是非常重要的措施。化学农药具有高效、速效、使用方便、适应性广等优点。但是，目前使用的化学农药大多是人工合成的有毒的化学物质。由于化学农药长期大量地、广泛地、连续地、不合理使用，导致了一系列严重后果。一方面导致害虫抗药性日趋严重，用药量越来越大，形成恶性循环。另一方面，过量地使用化学农药，造成大量天敌被杀伤，有益生物种类减少，次要害虫暴发，破坏了生态平衡。特别是农药污染了环境，大气、土壤和水源被污染，农药在农副产品中的残留量增加，严重超标，愈来愈大地危害了人类身体健康，并且造成了很大的经济损失。
目前，世界各国从法规上对化学农药的使用、生产和开发提出了一系列规定，实行了农药注册登记制度。化学农药的发展趋势包括(1)降低化学农药的用量，提高原药固有的活性及其使用效率和使用效果。(2)减小化学农药对非靶标生物和生态环境的负面影响。(3)改善化学农药与环境的相容性。(4)提高化学农药对人、畜和作物的安全性。其中，减少化学农药的使用量，在世界各发达国家中的呼声日趋高涨，世界各国均制定了严格限制生产和使用的管理法规。

发明内容
本发明的目的在于提供一种含昆虫病毒增效蛋白的化学农药，利用昆虫病毒增效蛋白和化学农药或化学农药复合剂复配，降低了化学农药的有效含量，提高化学农药杀虫活性，增加了药效，提高了化学农药的生防效率。
本发明还涉及昆虫病毒增效蛋白在化学农药杀虫剂中的应用。
本发明还涉及昆虫病毒增效蛋白在复合杀虫剂中的应用。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施通过凝胶过滤和离子交换等生化技术，利用纯化的昆虫病毒多角体分离纯化获得昆虫病毒增效蛋白，或者利用基因工程构建工程菌株，表达，纯化获得昆虫病毒增效蛋白。以昆虫病毒增效蛋白作为增效中间体，按一定比例与化学农药混配。其特征是昆虫病毒增效蛋白终浓度为1-3×1020μg/L与化学农药混配。用昆虫病毒增效蛋白和化学农药或化学农药复合剂复配，用于化学农药或化学农药复合剂的制备，应用于生物防治。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果①大幅度降低了化学农药的有效成分用量，增加了药效，提高了化学农药的生防效率；②大幅度降低了化学农药的残留，增效蛋白对人畜安全，对作物安全，不污染环境，并可使化学农药的残留相对大幅度降低；③降低或消除害虫对化学农药的抗药性。
具体实施例方式
1、昆虫病毒基因工程增效蛋白的制备挑取含有昆虫杆状病毒增效蛋白基因的工程菌株，如E.coliM15(pQE-TnGVEn Cp96)、E.coli M15(pQE-TnGVNp85)、E.coliM15(pQE-TnGVCp80)、E.coli M15(pQE-TnGV-Enp108)等单菌落于含100μg/ml氨苄青霉素和25μg/ml卡那霉素的25ml LB培养基中，37℃，200rpm过夜培养。活化菌液以1∶20接种含100μg氨苄青霉素和25μg/ml卡那霉素的500ml LB培养液中，继续培养，当其浓度OD600＝0.3时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至终浓度1mmol/L，37℃诱导5h，收获菌液，4000rpm离心10min，收集菌体沉淀。
在细菌沉淀中加入2-5倍体积的超声波处理液(50mmol/L Tris-HCl pH8.0-0.1mol/L NaCl-2mg/ml溶菌酶)，反复冻融3次，37℃，保温1h，然后置于冰中用超声波破碎细菌。置于光学显微镜高倍物镜观察，有大量晶体。处理液上30-60％蔗糖梯度，4000rpm离心40min，取出包涵体带，用灭菌双蒸水洗3次，收获纯化的增效蛋白晶体，4℃保存。
2、增效蛋白的鉴定采用SDS-PAGE电泳分析。
(1)上样和电泳参照Sambrook“分子克隆手册”，制备10％分离胶和浓缩胶。在样品中加等体积2×SDS凝胶加样缓冲液，于100℃加热3-5min变性。样品上样。以100V电泳至溴酚兰进入分离胶，提高电压至150V，当溴酚兰到达底部前约1cm处结束电泳。
(2)固定、染色和脱色剥胶后以5倍体积染色液固定、染色过夜，收凝胶浸泡于脱色液中平缓摇动4h以上，其间更换脱色液4-5次。
(3)结果分析脱色完全后即可观察照像，并用激光扫描确定增效蛋白的纯度和含量。
3、粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白P108对卡死克的增效作用卡死克(Cascade)的有效成分是fulfenoxuron，是一种昆虫生长调节剂，通过阻止幼虫蜕皮而杀螨杀虫，同时可影响成虫产卵率及卵孵化率。卡死克具有触杀及滞留性杀虫作用，对多种害虫，如菜青虫、小菜蛾、甜菜夜蛾、红蜘蛛、棉铃虫等均有防治作用。
在5％卡死克可分散剂中，按200μg/L加入粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白P108，配成混剂。用倍比稀释法将上述混剂和5％卡死克单剂配成若干浓度梯度，即稀释倍数为1,000-64,000倍。取3龄初甜菜夜蛾幼虫室温下单头饲养于24孔Costar细胞培养皿中。分别用各稀释度感染液制成感染饲料，每个稀释度样品感染供试甜菜夜蛾三龄幼虫96头，并设单蒸水对照。每孔加适量人工饲料，并加30μl上述各种处理液于人工饲料表面，使其充分吸收。48h统计死亡和存活虫数，采用DPS进行数据处理。结果表明粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白P108提高了卡死克对甜菜夜蛾的毒力，增效系数为178。
4、昆虫病毒增效蛋白P108对“来福灵”合成除虫菊酯类杀虫剂的增效作用“来福灵”合成除虫菊酯类杀虫剂(5％乳油)是日本住友化学工业株式会社研究开发的具有高度杀虫效力的合成除虫菊酯类杀虫剂。对多种作物上的害虫，如棉铃虫、菜青虫、桃小食心虫、蚜虫等具有强烈的杀虫效果而且残效时间长。
在5％“来福灵”合成除虫菊酯类乳油中，按180μg/L加入粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白P108，配成混剂。用倍比稀释法将上述混剂和5％卡死克单剂配成若干浓度梯度，即稀释倍数为2500-64000倍。取3龄初甜菜夜蛾幼虫室温下单头饲养于24孔Costar细胞培养皿中。分别用各稀释度感染液制成感染饲料，每个稀释度样品感染供试甜菜夜蛾三龄幼虫96头，并设单蒸水对照。每孔加适量人工饲料，并加30μl上述各种处理液于人工饲料表面，使其充分吸收。48h统计死亡和存活虫数，采用DPS进行数据处理。结果表明粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白P108提高了5％“来福灵”合成除虫菊酯类乳油对甜菜夜蛾的毒力，增效系数为250。
5、昆虫病毒增效蛋白P108对抑太保杀虫剂的增效作用在5％抑太保可分散剂中，按160μg/L加入粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白P108，配成混剂。用倍比稀释法将上述混剂和5％卡死克单剂配成若干浓度梯度，即稀释倍数为1,000-64,000倍。取3龄初甜菜夜蛾幼虫室温下单头饲养于24孔Costar细胞培养皿中。分别用各稀释度感染液制成感染饲料，每个稀释度样品感染供试甜菜夜蛾三龄幼虫96头，并设单蒸水对照。每孔加适量人工饲料，并加30μl上述各种处理液于人工饲料表面，使其充分吸收。48h统计死亡和存活虫数，采用DPS进行数据处理。结果表明粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白P108提高了抑太保对甜菜夜蛾的毒力，增效系数为671。
6、昆虫病毒增效蛋白P108对米满杀虫剂的增效作用在20％米满可分散剂中，240μg/L加入粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白P108，配成混剂。用倍比稀释法将上述混剂和20％米满单剂配成若干浓度梯度，即稀释倍数为2,000-64,000倍。取3龄初甜菜夜蛾幼虫室温下单头饲养于24孔Costar细胞培养皿中。分别用各稀释度感染液制成感染饲料，每个稀释度样品感染供试甜菜夜蛾三龄幼虫96头，并设单蒸水对照。每孔加适量人工饲料，并加30μl上述各种处理液于人工饲料表面，使其充分吸收。48h统计死亡和存活虫数，采用DPS进行数据处理。结果表明粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白P108提高了米满对甜菜夜蛾的毒力，增效系数为472。
权利要求
1.一种含昆虫病毒增效蛋白的化学农药，其特征在于昆虫病毒增效蛋白终浓度1-3×1020μg/L与化学农药混配。
2.根据权利要求1所述的一种含昆虫病毒增效蛋白的化学农药，其特征在于化学农药包括有机磷、菊酯类、氨基甲酸酯、有机氮和昆虫生长发育激素类。
3.根据权利要求1所述的昆虫病毒增效蛋白在化学农药杀虫剂中的应用。
4.根据权利要求1所述的昆虫病毒增效蛋白在复合杀虫剂中的应用。
5.根据权利要求1所述的昆虫病毒增效蛋白，其特征在于利用纯化的昆虫病毒多角体，分离纯化获得昆虫病毒增效蛋白或利用基因工程构建工程菌株，表达、纯化获得昆虫病毒增效蛋白。
全文摘要
本发明公开了一种含昆虫病毒增效蛋白的化学农药及应用，其特征在于昆虫病毒增效蛋白与化学农药混配，昆虫病毒增效蛋白在化学农药杀虫剂和复合杀虫剂中的应用。利用纯化的昆虫病毒多角体，分离纯化获得昆虫病毒增效蛋白；或者采用基因工程方法，表达和纯化昆虫病毒增效蛋白。本发明提高了化学农药的生防效率，降低了化学农药的有效含量，增加了药效，提高了防治效果，降低或消除虫对化学农药的抗药性。昆虫病毒增效蛋白对人畜安全，对作物安全，不污染环境。
文档编号A01N63/00GK1401246SQ0213903
公开日2003年3月12日 申请日期2002年9月12日 优先权日2002年9月12日
发明者孟小林, 徐进平, 王健, 鲁伟 申请人:武汉大学