专利名称：坛紫菜良种选育方法
技术领域：
本发明涉及利用人工诱变、体细胞克隆和单性生殖等技术选育坛紫菜良种，属于海藻的栽培。
背景技术：
紫菜是一种营养价值很高的海藻食品，作为海洋健康食品，深受中国、日本、朝鲜以及东南亚各国人民的喜爱。紫菜养殖的成本低、周期短、产值高，是我国沿海一项很重要的海水养殖产业。在我国被大规模养殖的紫菜有南方的坛紫菜和北方的条斑紫菜。我国紫菜产量的80％为坛紫菜，条斑紫菜约占20％。近十多年来，我国的条斑紫菜养殖由于引进了日本的优良养殖品种和先进加工技术，产量和产值取得了长足的发展，大部份产品被销往国外市场。坛紫菜的年产量虽占全国紫菜产量的八成左右，但它的产值却不及条斑紫菜。所以，培育出适合栽培的良种对提高我国坛紫菜养殖业的经济效益和扩大养殖规模已十分迫切。
紫菜育种主要在日本和中国开展。日本对主要养殖种条斑紫菜进行了大量的良种选育工作。上世纪六十年代，日本开展了条斑紫菜的大田(海区)良种选育工作，并成功得选出细长型晚成熟的优良品种；七十年代，新品种在全国推广，使年产量大飞跃；同时，他们又从紫菜养殖群体中分离出自然色素突变体。到八十年代中期，通过不同自然色素突变体相互杂交获得了良种。八十年代初，我国初步开展了条斑紫菜的大田品种选育；另一方面，我国的条斑紫菜生产，开始引进日本的资金、优良品系和先进加工技术，使产量和产值十年上了一个新台阶。坛紫菜是我国的特有品种，具有个体大，生长快，产量高等特点。虽然，对坛紫菜的基本生物学、生活史、全人工采苗、自由丝状体采苗和养殖技术进行了大量的研究工作(福建省水产局，坛紫菜人工养殖)，1979，福建人民出版社)；但坛紫菜的品种选育工作几乎没有开展过，目前生产上使用的养殖品种仍为野生种。
坛紫菜的生活史可划分为微型的丝状体和大型的叶状体二个阶段，其叶状体被大规模养殖并被制成商品供食用。丝状体的核相为二倍体世代(2n)，经过几个生长发育阶段，最终成熟放出壳孢子(2n)，壳孢子萌发后发育成单倍体的叶状体(n)。绝大部份叶状体为雌雄异体，长大成熟后，雄性叶状体产生精子囊器，放散的精子(n)随水飘至并附着在雌性叶状体上，与其成熟的果胞(n)受精。受精的果胞(2n)发育成果胞子囊，成熟放散出来的果胞子(2n)钻入贝壳或在海水中发育成丝状体(2n)。坛紫菜叶状体不能放散单孢子进行无性繁殖。(曾呈奎、王素娟、刘思俭等编，1985。海藻栽培学，上海科技出版社)。由于坛紫菜叶状体为雌雄异体，又没有单孢子无性繁殖途径。另外，它的细胞减数分裂到底是发生在壳孢子放散前还是放散后的萌发阶段没有搞清楚，遗传育种工作很困难。我们对坛紫菜叶状体的单离细胞分离和培养，叶状体细胞分化，突变体分离和杂交等进行了十多年的基础遗传研究(王素娟、张小平、徐云龙等。“坛紫菜营养细胞和原生质体培养的研究”，海洋与湖沼.1986，17(3)217-221；Yan X H，Wang S J.Studies on the development and differentiationof the somatic cells from Porphyra spp.(Rhodophyta).Marine Sciences.1990.3(2)195-208；严兴洪，2003.国家863重大专项研究项目“坛紫菜良种选育技术”中期成果报告)，阐明了坛紫菜与雌雄同体的条斑紫菜一样，减数分裂发生在壳孢子萌发后的第一和第二次细胞分裂；减数分裂后产生的4个细胞在遗传上存在一定的差异，这四个细胞继续分裂发育成大叶状体。所以，一个由壳孢子发育而来的坛紫菜叶状体在遗传上属嵌合体。
紫菜的体细胞分离工具酶，营养细胞苗种生产应用，紫菜纯系培养等有不少研究报告请参见唐延林 紫菜营养细胞和原生质体的分离和培养(山东海洋学院学报，1982，12(4)37-50)；方宗熙，戴继勋，唐延林等紫菜细的酶法分离和在水产养殖中的应用(海洋科学，1986，10(3)46-47；王素娟、张小平、徐云龙等坛紫菜营养细胞和原生质体培养的研究)(海洋与湖沼.1986，17(3)217-221)，以及相关专利报道，中国专利号分别为85104059，91107320，96116039和01132162。但国内外对坛紫菜良种选育技术没有专利报道。
本发明的目的利用现代生物技术，建立一套有效，快速，可靠的坛紫菜良种选育技术，以便选育出坛紫菜良种应用于生产，提高我国紫菜养殖业的经济效益和社会效益。
发明内容
选育步骤为(1)用自然的野生坛紫菜叶状体放散果孢子，使其萌发生长，以获取野生种自由丝状体；(2)从野生种自由丝状体放散出壳孢子，并将其培养成叶状体，然后用人工诱变剂对它们进行诱变处理，再培养；(3)用海洋细菌酶处理经诱变后的叶状体，分离出单离的细胞和原生质体，并把它们培养成叶状体；(4)依据良种选拔指标选拔出优良再生叶状体，并进行单株培养；(5)对被选拔出来的优良叶状体的主要光合色素和色素蛋白以及活体吸收光谱进行定量和定性测定，以判断紫菜的生长和品质等性状的优劣和稳定性；(6)再次酶解优良叶状体以获得单离细胞和原生质体，并把它们培养成再生植株，利用单性生殖技术，获得二倍体的纯系丝状体；(7)当纯系丝状体成熟后，使其放出壳孢子，培养成F1代叶状体，并对其进行品质分析和遗传稳定性检验；
(8)将优良品系的自由丝状体粉碎后移植于贝壳内，培养成贝壳丝状体，然后，从贝壳丝状体采壳孢子于养殖网帘上，进行叶状体海区养殖生产性试验；(9)良种以自由丝状体形式保持在室内。
所述人工诱变剂为N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)；所述人工诱变剂也可是60Co-γ射线；所述海洋细菌酶的来源细菌为假单胞杆菌(Psuedomonas sp)；所述主要光合色素和色素蛋白为叶绿素a、藻红蛋白和藻蓝蛋白。
与现有大田紫菜良种选育技术相比，本发明具有下列优点(1)品系选育面广，可获得的优良品系量多。由于使用了人工诱变技术，使变异细胞在数量和类型上大幅度地增加，在它们的细胞再生体中，可获得大量具不同优良性状的变异体，用于进一步良种选拔。(2)选育良种速度快。由于利用了体细胞快繁技术，在室内一年可进行数次的叶状体培养和优良品系选拔，克服了大田紫菜良种选育中由于季节限制一年只能获得一次叶状体的不足之处，从而可在较短时间内(2-3年)获得可被生产使用的优良品系，而传统大田良种选育法效率低，周期长(5年以上)。(3)获得的良种为遗传型纯系，优良性状十分稳定。鉴于坛紫菜的减数分裂发生在壳孢子萌发后的第一和第二次细胞分裂；减数分裂后产生的4个细胞在遗传上存在一定的差异，这4个细胞继续分裂发育成遗传上属嵌合的大叶状体。本发明通过连续二次体细胞克隆繁殖来分离优良品系，确保了获得的品系为真正遗传意义上的纯系。分离到的良种纯系因为丝状体(二倍体)其等位基因完全纯合，所以在它们的叶状体(单倍体)世代中，个体遗传背景完全相同，在相同的生长环境中，个体差异变得很小，不会出现优良性状的分离，确保了良种的产量和质量。用传统的大田良种选育技术获得的条班紫菜良种，由于往往不是纯系，在子代叶状体世代中，经常出现优良性状的分离和丢失，需要一面使用一面再选拔，否则，较难维持良种的优良性状。(4)本发明使用的海洋细菌酶其分离紫菜单个细胞和原生质体的效果远比市场上使用的海螺酶好，并且酶对细胞毒性低，分离的细胞成活率高，确保了经人工诱变获得的变异细胞被有效地分离和培养成植株，加快了良种的筛选。
具体实施例方式
1.采集自然生长的野生坛紫菜叶状体，除杂藻后，清洗干净，并凉干，脱水70％左右。重新把叶状体浸泡于消毒海水，收集由叶状体放散的果孢子，并将它们培养成自由丝状体。
2.从野生种自由丝状体放散壳孢子，并将其培养成叶状体，然后对它们进行人工诱变处理。诱变剂选用MNNG，处理浓度为10-25ppm，处理时间30min，也可使用60Co-γ射线处理，照射剂量为500-1500Gy。经过处理的叶状体冲气培养2周后，用于酶解，分离细胞。
3.用于分离细胞的叶状体，用消毒海水清洗3-5次后，切成碎片(2mm2左右)，投入酶液中酶解。酶液含0.5％海洋细菌酶，0.8M甘露醇，60％自然海水和40％蒸馏水。酶解条件26℃，1.5h，黑暗。然后，用200目的筛绢把单离的细胞和原生质体过滤出来，用离心法(1000rpm，5min)先把酶液除去，再用比重为1.035的海水悬浮细胞并再次离心(1000rpm，5min)，依次连续离心洗涤3次后，把所得细胞置MES培养基进行液体培养。
4.单离细胞和原生质体的培养和植株再生条件20℃，第1周的光强为1000lux(12L∶12D)，第2周以后，光强增至3000lux(12L∶12D)。当细胞发育成小叶状体后，把它们从培养皿里移至培养瓶中冲气培养，温度不变，同时光强增至5000lux(12L∶12D)。当再生叶状体体长达到1cm时，选出具优良性状的变异体，进行单个培养。另外，对被选拔出来的优良再生叶状体进行下列主要光合色素和色素蛋白----叶绿素a，藻红蛋白和藻蓝蛋白的含量测定，因为这三种色素和蛋白的含量高低以及它们之间的比决定了紫菜的品质和生长；同时，测定活体吸收光谱，测定游离氨基酸和总蛋白质的含量，测定藻体的厚度和光泽。
5.当被选拔出来的优良再生叶状体达到一定的大小，再次依照上述方法酶解出单离细胞，并把它们培养成再生叶状体。当从小单株培养的优良叶状体快成熟时，利用单性生殖，获得二倍体的丝状体纯系。
6.当纯系丝状体成熟后，使其放出壳孢子，培养成F1代叶状体，并对其进行品质分析和遗传稳定性检验。
7.将性状稳定的优良品系的自由丝状体粉碎，并移植于贝壳内，培养成贝壳丝状体；然后，用贝壳丝状体采壳孢子于养殖网帘上，进行海区叶状体养殖生产性试验；对海上养殖的叶状体再次进行生长，品质，抗病性等综合性分析，选拔出优良品系。
8.把获得的良种自由丝状体培养在15℃，300lux(12L∶12D)条件下保存。
权利要求
1.坛紫菜良种选育方法，其特征在于选育步骤为(1)用自然的野生坛紫菜叶状体放散果孢子，使其萌发生长，以获取野生种自由丝状体；(2)从野生种自由丝状体放散出壳孢子，并将其培养成叶状体，然后用人工诱变剂对它们进行诱变处理，再培养；(3)用海洋细菌酶处理经诱变后的叶状体，分离出单离的细胞和原生质体，并把它们培养成叶状体；(4)依据良种选拔指标选拔出优良再生叶状体，并进行单株培养；(5)对被选拔出来的优良叶状体的主要光合色素和色素蛋白以及活体吸收光谱进行定量和定性测定，以判断紫菜的生长和品质等性状的优劣和稳定性；(6)再次酶解优良叶状体以获得单离细胞和原生质体，并把它们培养成再生植株，利用单性生殖技术，获得二倍体的纯系丝状体；(7)当纯系丝状体成熟后，使其放出壳孢子，培养成F1代叶状体，并对其进行品质分析和遗传稳定性检验；(8)将优良品系的自由丝状体粉碎后移植于贝壳内，培养成贝壳丝状体，然后，从贝壳丝状体采壳孢子于养殖网帘上，进行叶状体海区养殖生产性试验；(9)良种以自由丝状体形式保持在室内。
2.根据权利要求1所述的坛紫菜良种选育方法，其特征在于所述人工诱变剂为N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍；
3.根据权利要求1所述的坛紫菜良种选育方法，其特征在于所述人工诱变剂也可是60Co-γ射线；
4.根据权利要求1所述的坛紫菜良种选育方法，其特征在于所述海洋细菌酶的来源细菌为假单胞杆菌；
5.根据权利要求1所述的坛紫菜良种选育方法，其特征在于所述主要光合色素和色素蛋白为叶绿素a、藻红蛋白和藻蓝蛋白；
6.根据权利要求1所述的技术方法，其特征在于所述选拔优良叶状体的主要指标叶状体的体型，颜色，生长速度和成熟早晚；
7.根据权利要求1所述的技术方法，其特征在于所述品质分析内容为游离氨基酸和总蛋白质的含量，藻体厚度，干品的色泽。
全文摘要
本发明涉及利用人工诱变、体细胞克隆和单性生殖等选育坛紫菜良种，属于海藻的栽培。通过化学或物理人工诱变法获得坛紫菜的变异细胞，用生物工具酶将变异细胞单个分离并将其培养成完整叶状体。依据叶状体的主要光合色素和色素蛋白质含量的高低和它们相互间的比值，游离氨基酸含量高低，生长速度，藻体的厚薄和色泽等指标，筛选出优良突变体叶状体，并将它们再次酶解获得单离体细胞进行再生培养。将获得的幼小叶状体单个分离，培养至大叶状体，利用单性生殖获得纯系丝状体。优良品系的纯系丝状体的F1代叶状体，其优良性状经遗传稳定性分析和综合品质测定后，对优良品系的纯系自由丝状体进行扩增培养，并移植于贝壳内使之成为贝壳丝状体，随后，进行用贝壳丝状体进行大田采苗和养殖试验。经大田试验证明为性状稳定的优良品系，以自由丝状体的方式进行长期保存和推广应用。本发明与现有紫菜大田良种选育技术相比，具良种选育速度快，选育面广，获得品系纯，优良性状稳定，良种保存和使用方便等优点。
文档编号A01G33/00GK1565168SQ0314144
公开日2005年1月19日 申请日期2003年7月8日 优先权日2003年7月8日
发明者严兴洪 申请人:上海水产大学