二噁英类物质排除促进剂的制作方法

专利名称：二噁英类物质排除促进剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于排除二噁英类物质(dioxin)的促进剂，其包含作为活性成分的微生物，所述微生物具有将被无意中吸收入体内并在体内蓄积的二噁英类物质排除至体外的活性。
由于Theo Colborn等在Our Stolen Future(日本题目Ubawareshimirai，1996年初版发行，2001年修订)中显示了内分泌扰乱化学物质(Endocrine disrupting chemicals)(所谓环境激素)的存在，其已经成为全世界社会关注的焦点。已知大量化学物质均疑有内分泌扰乱作用，日本于1999年7月公布的“二噁英类物质特别对策法”(“LawConcerning Special Measures against Dioxins”)中确定了包括多氯化二苯并对二噁英类物质(PCDD)，多氯化二苯并呋喃(PCDF)和共平面多氯联苯(cPCB)在内的67种化学物质。二噁英类物质的毒性很高。已知的急性毒性包括皮炎、肝病、神经病、免疫毒性等，而可疑的慢性毒性包括致畸性、胚胎毒性、致癌性、异物代谢酶诱导等。据估计人在日常生活中暴露于二噁英类物质的量的水平为约2.3pg-TEQ(毒性等效量)，其远低于表现出急性毒性的量。然而，由于已知二噁英类物质在活体的脂肪组织中残留和蓄积，故其存在以低于有毒活性浓度的浓度发挥内部合成激素的作用。该活性是二噁英类物质被称为环境激素的原因。
大部分二噁英类物质经无意的生产过程而被释放至环境中，由于其不燃性和绝缘性，多氯联苯(PCB)被大量用于电器等中，cPCB作为副产品而包含于其中，最终，即使在1971年被禁止生产后，cPCB仍持续释放至环境中。二噁英类物质在环境中的分解非常缓慢，其在分解期间可被多种生物体的活体摄入并在生物链内生物浓聚。人类经由摄入污染的生物体作为食物而不可避免的暴露于其中。
关于二噁英类物质在活体中的吸收，代谢和排出尚存在很多不清楚的方面。由于二噁英类物质是油溶性的，其在摄入后如上述被转移至脂肪组织。特别是在肝中，通过信号转导通路经受体诱导特定基因的表达。尤其已知(当细胞色素P450蛋白表达时)二噁英类物质可被其酶活性羟基化或还原性脱卤素化。因此，认为二噁英类物质由于所述代谢增强其水溶性以及通过分泌至胆汁而被排除至体外。
另一方面，微生物例如用于发酵乳的乳酸菌以及用于发酵大豆(纳豆)的枯草杆菌已被广泛应用于食品和饲料中，而且已知通过其细胞和发酵产品给宿主带来很多有益作用。乳酸菌，枯草杆菌和双歧杆菌通过直接或间接作用于肠内菌丛以及清除有害细菌特别有助于宿主健康。此外，关于不与肠内菌丛相关的活性，已知作为发酵产品的肽具有抗高血压活性。乳酸菌对肝功能产生有益作用的发明包括降低肝胆固醇的乳酸菌(JP-A-7-250670)，酶处理的米糠乳酸菌产品，其可以缓解由应激导致的肝病(JP-A-9-132533)，包含胚芽乳酸杆菌和精氨酸组合的肠道输液剂(JP-A-11-304936)等。然而，尚未报道与将环境污染物清除至体外相关的微生物。
本发明的目的在于提供通过用于排除二噁英类物质的促进剂，其包括作为活性成分的微生物，所述微生物具有促进体内例如肝内蓄积的二噁英类物质排除至体外的活性。由于二噁英类物质是从食品、空气、水、土壤等中在无意识状态下而被摄取的，故其摄入是很难避免的，故此在人类的日常进食中使用所述活性成分和作为日常用于食用家畜的饲料添加剂是很重要的。
发明概述本发明涉及如下内容(1)用于排除二噁英类物质的促进剂，其包含作为活性成分的微生物，所述微生物具有促进体内二噁英类物质排除至体外的活性。
(2)根据(1)的促进剂，其中所述微生物是乳酸菌。
(3)根据(1)的促进剂，其中所述微生物是非病原性杆菌。
(4)一种促进排除二噁英类物质的方法，其包括对人类或动物施用具有促进体内二噁英类物质排除至体外的活性的微生物。
(5)根据(4)的方法，其中所述微生物是乳酸菌。
(6)根据(4)的方法，其中所述微生物是非病原性杆菌。
(7)具有促进体内二噁英类物质排除至体外的活性的微生物用于促进排除二噁英类物质的用途。
(8)具有促进体内二噁英类物质排除至体外的活性的微生物用于制备二噁英类物质排除促进剂的用途。
(9)根据(7)或(8)的用途，其中所述微生物是乳酸菌。
(10)根据(7)或(8)的用途，其中所述微生物是非病原性杆菌。
(11)一种生理功能性食品，其包含根据(1)-(3)任一项的促进剂。
(12)根据(1)-(3)任一项的促进剂用于制备排除二噁英类物质的生理功能性食品的用途。
附图简述


图1.显示了口服PCBI26后大鼠肝脏的电子顺磁共振光谱。
图2.显示了口服cPCB后典型的电子顺磁共振信号。
图3.显示了施用样品60日后肝组织的g＝2.49信号的比较。
图4.显示了施用样品60日后肝组织内PCBI26的浓度。
最佳实施方式本发明的发明人已经发现由二噁英类物质导致的肝脏细胞色素P450(其被认为能够促进二噁英类物质代谢性排除)的变性可通过口服一种微生物而得以缓解，从而促进体内二噁英类物质的排除，由此完成了本发明。
根据本发明的具有促进体内二噁英类物质排除至体外的活性的微生物(以下简称为“本发明的微生物”)是(1)可施用于已经给予了二噁英类物质的大鼠的微生物，和(2)通过在施用微生物一段预定时期之后在肝组织的电子顺磁共振(EPR)测定中测定异常P450分子的抑制而选出的微生物。
因为根据本发明的用于排除二噁英类物质的促进剂(以下简称为“本发明的促进剂”)能够促进体内蓄积的二噁英类物质的排除，故与预防剂例如二噁英类物质的吸收抑制剂相比即使是在暴露后的摄取中其效果仍预期是有益的。
二噁英类物质并不是特别受限制的，其包括一般被分类为二噁英类物质的那些物质。具体实例包括多氯化二苯并对二噁英类物质(PCDD)、多氯化二苯并呋喃(PCDF)、共平面多氯联苯(cPCB)、其异构体等。
Dr.Morita副教授(麻布大学兽医学部)发现在摄取二噁英类物质的大鼠的细胞色素P450蛋白质中，所述酶活性可能被蛋白质分子自身中组氨酸与参与酶活性的配位的第6基因座的配位所抑制(Hidetoshi Morita等，98th Convention of Japanese Society ofAnimal Science，X30-21，2001)。该变化可通过EPR测定法进行监测。
EPR测定法也被称为电子自旋共振(ESR)测定法。可通过利用由电子所携带磁矩的运动检测物质中电子的状态和包含电子的环境的状态。由于可测定的物质必须具有不成对电子，故此测定的选择性高。此外，由于测定在1T或更低的恒定磁场和0.1mT或更低的微波振荡磁场中实施，故可将试样暴露于低能量下且可实现无破坏性测定。ESR测定法的原理如下当具有不成对电子的的原子或分子被置于磁场内时，电子进入低能轨道。当施加高频微波振荡磁场时，不成对电子迁移至高能轨道。根据微波的吸收可检测轨道间的迁移。此时，g-值是显示检测到共振的磁场的因子。g-值指示测定图上的位置且其是检测要测定的分子的电子状态的重要因素。
当用作为实验动物的大鼠肝实施EPR测定时，可在g＝2.40的位置观测到包含在细胞色素P450蛋白中的铁原子的共振吸收。当对大鼠施用二噁英类物质时，除正常共振吸收外，在g＝2.49的位置出现非治疗情况下不能检测到的异常共振吸收的信号。由于异常信号的强度根据施用的二噁英类物质的量的增加而变得更高，故其可作为显示污染程度的活体指数。
本发明的微生物可以是任何微生物，只要其是能在EPR测定中将源自二噁英类物质的g＝2.49处的异常信号正常化的微生物即可。具体实例包括细菌，酵母等。
本发明的促进剂优选包含微生物以便当其施用于人或动物时能提供5×109个细胞/kg体重或更多的有效细胞数量。
本发明的微生物根据微生物特性可用作多种发酵食品。
当微生物是乳酸菌时，其可采用乳制品例如发酵乳、酸奶酪、乳酸饮料以及酸乳等形式进行使用，所述各乳制品可通过适当地加入糖、酸味剂、调味剂等而转换为易于使用的形式。此外，只要包含有效的细胞数量，可将有效微生物冻干以形成微生物粉剂或被压片以形成片剂从而使其易于口服。
只要包含有效细胞数量的微生物，除液体发酵乳之外可使用固体发酵产品例如发酵大豆(纳豆)和米麦芽。因此，预期所述产品用于日常摄取不存在困难。
此外，产品可包括在药物、食品、饲料等的制备中可接受的载体。例如，可采用水；糖例如蔗糖、山梨糖醇和果糖；二醇例如聚乙二醇和丙二醇；油例如芝麻油、橄榄油和豆油；防腐剂例如对羟基苯甲酸酯；调味剂例如草莓调味剂和薄荷等制备液体制品例如糖浆。此外，片剂、粉剂和颗粒剂可使用赋形剂例如乳糖、葡萄糖、蔗糖和甘露醇；崩解剂例如淀粉和海藻酸钠；润滑剂例如硬脂酸镁和滑石；粘合剂例如聚乙烯醇、羟丙纤维素和明胶；表面活性剂例如脂肪酸酯；增塑剂例如甘油等而进行制备。
此外，本发明的微生物的破碎细胞或细胞提取物可用作本发明的促进剂的有效成分，只要其具有根据本发明的促进二噁英类物质排除的活性。
本发明的微生物可以是活细胞或死细胞，优选是活细胞。
本发明的促进剂可单独或作为其它食品、饮料、饲料等的添加剂而施用于人或非人类动物(牲畜例如牛，猪和鸡，饲养的鱼等)。
剂量依据要针对的动物种类、其症状等而改变。通常，其一般以106个细胞/kg体重或更高，优选5～109个细胞/kg体重或更高每日施用一次或多次。剂量上限并非特别受限。
以所述方式选择的微生物的实例包括下述乳酸菌。该乳酸菌仅为示例，其范围并不限于乳酸菌菌株。
乳酸菌乳酸杆菌(Lactobacillus sp.)CP3012(FERM BP-8052)形态学特性1)形状短杆2)运动性无3)孢子无4)革兰氏染色阳性。
培养特性培养条件石蕊牛奶，30℃1)凝固性无2)液化作用无3)酸产生有
4)生存pH范围pH 5-75)生存温度15-45℃。
生理特性1)过氧化氢酶阴性2)吲哚产生阴性3)硝酸盐还原作用阴性4)需氧性兼性厌氧5)15℃生长有6)反硝化作用阴性7)MR试验阳性8)VP试验阴性9)硫化氢产生阴性10)淀粉水解作用阴性11)枸橼酸盐同化作用(Koser)阳性，(Christensen)阴性12)硝酸盐同化作用阴性13)铵盐同化作用阴性14)色素产生阴性15)脲酶活性阴性16)氧化酶活性阴性17)O-F试验需氧和厌氧均为阳性18)多种糖的酸产生试验结果(以铵-糖培养基(ASS；Smith，N.R.，Gordon，R.E.and Clark，F.E.(1952)，Aerobic sporeforming bacteria；Monograph，No.16，Washington，D.C.U.S.Dep.Agriculture)作为基础培养基进行好氧培养)如下葡萄糖+ 木糖-乳糖+海藻糖+甘露糖+ 肌醇-果糖+甘露醇+半乳糖+ 山梨糖醇-蔗糖+淀粉-阿拉伯糖+甘油-
麦芽糖+19)多种糖类的产气结果如下葡萄糖- 木糖-乳糖- 海藻糖-甘露糖- 肌醇-果糖- 甘露醇-半乳糖- 山梨糖醇-蔗糖- 淀粉-阿拉伯糖- 甘油-麦芽糖-乳酸菌(乳酸杆菌CP3C12)已于2002年5月27日保藏于国际专利生物保藏单位，独立行政法人产业技术综合技术研究所特许生物保藏中心(International Patent Organism Depositary，NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology)(AISTTsukuba Central 6，1-1，Higashi l-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566 Japan)，保藏号为FERM BP-8052。
以所述方式选择的微生物的实例包括非病原性杆菌例如枯草杆菌(Bacillus Subtilis)c-3102。枯草杆菌c-3102已于1986年6月28日保藏于通商产业省工业技术院微生物工业技术研究所(Fermentation Research Institute，Agency of Industrial Scienceand Technology)(1-3，Higashi l-chome，Yatabe-machi，Tsukuba-gun，Ibaraki-ken，305 Japan)(现国际专利生物保藏单位，独立行政法人产业技术综合技术研究所特许生物保藏中心(International Patent Or ganism Depositary，National Instituteof Advanced Industrial Science and Technology)(AIST TsukubaCentral 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566 Japan))，其保藏号为FERM BP-1096。该非病原性杆菌仅为一个示例，范围并不限于非病原性杆菌菌株。
实施例构建动物模型制备已经施用了PCB 126(3，3′，4，4′，5-五氯联苯)的大鼠作为试验动物。大鼠为6周龄Sprangue-Dawley(购自Nippon CharlesRiver)。顺应培养约1周后，对其强制施用包含足够浓度的PCB 126(Wellington Laboratories制备；纯度99.99％或更高)的溶液，所述PCB 126溶于商购玉米油(Hayashi Chemicals制备)以便在经过探头的相同量的玉米油中的cPCB的量为0(对照)、0.3、3、30或100μg/kg体重(bw)。施用24小时后用乙醚无痛处死施用PCB的大鼠。取肝，然后用1.15％KCl缓冲液充分灌注。然后，通过EPR测定法分析组织碎片。
EPR测定EPR测定仪器是JES-TE300(JEOL制)，根据厂商说明书在下述条件下实施测定温度 77K频率 9.11GHz功率 10mW扫描时间 4分钟调幅 0.32mT时间常数 0.3秒场幅 300±100mT
图1显示了已施用了cPCB的大鼠肝组织碎片的EPR光谱图。在波谱中，g＝2.40处的信号是来自正常细胞色素P450中血红素铁的峰值。出现了在前的特异性峰值，如g＝2.49处信号所示。可将其理解为其强度依赖于给药量而发生变化。
数值化为了将g＝2.40和g＝2.49处的信号强度数据表示为数值，因此实施标准化。将图2中用C表示的来自锰原子的信号强度作为标准，图2是显示典型信号图的示意图。已知肝内所含锰原子的量几乎不受饮食中锰原子的量的影响[Sakurai等，Biochem.Biophys.Acta，841，208-214(1985)]。因此，将峰值C中最大值和最小值间的差异作为HC并确定HC的中点Hcen。用线段将连接Hcen和磁场(图中E所示)中低于信号A的一侧的“30个采样点的平均值”的点连在一起，将所述线段上自g＝2.49和g＝2.40处峰值的垂直线的长度分别作为HA和HB。为了将测定中所用样品的重量纳入考虑范围，故用HA和HB除以HC，由此将g＝2.49处信号的强度表示为HA/HC而将g＝2.40处的信号强度表示为HB/HC。
微生物菌株将乳酸杆菌菌株CP 3012(FERM BP-8052)和枯草杆菌c-3102(FERMBP-1096)分别用作乳酸菌和枯草杆菌。枯草杆菌c-3102已于1986年6月28日保藏于通商产业省工业技术院微生物工业技术研究所(1-3，Higashi l-chome，Yatabe-machi，Tsukuba-gun，Ibaraki-ken，305 Japan)(现国际专利生物保藏单位，独立行政法人产业技术综合技术研究所特许生物保藏中心(AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashil-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566 Japan))，其保藏号为FERM BP-1096。
微生物培养为了微生物的纯粹培养，可使用一般方法和适于各个所用微生物的培养基。当微生物为乳酸杆菌属乳酸菌时，使用根据厂商说明书用MRS培养基(Difco制)制备的培养基。当微生物为枯草杆菌时，使用胰胨豆胨培养基(BBL制)。将乳酸杆菌属乳酸菌于37℃在厌氧条件下静置培养，而枯草杆菌于37℃振荡培养。
在所有培养中，采用血细胞计数器(托马计数器，KayagakiIrikakogyo Ltd.制)按照厂商说明书测定细胞数量。
制备施用的试样1.发酵乳样试样将乳、脱脂乳、还原脱脂奶等在达到98℃的温度下灭菌。冷却至37℃后，用搅棒等搅拌，逐步加入食品添加剂级乳酸(Wako PureChemical Ind.，Ltd.，的122-01936，等)，将pH调整至4.5。采用上述匀浆器进行相似的均质化，产生发酵乳样试样。
2.添加了细胞的发酵乳样试样将每种分别培养的上述微生物悬浮于上述发酵的乳样试样中以便在添加了细胞的发酵乳样试样中产生1～109个细胞/ml的细胞浓度。给药试验对上述已给予了PCB 126的大鼠施用包含微生物的试样60日。剂量为5ml/kg体重且施用至少在平日(5日，周一至周五)持续。施用期结束后，无痛处死大鼠，然后取肝。以1.15％KCl缓冲液充分灌注后，通过EPR测定法分析组织，测定cPCB浓度。
信号强度评估图3中显示了如上述信号强度标准化后的EPR测定结果。在通过统计学处理证实存在显著性差异时，根据显著性水平标以记号“#”(P＜0.10)或“*”(P＜0.05)。乳酸菌，乳酸杆菌CP3012(FERM BP-8052)，和枯草杆菌c-3102(FERM BP-1096)表现出高于对照处理组的功效。
测定肝组织中cPCB浓度在将2g肝组织置于研钵中并用无水硫酸钠(PCB分析用，KantoEagaku Corporation制)将其均质化后，将所得混合物置于圆柱形滤纸中，采用200ml乙醚和己烷(均为残留农药试验用，Kanto KagakuCorporation制)的比例为3∶1的混合液进行Soxhlet提取7小时。提取液在KD浓缩器中浓缩至10ml或更少的体积。在该浓度中，加入50ml用乙醇(残留农药试验用，Kanto Kagaku Cor poration制)作为溶剂的1N氢氧化钾(特级，Wako Pure Chemical Ind.，Ltd.制)和100μl C13重量标记的标准混合液(Wellington Laboratories制；将3，3″，4，4′-T4CB，3，3′，4，4′，5-PSCB，3，3′，4，4′，5，5′-H6CB用特级庚烷稀释，然后调整至60pg/μl)，然后在回流下，于100℃皂化1小时。内容液移至分液漏斗，在其中加入50ml己烷(同上)和50ml经己烷洗净的蒸馏水，然后振荡提取15分钟。回收有机溶剂层，用无水硫酸钠(同上)脱水，然后采用KD浓缩器在高纯度(99.99％)氮气流下将体积浓缩至5ml。将该浓缩物在活化硅胶柱中展开。将硅胶(Wako-gel S-1；Wako Pure Chemical Ind.，Ltd.制)于130℃加热3小时，将其1.5g悬浮于正己烷(同上)，然后湿式填充于内径10mm的玻璃柱中由此形成活化硅胶柱。采用正己烷以1滴/秒的流速实施展开。分取总体积150ml，该总体积和10ml浓硫酸(特级；WakoPure Chemical Ind.，Ltd.制)在分液漏斗中振荡，重复该操作直至硫酸染色消失。然后，用已经用己烷洗净的蒸馏水进行洗涤直至水层成为中性，用无水硫酸钠(同上)脱水，使用KD浓缩器将其再次浓缩至100μl或更少的体积，加入甲苯(二噁英类物质分析用，KantoKagaku Corporation制)使其体积为100μl。由此通过气相色谱质谱联用仪(GC-MS)分析所得样品。GC-MS采用MStation(JEOL制)联同SPB-Octyle(50cm×0.2mm×0.25μm；SUPELCO制)，通过HR-SIM法以8,000或更高的分辨率实施测定。
评估肝内cPCB浓度图4显示了通过肝组织GC-MS测定结果获得的cPCBI26浓度的比较。在通过统计学处理证实存在显著性差异时，根据显著性水平标以记号“***”(P＜0.001)。与ESR测定结果相同，乳酸菌，乳酸杆菌CP3012(FERM BP-8052)，和枯草杆菌c-3102(FERM BP-1096)表现出高于对照处理组的功效。
本申请基于2002年5月31日提交的日本申请2002-160055，所述日本申请全文引入此处作用参考。
虽然参照其具体实施方式
对本发明进行了详细的描述，但对本领域技术人员来说在不背离本发明的精神和范围的情况下对其进行多种变化和修改是显而易见的。本文所引用的全部参考文件均为全文引入。
工业实用性因为本发明的促进剂恢复了先前被二噁英类物质变性并失活的细胞色素P450蛋白的作用并促进其自发排泄作用，故本发明的促进剂可用于食品，饮料等。此外，可通过在饲养中饲喂所述促进剂饲从而提供二噁英类物质蓄积少的安全肉类。
权利要求
1.用于排除二噁英类物质的促进剂，其包含作为活性成分的微生物，所述微生物具有促进体内二噁英类物质排除至体外的活性。
2.根据权利要求1的促进剂，其中所述微生物是乳酸菌。
3.根据权利要求1的促进剂，其中所述微生物是非病原性杆菌。
4.一种促进排除二噁英类物质的方法，其包括对人类或动物施用具有促进体内二噁英类物质排除至体外的活性的微生物。
5.根据权利要求4的方法，其中所述微生物是乳酸菌。
6.根据权利要求4的方法，其中所述微生物是非病原性杆菌。
7.具有促进体内二噁英类物质排除至体外的活性的微生物用于促进排除二噁英类物质的用途。
8.具有促进体内二噁英类物质排除至体外的活性的微生物用于制备二噁英类物质排除促进剂的用途。
9.根据权利要求7或8的用途，其中所述微生物是乳酸菌。
10.根据权利要求7或8的用途，其中所述微生物是非病原性杆菌。
11.一种生理功能性食品，其包含根据权利要求1-3任一项的促进剂。
12.根据权利要求1-3任一项的促进剂用于制备排除二噁英类物质的生理功能性食品的用途。
全文摘要
包含作为活性成分的能够促进二噁英类物质从人体内排除的微生物的二噁英类物质排除促进剂。
文档编号A23K1/00GK1671403SQ03818380
公开日2005年9月21日 申请日期2003年5月30日 优先权日2002年5月31日
发明者筱田直, 增山明弘, 森田英利, 吉川宏 申请人:卡尔皮斯株式会社