本发明属于生物技术领域，具体是涉及一种提高猪瘟病毒E2重组蛋白表达量的昆虫细胞维持液及其配制方法。
背景技术：
杆状病毒表达系统可为高表达的外源蛋白在细胞内进行正确折叠、二硫键的搭配及寡聚物的形成提供良好的环境，可使表达产物在结构及功能上接近天然蛋白，所以利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统重组蛋白是亚单位疫苗研发的重要方向之一。但是，由于昆虫细胞培养基价格昂贵，重组蛋白表达量较低，导致很多重组杆状病毒亚单位疫苗停步于实验室研发阶段。常规的昆虫细胞-杆状病毒表达系统接毒方法是，当昆虫细胞生长到一定密度，活率不低于95％时，用昆虫细胞培养基调整细胞密度，补充体系养分后接种杆状病毒。商品化的无血清昆虫细胞培养基价格昂贵，pH值介于6.10-6.40，渗透压介于350-380mOsm/kg。此方法未考虑接毒后细胞生长需求及病毒复制的限制性因素，不仅影响猪瘟病毒E2重组蛋白的表达，而且单位体积抗原生产成本高。
目前研究表明，其原因可能是，一、随着昆虫细胞的增殖，对能量、限制性氨基酸需求量加大，同时细胞代谢物大量积累(乳酸、丙氨酸、尿酸、NH4+等)，培养液的pH、渗透压相应发生改变，极大地影响昆虫细胞生长及接毒后病毒的增殖。细胞培养体系缺少谷氨酰胺时会影响细胞合成核酸、蛋白质，以致影响细胞生长。但溶液中不稳定的谷氨酰胺会对培养的细胞产生有害影响，丙氨酰谷氨酰胺(丙谷二肽，Ala-Gln)是一种二肽，稳定性好，在培养基中可有效替代谷氨酰胺，促进细胞生长。Kennie U.Dee等报道昆虫细胞培养过程中培养基提供的葡萄糖能够满足需求，而天冬氨酸消耗较多，是细胞生长的制约因素之一。二、重组杆状病毒感染昆虫细胞早期表现为细胞直径增大，细胞核变大；晚期表现为细胞停止生长，病毒出芽，部分细胞凋亡，感染末期细胞裂解。感染晚期为重组蛋白的最佳收获期。病毒利用宿主细胞合成自身蛋白过程中，可能因体系氨基酸等养分的缺失影响病毒的增殖、复制。
技术实现要素：
本发明的目的在于：提供了一种提高猪瘟病毒E2重组蛋白表达量的昆虫细胞维持液及其配制方法，用于昆虫细胞接种重组杆状病毒后调节体系组分，补充养分，以维持细胞生长，促进重组杆状病毒的增殖及猪瘟病毒E2重组蛋白的分泌量，同时降低表达成本。
本发明的的技术方案：一种提高猪瘟病毒E2重组蛋白表达量的昆虫细胞维持液，所述昆虫细胞维持液是由在1×PBS平衡液-磷酸盐缓冲液中添加限制性氨基酸、硫酸葡聚糖钠盐及聚醚F-68组成。
进一步，所述1×PBS平衡液-磷酸盐缓冲液是由氯化钠6000-10000mg/L、氯化钾100-300mg/L、磷酸氢二钠1000-2000mg/L、磷酸二氢钾100-400mg/L及余量的浓盐酸组成，所述余量的浓盐酸是指将上述1×PBS平衡液-磷酸盐缓冲液的pH值调整为6.40的使用量。更进一步，所述1×PBS平衡液-磷酸盐缓冲液是由氯化钠8000mg/L、氯化钾200mg/L、磷酸氢二钠1440mg/L、磷酸二氢钾240mg/L及余量的浓盐酸组成，所述余量的浓盐酸是指将上述1×PBS平衡液-磷酸盐缓冲液的pH值调整为6.40的使用量。
进一步，所述的限制性氨基酸是指在甘氨酸、DL-苏氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺及丙谷二肽。再进一步，所述的甘氨酸20-40mg/L、DL-苏氨酸80-105mg/L、L-缬氨酸80-105mg/L、L-亮氨酸90-150mg/L、L-天冬氨酸20-40mg/L、L-天冬酰胺30-70mg/L、丙谷二肽150-450mg/L。更进一步，所述的甘氨酸30mg/L、DL-苏氨酸95mg/L、L-缬氨酸94mg/L、L-亮氨酸105mg/L、L-天冬氨酸30mg/L、L-天冬酰胺50mg/L及丙谷二肽300mg/L。
进一步，所述的硫酸葡聚糖钠80-120mg/L；所述聚醚F-68为800-1200mg/L。更进一步，所述硫酸葡聚糖钠100mg/L；所述聚醚F-68为1000mg/L。
配制上述昆虫细胞维持液的方法：用去离子水配制1×PBS平衡液-磷酸盐缓冲液，滴加浓盐酸将pH调节至6.40后；向上述平衡液-磷酸盐缓冲液中添加甘氨酸、DL-苏氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、丙谷二肽、硫酸葡聚糖钠及聚醚F-68，充分溶解后用0.22μm的除菌过滤器过滤；最后，无菌检验合格，渗透压在350-380mOsm/kg的溶液即可作为昆虫细胞维持液。
有益效果：本发明根据遗传算法，分析了构成猪瘟病毒E2蛋白的373个氨基酸，其中氨基酸数最多的为缬氨酸、苏氨酸、亮氨酸、甘氨酸，是重组杆状病毒合成E2重组蛋白的限制性氨基酸。其中，硫酸葡聚糖钠盐可以有效促进昆虫细胞悬浮培养及蛋白的表达；聚醚F-68可保护悬液中的细胞免受转移和搅拌造成的损害，在发酵罐中进行大批量细胞培养时，可以防止空气粘附于细胞，稳定细胞表面泡沫来提高细胞膜对水动力剪切的抵抗力。
本发明在平衡液-磷酸盐缓冲液(1×PBS)中特异性添加杆状病毒合成E2蛋白的限制性氨基酸、硫酸葡聚糖钠盐及聚醚F-68，作为维持液用于替代昆虫细胞接种重组杆状病毒的细胞培养基。在相同的培养条件、细胞数量及接毒量下，与昆虫细胞培养基相比，本发明显著提高了单位数量细胞感染、生产重组杆状病毒量及分泌E2重组蛋白含量，很大程度上降低了生产成本。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。
实施例1、用生物学软件DNAman分析重组在杆状病毒上的猪瘟病毒E2基因序列(1119bp)及其编码的氨基酸序列(373aa)，比较了序列的氨基酸组分，预测该蛋白的等电点为5.93，结果见表1。基于遗传算法预测该蛋白合成的主要限制性氨基酸是缬氨酸、苏氨酸、亮氨酸、甘氨酸。
表1 猪瘟病毒E2蛋白氨基酸组分
昆虫细胞生长代谢研究结果表明，天冬氨酸随细胞生长而快速消耗；基于实验室对昆虫细胞悬浮培养研究，证实添加聚醚F-68及硫酸葡聚糖钠盐可提高细胞抗剪切力，改善细胞悬浮培养状态。
综上，本申请建立了一种用于昆虫细胞接种重组杆状病毒后的细胞维持液配制新方法，在1×PBS平衡液中添加细胞培养保护剂聚醚F-68、硫酸葡聚糖钠盐以及能够提高重组蛋白表达量的特异性氨基酸，具体配制方法如下：
根据表2称量下列试剂，用去离子水配制1×PBS平衡液，滴加浓盐酸将pH调节至6.40后定容，备用。
表2 PBS平衡液配方
根据表3称量下列试剂，依次溶解于新鲜配制的1×PBS平衡液(pH＝6.40)中，用0.22μm的除菌过滤器过滤，留样进行无菌检验及渗透压测定。无菌检验合格，渗透压介于350-380mOsm/kg的溶液即可作为昆虫细胞接种杆状病毒后的维持液，用于改善细胞悬浮培养条件，提高猪瘟病毒E2重组蛋白的表达量。
表3 昆虫细胞接毒维持液配方
当昆虫细胞生长至一定密度，加入所需体积的病毒维持液，调整细胞密度接种杆状病毒，在病毒感染高峰期(晚期)，取样进行细胞计数；收获病毒后，检测毒液内猪瘟病毒E2重组蛋白的定量。
实践验证，1、Sf9细胞悬浮培养表达E2蛋白Sf-9细胞系源于美国农业部昆虫病理实验室，来源于秋蝇蠕虫(草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda)蛹的卵巢组织。High five细胞(BTI-TN-5B1-4)是来自于粉纹夜蛾(Trichopulsia ni)亲本细胞系的克隆分离株。由于Sf-9和High five细胞株对模式病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)非常敏感，因而成为各实验室普遍采用的用于杆状病毒表达的细胞系。
将Sf-9细胞用SF900II无血清昆虫细胞培养液进行悬浮培养，当细胞密度达到2.0×106个/ml(细胞存活率不低于95％)时，将细胞等量分瓶培养，分别用昆虫细胞培养基和病毒维持液调整细胞密度至1.0×106个/ml，接种等量猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒，在26～28℃恒温振荡培养箱(以180r/min)中培养7日后取样镜检，计算细胞活率。病毒液以转速3000r/min离心20分钟，收集上清液，对收获的猪瘟病毒E2重组蛋白进行定性及定量分析，试验结果见表4。
表4 Sf-9细胞接种重组杆状病毒7日后细胞记数结果
由表4可知，经三批共9次试验验证，分别用昆虫细胞培养基和病毒维持液调至Sf-9细胞密度，接种感染重组杆状病毒后7日，经t检验分析，在两种不同的维持液体系下，活细胞密度无显著性差异(p＞0.05)，细胞活率和收获E2蛋白含量的差异显著(p＜0.05)，用病毒维持液调整细胞密度、体系环境及养分后，单位体积平均可提高4.08μg猪瘟病毒E2重组蛋白合成量。
2、High five细胞悬浮培养表达E2蛋白将High five细胞用SFX-Insect无血清昆虫细胞培养液进行悬浮培养，当细胞密度达到3.0×106个/ml(细胞存活率不低于95％)时，将细胞等量分瓶培养，分别用昆虫细胞培养基和病毒维持液调整细胞密度至1.5×106个/ml，接种等量猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒，在26～28℃恒温振荡培养箱(以180r/min)中培养4日后取样镜检，计算细胞活率。病毒液以转速3000r/min离心20分钟，收集上清液，对收获的猪瘟病毒E2重组蛋白进行定性及定量分析，试验结果见表5。
表5 High five细胞接种重组杆状病毒4日后细胞记数及蛋白定量结果
由表5可知，经三批共9次试验验证，分别用昆虫细胞培养基和病毒维持液调至High five细胞密度，接种感染重组杆状病毒后4日，经t检验分析，在两种不同的维持液体系下，活细胞密度无显著性差异(p＞0.05)，细胞活率和收获的E2蛋白含量差异显著(p＜0.05)，用病毒维持液调整细胞密度、体系环境及养分后，单位体积可提高6.39μg猪瘟病毒E2重组蛋白分泌量。
综上，本申请所提出的昆虫细胞维持液与常规的昆虫细胞培养基相比，不仅可有效提高昆虫细胞-杆状病毒表达的猪瘟病毒E2重组蛋白含量，而且很大程度上降低了抗原生产成本，为猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒灭活疫苗的工业化放大生产奠定了基础，为昆虫细胞-杆状病毒表达系统的优化开辟了新的途径。
本申请所述的病毒维持液配方中主要组分信息如下：硫酸葡聚糖钠盐(Sigma，D1776)、聚醚F-68(Sigma，P7061)、L-缬氨酸(Sigma，V0513)、甘氨酸(Sigma，G8790)、DL-苏氨酸(Sigma，T1520)、L-亮氨酸(Sigma，L8912)、L-天冬氨酸(Sigma，A5474)、L-天冬酰胺(Sigma，A4159)、丙谷二肽(Sigma，A8185)、氯化钠(Sigma，S5886)，氯化钾(Sigma，P5405)、磷酸二氢钾(Sigma，P5655)、磷酸氢二钠(Sigma，S5136)，以上均为细胞培养级试剂。
本申请所用的Sf-9细胞系、High five细胞系均购自美国Invitrogen生命技术公司；SF900II无血清昆虫细胞培养液购自Gibco公司，货号：10902；SFX-Insect昆虫细胞培养液购自美国Hyclone公司，货号：SH30278.02。
本申请所述的细胞计数方法：Countstar自动细胞计数仪。
本申请所述的猪瘟病毒E2重组蛋白含量测定方法如下：
1材料与方法
1.1.1蛋白 昆虫细胞-杆状病毒系统表达的猪瘟病毒E2蛋白，牛血清白蛋白(Thermo，23209)。
1.1.2试剂 猪瘟阳性血清(购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心)、辣根过氧化物酶标记的兔抗猪二抗(Sigma，A5670)、辣根过氧化物酶底物试剂盒(VECTOR，SK-4600)、蛋白预染Marker(Fermentas，SM0671)、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(Solarbio，P1200)、Tris base(Sigma，T1503)、Tween-20(Solarbio，T8220)、考马斯亮蓝(Amresco，C8430)、PVDF膜(Thermo，88585)、SDS(Sigma，S8010)、脱脂乳、1×PBS、甲醇、乙醇、醋酸等。
1.1.3仪器、设备、软件 Bio-Rad小型垂直电泳槽、Bio-Rad电泳仪、Bio-Rad小型湿式转印槽、水平脱色摇床、Geldot-it310凝胶成像系统(UVP)等。蛋白定量分析软件为GelDoc-It Imaging System Vision Works。
1.2方法
1.2.1样品处理 取Sf-9、High five细胞上表达的猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒上清液1ml至微量离心管中。由-20℃冰箱中取出5×上样缓冲液，取80μl的上清液与20μl 5×上样缓冲液混合均匀后，水浴中煮沸15分钟后，置冰上备用。
1.2.2蛋白质标准液稀释 取连续2倍稀释的牛血清白蛋白(BSA)标准液80μl(250、125、62.5、31.25、15.625μg/ml)与20μl 5×上样缓冲液混合均匀，在水浴中煮沸15分钟后，置于冰上备用。
1.2.3蛋白胶的电泳 用SDS-PAGE凝胶制备试剂盒准备12％胶2片，将蛋白Marker、样品及BSA蛋白质标准液依序上样至胶片中，以电压150伏特，电泳80分钟。
1.2.4转膜 电泳完毕后，一片胶片用于转膜，300mA湿转1小时，使蛋白质转印到PVDF膜上，完成后取出膜置塑料洗盒中，加入25ml的5％脱脂乳在室温下封闭30分钟。
1.2.5一抗反应 倒掉脱脂乳，用PBST洗三次后，在1％PBA(PBS+1％BSA)中加入一抗猪瘟阳性血清(1︰1000)，置室温反应1小时，倒掉一抗，用PBST洗五次每次20ml。
1.2.6二抗反应 加入辣根过氧化物酶标记的兔抗猪二抗(1︰5000稀释)，室温下摇晃反应1小时，倒掉二抗，用PBST洗6次后显色。
1.2.7显色 在暗室内，将膜放入平皿中，先加1ml去离子水，再用辣根过氧化物酶底物试剂盒显色。在约48kDa见到特异性条带则表示所表达的蛋白能被猪瘟阳性血清识别，昆虫细胞-杆状病毒成功表达猪瘟病毒E2蛋白。
1.2.8蛋白定量 另一片胶用考马斯亮蓝染色液染色30分钟，然后脱色，在凝胶成像仪上成像、保存。根据蛋白印迹结果，确定猪瘟病毒E2重组蛋白条带，用凝胶成像分析系统(UVP GelDoc-It Imaging System Vision Works)，以BSA为参比，做标准曲线定量猪瘟病毒E2蛋白。