一种提高碱性预处理木质纤维原料酶解得率的方法与流程

本发明涉及可发酵性糖的制备工艺，具体涉及一种提高碱性预处理木质纤维原料酶解得率的方法。

背景技术：

随着人类社会对化石资源需求的日益增长和过度开采，地球上化石资源不可避免地面临着枯竭殆尽的命运；而大量化石资源的使用所引发的温室效应及近年来爆发的雾霾污染则演变成为人类所面临的另一大挑战；同时，以石油资源为原料生产的不可降解塑料制品的大量使用所造成的“白色污染”已成为社会一大公害，急需寻找可降解新材料。因此，我国能源结构调整刻不容缓，利用可再生的生物质资源生产生物能源、生物基化学品和生物材料是我国可持续发展的长效机制。

玉米是我国重要的粮食作物，每年所产生的玉米秸秆总量极其可观。玉米秸秆的焚烧所造成的大气污染问题亟待解决，因此玉米秸秆的规模化利用也备受关注。木质纤维原料生物炼制成能源或化学品是玉米秸秆规模化、有效利用的途径之一。玉米秸秆中的纤维素在纤维素酶催化下可降解成单糖，继而被不同微生物发酵成各种能源或化学品。与其它纤维素废弃物一样，玉米秸秆中纤维素、半纤维素和木质素形成致密的结构，不利于纤维素酶对纤维素的作用。其中，底物中木质素的存在对纤维素酶水解有阻碍作用，其抑制机制包括对纤维素酶进攻的空间位阻作用及对纤维素酶的无效吸附作用。通常认为，预处理过程中木质素脱除率越高，木质纤维原料中纤维素暴露得越多，越有利于后续的纤维素酶水解。碱法预处理及有机溶剂预处理对木质素的脱除效果显著，但由于有机溶剂预处理对预处理设备要求高，以及具有爆炸的安全隐患等问题，工业化应用可能性较低。碱法预处理常用于制浆造纸行业，且成熟的药品回收技术使得碱法预处理成为木质纤维预处理的常用方法之一。在碱法预处理过程中，木质素的醚键与酯键大量断裂，使得木质素大量溶出。研究表明，用碱量及预处理温度与木质素的脱除率呈正比。但在碱预处理过程中，过高的用碱量及预处理温度会导致严重的剥皮反应，从而降低纤维素与半纤维素的回收率。

木质素对纤维素酶水解的抑制程度不仅受木质素含量的影响，与木质素的理化性质与化学结构也密切相关。碱预处理物料中的残余木质素可通过吸附纤维素酶，降低有效纤维素酶浓度，从而增加纤维素酶用量及酶水解的成本。木质素与纤维素酶蛋白之间的相互作用力主要包括疏水作用、静电作用及氢键作用。大量文献报道了通过添加非离子型表面活性剂可干预纤维素酶与木质素之间的相互作用，从而提高木质纤维原料酶水解性能。近年来报道了木质素经聚乙氧基接枝修饰制备两亲性木质素基表面活性剂。在纤维素酶水解过程中添加木质素基表面活性剂，同样可显著促进纤维素酶水解。目前，聚乙氧基接枝修饰方法仅用于木质素样品，需将原料中木质素分离后进行化学改性，再添加至酶水解体系中，从而起到提高预处理物料酶水解得率的效果。此工艺过程过于复杂，不适合规模化工业生产，因此需简化聚乙氧基接枝修饰木质素提高纤维素酶解得率的工艺过程。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供提高碱性预处理木质纤维原料酶解得率的方法，通过在预处理过程中添加聚乙氧基醚共处理底物，达到提高酶水解得率的目的。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种提高碱性预处理木质纤维原料酶解得率的方法，包括原料预处理和酶水解步骤；在所述的预处理步骤中，添加聚乙二醇二缩水甘油醚共处理底物。

所述的聚乙二醇二缩水甘油醚g/g用量为5-30％，按物料绝干重计，优选为10％。

所述的预处理步骤为：木质纤维原料于碱用量10-40％，聚乙二醇二缩水甘油醚用量10％，固液比1:10g/mL，70℃下共处理3h。优选为：木质纤维原料于碱用量10％，聚乙二醇二缩水甘油醚用量10％，固液比1:10g/mL，70℃下共处理3h。

在所述的酶水解步骤中，所用的酶为纤维素酶，是以木霉、曲霉或细菌产生的能降解纤维素成葡萄糖的纤维素酶的一种或多种酶的复合物。

所述的酶水解纤维素g/mL浓度为2-10％。

所述的提高碱性预处理木质纤维原料酶解得率的方法，具体步骤如下：

1)木质纤维原料预处理固液比为1:10，碱用量为10-40％，聚乙二醇二缩水甘油醚用量为5-30％，预处理时间为1.5-4.0h；

2)预处理结束后，过滤分离获得预处理物料，并经水洗、过滤，洗去残余的碱液、溶出的木质素及糖分；

3)将上述预处理玉米秸秆与纤维素酶混合，加入水、pH缓冲液、酸或碱，混合至纤维素浓度2-10％，控制pH值在4.0-6.0，反应体系中每克纤维素的纤维素酶用量为10-40FPU，于45-55℃下酶解反应48-72h得到可发酵性糖。

所述的提高碱性预处理木质纤维原料酶解得率的方法，优选，具体步骤如下：

1)木质纤维原料预处理固液比为1:10，碱用量为10％，聚乙二醇二缩水甘油醚用量为10％，预处理时间为3h；

2)预处理结束后，过滤分离获得预处理物料，并经水洗、过滤，洗去残余的碱液、溶出的木质素及糖分；

3)将上述预处理玉米秸秆与纤维素酶混合，加入水、pH缓冲液、酸或碱，混合至纤维素浓度2-10％，控制pH值在4.0-6.0，反应体系中每克纤维素的纤维素酶用量为10-40FPU，于45-55℃下酶解反应48-72h得到可发酵性糖。

有益效果：与现有技术相比，本发明的提高碱性预处理木质纤维原料酶解得率的方法，在低温碱预处理中添加聚乙二醇二缩水甘油醚共处理底物，有效减弱酶水解过程中木质素对纤维素酶的非特异性吸附，有利于促进纤维素酶水解的进行。试验结果表明，与现有研究结果相比，本专利的酶水解得率提高了39.75％，达到71.26％。同时本方法预处理工艺条件简单，反应条件温和，碳水化合物回收率高，且具有低能耗及药品回收等优点，更具有实际操作价值，具有很好的实用性。

附图说明

图1是预处理玉米秸秆酶水解过程中游离酶蛋白含量结果图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步的阐述。实施例是为说明而非限制本发明。本领域中任何普通技术人员能够理解这些实施例，不以任何方式限制本发明，可做适当的修改而不违背本发明的实质和偏离本发明的范围。

以下实施例中，葡萄糖、木糖和纤维二糖浓度采用高效液相色谱法(HPLC)测定。色谱条件如下：色谱仪：Agillent1200高效液相色谱仪；色谱柱：Bio-Rad Aminex HPX-87H；流动相：0.005mol/L硫酸，流速：0.6mL/min；柱温：55℃；检测器：示差折光检测器；进样量：10μL。外标法测定。

实施例中，预处理碱用量以玉米秸秆绝干重计，以碱用量10％(g/g)为例，指预处理100g绝干原料，碱用量为10g；聚乙二醇二缩水甘油醚用量以玉米秸秆绝干重计，以聚乙二醇二缩水甘油醚用量10％(g/g)为例，指预处理100g绝干原料，聚乙二醇二缩水甘油醚用量为10g。

实施例1

一种提高碱性预处理木质纤维原料酶解得率的方法，步骤如下：

1)分别称取绝干玉米秸秆100g，分别用10％、20％、30％、40％(g/g，下同)氢氧化钠，于固液比1:10(g/mL，下同)，聚乙二醇二缩水甘油醚用量为10％(g/g，下同)，70℃下预处理3h。

2)预处理结束后，物料经水洗及过滤收集。聚乙氧基醚预处理玉米秸秆的主要成分分析见表1。

(3)分别称取纤维素绝干重为1.00g的上述用碱用量为10％、20％、30％、40％及聚乙二醇二缩水甘油醚用量为10％预处理的玉米秸秆于2个250mL水解瓶中，在每个水解瓶中加入1mol/L柠檬酸缓冲液2.5mL、酶用量为20FPU/g纤维素的纤维素酶和适量蒸馏水，使酶解体系中水分总体积为50mL，用玻棒将反应体系充分混匀后盖上盖子，于150rpm、50℃的恒温摇床中酶解72h。

酶解结束后，分别将水解物用离心机于10000rpm条件下离心5min，取上清液测定其中的葡萄糖浓度和纤维二糖浓度，并计算酶水解得率，数据取双平行试验平均值。其中，纤维素酶解得率(％)＝(水解液中葡萄糖浓度g/L×0.9+水解液中纤维二糖浓度g/L×0.95)×0.05÷(底物绝干重g×纤维素含量)×100％。式中：0.9为葡萄糖与纤维素的转换系数；0.95为纤维二糖与纤维素的转换系数；0.05为水解液体积，L。

聚乙氧基醚预处理玉米秸秆72h的主要成分分析以及酶解得率见表1。

表1聚乙氧基醚预处理玉米秸秆的主要成分及酶解得率

从表1结果表明，在相同聚乙二醇二缩水甘油醚用量下(10％，g/g)，随着预处理碱用量的增加，预处理玉米秸秆中葡聚糖含量增加，而木聚糖及酸不溶木质素含量显著降低，同时纤维素酶解得率显著提高。

实施例2

一种提高碱性预处理木质纤维原料酶解得率的方法，步骤如下：

1)分别称取绝干玉米秸秆100g，用10％(g/g)氢氧化钠，于固液比1:10(g/mL)，聚乙二醇二缩水甘油醚用量分别为5％、10％、20％、30％(g/g)，70℃下预处理3h。

2)预处理结束后，物料经水洗及过滤收集。聚乙氧基醚预处理玉米秸秆的主要成分分析见表2。

(3)分别称取纤维素绝干重为1.00g的上述用碱用量为10％，聚乙二醇二缩水甘油醚用量为5％、10％、20％、30％预处理的玉米秸秆于2个250mL水解瓶中，在每个水解瓶中加入1mol/L柠檬酸缓冲液2.5mL、酶用量为20FPU/g纤维素的纤维素酶和适量蒸馏水，使酶解体系中水分总体积为50mL，用玻棒将反应体系充分混匀后盖上盖子，于150rpm、50℃的恒温摇床中酶解72h。

酶解结束后，分别将水解物用离心机于10000rpm条件下离心5min，取上清液测定其中的葡萄糖浓度和纤维二糖浓度，并计算酶水解得率，数据取双平行试验平均值。聚乙氧基醚预处理玉米秸秆72h的主要成分分析以及酶解得率见表2。

表2聚乙氧基醚预处理玉米秸秆的主要成分及酶解得率

从表2结果表明，在相同碱用量下(10％，g/g)，随着聚乙二醇二缩水甘油醚用量的增加，预处理玉米秸秆中酸不溶木质素含量逐渐增加，预处理物料酶解得率逐渐升高。当聚乙二醇二缩水甘油醚用量为10％时，酶解得率升高至69.07％。进一步增加聚乙二醇二缩水甘油醚用量，酶解得率未呈现显著的提高。

实施例3

一种提高碱性预处理木质纤维原料酶解得率的方法，纤维素酶吸附情况试验，具体步骤如下：

1)称取100g绝干玉米秸秆，于碱用量10％(g/g)，固液比为1:10(g/mL)，聚乙二醇二缩水甘油醚用量10％(g/g)70℃下预处理3h，过滤收集预处理液及预处理物料。

2)预处理物料经水洗及过滤收集，用于纤维素酶解操作。

3)分别称取纤维素绝干重为1.00g的上述用碱用量为10％，聚乙二醇二缩水甘油醚用量为10％预处理的玉米秸秆于2个250mL水解瓶中，在每个水解瓶中加入1mol/L柠檬酸缓冲液2.5mL、酶用量为20FPU/g纤维素的纤维素酶和适量蒸馏水，使酶解体系中水分总体积为50mL，用玻棒将反应体系充分混匀后盖上盖子，于150rpm、50℃的恒温摇床中酶解72h。

4)在酶解过程中，分别于3h、6h、12h、24h、48h、72h取样，用离心机于10000rpm条件下离心5min，取上清液测定其中游离酶蛋白的浓度，并计算相对酶蛋白含量，数据取双平行试验平均值。其中，游离酶蛋白浓度(％)＝(上清液中酶蛋白浓度g/L)÷(酶解体系中添加的总酶蛋白浓度g/L)×100％。

以与处理中未添加聚乙二醇二缩水甘油醚为对照，进行同步试验。结果如图1所示，表明在试验样的酶解过程中，酶解上清液中游离酶蛋白浓度呈现先下降后上升的趋势。酶解3h时，游离酶蛋白含量为总酶蛋白含量的57.1％。当酶解进行24h后，游离酶蛋白含量下降至34.7％。酶解72h后，酶解上清液中游离酶蛋白浓度为66.3％。在对照样的酶解过程中，酶解上清液中游离酶蛋白浓度同样呈现先下降后上升的趋势。酶解3h时，游离酶蛋白含量为总酶蛋白含量的39.8％，远低于试验样3h酶解上清液中的游离酶蛋白含量(57.1％)。酶解72h后，对照样的上清液中游离酶蛋白浓度为29.59％，同样低于试验样72h酶解上清液中的游离酶蛋白含量(66.3％)。说明添加聚乙二醇二缩水甘油醚共预处理降低了预处理物料对纤维素酶的非特异性吸附。

对比例1

一种提高碱性预处理木质纤维原料酶解得率的方法，同实施例1，但在碱性与处理时不添加聚乙二醇二缩水甘油醚，具体步骤如下：

1)分别称取绝干玉米秸秆100g，分别用10％、20％、30％、40％(g/g)氢氧化钠，于固液比1:10(g/mL)，70℃下预处理3h。

2)预处理结束后，物料经水洗及过滤收集。预处理玉米秸秆的主要成分分析见表3。

3)分别称取纤维素绝干重为1.00g的上述用碱用量为10％、20％、30％、40％(g/g)预处理的玉米秸秆于2个250mL水解瓶中，在每个水解瓶中加入1mol/L柠檬酸缓冲液2.5mL、酶用量为20FPU/g纤维素的纤维素酶和适量蒸馏水，使酶解体系中水分总体积为50mL，用玻棒将反应体系充分混匀后盖上盖子，于150rpm、50℃的恒温摇床中酶解72h。

酶解结束后，分别将水解物用离心机于10000rpm条件下离心5min，取上清液测定其中的葡萄糖浓度和纤维二糖浓度，并计算酶水解得率，数据取双平行试验平均值，结果如表3所示。

表3未添加聚乙氧基醚预处理玉米秸秆的主要成分及酶解得率

表3结果表明，随着预处理碱用量的增加，碱预处理玉米秸秆中葡聚糖含量也随之增加，而木聚糖及酸不溶木质素含量随之降低。与实施例1的结果相比，在相同碱用量下(10％)，实施例1中酸不溶木质素含量为12.59％(表1)，高于本实施例中酸不溶木质素含量(9.98％)。另外，在相同预处理碱用量下，本实施例的酶解得率均低于实施例1的酶解得率，在预处理碱用量为10％下，实施例1的酶解得率为71.26％(表1)，比本实施例的酶解得率(50.99％)提高了39.75％。

对比例2

一种提高碱性预处理木质纤维原料酶解得率的方法，为添加木质素基表面活性剂的常规碱预处理玉米秸秆酶水解方法，具体步骤如下：

1)称取100g绝干玉米秸秆，于碱用量10％(g/g)，固液比为1:10(g/mL)，70℃下预处理3h，过滤收集预处理液及预处理物料。

2)预处理物料经水洗及过滤收集，用于纤维素酶解操作。

3)添加浓硫酸，将预处理液pH调至4.0以下，沉淀碱木质素，并洗涤、过滤，用于木质素基表面活性剂的制备。

4)称取20g绝干碱木质素，于碱用量40％(g/g)，聚乙二醇二缩水甘油醚用量200％(g/g)，固液比1:10(g/mL)，于70℃下反应2h。反应结束后，将pH调至4.0以下，沉淀未修饰木质素。离心后取上清液通过超滤分离、浓缩修饰后的木质素基表面活性剂(终浓度50g/L)，用于后续酶水解添加实验。

5)称取纤维素绝干重为1.00g的碱用量为10％(g/g)预处理的玉米秸秆于2个250mL水解瓶中，在每个水解瓶中加入上述木质素基表面活性剂0.5mL、1mol/L柠檬酸缓冲液2.5mL、酶用量为20FPU/g纤维素的纤维素酶和适量蒸馏水，使酶解体系中水分总体积为50mL，用玻棒将反应体系充分混匀后盖上盖子，于150rpm、50℃的恒温摇床中酶解72h。

酶解结束后，分别将水解物用离心机于10000rpm条件下离心5min，取上清液测定其中的葡萄糖浓度和纤维二糖浓度，并计算酶水解得率，数据取双平行试验平均值。

结果表明，本对比例添加木质素基表面活性剂的常规碱预处理玉米秸秆72h酶解得率为69.08％，比对比例1未添加木质素基表面活性剂的常规碱预处理物料酶水解得率(50.99％)提高了35.48％，但低于本专利的方法(实施例1)的酶水解得率(71.26％)。

可见，本方法可以显著促进酶水解，提高酶水解得率，预处理工艺条件简单，更具有实际操作价值。