专利名称：提高植物重组蛋白生产产量的方法
技术领域：
本发明涉及提高在遗传转化植物中生产重组蛋白产量的方法。本发明最特别地涉及预防重组蛋白在收割植物后处理植物产品的过程中发生不利的蛋白水解的方法。更具体地说，本发明集中在将蛋白酶抑制剂导入植物中以防止重组蛋白在提取过程中破碎细胞时发生不利的蛋白水解。
背景技术：
蛋白的重组表达广泛地用于生产目标蛋白。常用的宿主系统是细菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、动物和植物。但是，由于许多因素经常影响重组蛋白的表达。更具体地说，重组蛋白生产的产量与蛋白在积累和提取过程中的稳定性密切相关。
已经有几种重组蛋白成功地在植物中生产，但是遇到的主要问题是低水平的重组蛋白回收。低产量的的一个原因是降解蛋白的蛋白酶的活性。目前，尚不确定植物中重组蛋白与蛋白酶的相互作用，但是已知植物液泡中有多种非特异性的蛋白酶。叶片液泡蛋白酶在略显酸性的pH范围内具有活性，它们会显著改变重组蛋白的稳定性和完整性，从而降低完整蛋白的产量。
植物蛋白酶能在蛋白生产过程的两个关键步骤中降解重组蛋白。降解可以发生在1)植物内，在蛋白积累的过程中，和2)植物外，在提取过程中破碎细胞时。后者可能更为重要，因为在该步骤中的细胞破碎会从植物的所有部分和细胞小室中释放出大量的蛋白酶。例如，已经报导水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂I(OC-1，一种临床上有用的蛋白)在转基因的马铃薯叶片细胞的细胞质中以稳定的形式积累，但是在提取时会被蛋白酶降解(Michaud和Yelle，2000，Michaud Ed.，Austin TX，第195-206页)。
从植物叶片中提取重组蛋白的基本方法一般是从破碎植物生物质并压榨得到的浆以生产绿汁开始。绿汁一般含有多种蛋白，包括蛋白酶和绿色色素物质。如果蛋白酶的活性使植物外的提取过程的水平急剧降低，即使在植物内积累大量的重组蛋白也没有用。本发明集中预防在提取过程中破碎细胞时发生植物外的蛋白水解。
本领域已经提示有多种方法来保护重组蛋白免受蛋白酶的降解。
迄今为止，研究已主要集中在减少植物内的蛋白水解性的降解。例如，一种克服植物内的蛋白水解问题的策略是把蛋白定向在替代的细胞器中，并指导它们积累在能使蛋白更稳定的亚细胞隔室中。各种研究已经证明，当使用羧端信号KDEL将目标蛋白(例如抗体或豌豆球蛋白)定向到内质网而不是液泡时，它们在细胞内积累增加(Tabe et al.，1995，J.Plant Sci.732752-2759)。但是，虽然该测量有助于防止表达重组蛋白时的蛋白水解，它并不能减小提取时蛋白水解的风险。在提取过程中，植物细胞在破碎后把各种化合物释放到介质中，其中包括蛋白酶，它们会严重地改变重组蛋白的完整性。
另外一种策略是改变植物内的蛋白水解代谢。在一个实例中，通过遗传修饰植物来降低或消除特定蛋白酶的活性，所述的蛋白酶例如美国专利申请号2002/0108149中公开的液泡处理酶(VPE’S)。在另外一个实例中，通过延缓器官的衰老来抑制包含蛋白水解的分解过程(国际专利公布号WO01/61023)。另外，这些策略可以防止重组蛋白在植物内积累时的降解，但是不能减小提取过程中的蛋白水解风险。而且，这些策略只是局限于改变对植物发育而言是非基础性的蛋白水解代谢和/或蛋白酶。
减小重组蛋白在植物外提取过程中的降解的常规方法是快速调节提取缓冲液的pH(例如到pH7)和/或使提取缓冲液包含低分子量的蛋白酶抑制剂。
本领域已知酸性pH会增加提取混合物中的蛋白的降解。调节pH的方法是能限制提取混合物中的重组蛋白的降解的可用方法。但是，该方法并非对所有的重组蛋白都有效。另外，使用酸性pH以沉淀提取混合物中的蛋白和分离含有目标重组蛋白的可溶级分，这是一种非常有用的部分地纯化这些蛋白的方法，因此把pH维持在7是在工业规模上总想消除掉的限制因素。关于在植物中生产重组蛋白，该可能性非常重要，因为植物蛋白的极大多样化和工业应用和医学应用需要严格的纯度，因此需要有效的和经济的分离和纯化方法。
在小规模的生产中可以使用防止蛋白水解的其它常规方法，包括向提取混合物中加入低分子量的蛋白酶抑制剂，例如苯基甲基磺酰氟(PMSF)或胰凝乳蛋白酶抑制剂。
但是，该方法在经济上不适合植物重组蛋白工业规模的生产，因为这时需要经济地生产大量蛋白。
考虑到在植物中经济地生产重组蛋白的方法，需要达到重组蛋白的高产水平。特别地，既然在提取过程中破碎细胞时的重组蛋白水平应该较高，如果提取后得到的水平相对较低，那么在植物内达到较高的重组蛋白水平也没有用。在这方面，需要新的经济的方法来减少细胞/组织破碎后释放到介质中的植物蛋白酶对重组蛋白的降解。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种提高植物细胞重组蛋白回收产量且不显著改变植物细胞自然生理的方法，它包括用在破碎所述的植物细胞时从该植物细胞释放的抑制剂中和至少一种参与降解重组蛋白的植物蛋白酶的活性或作用。植物细胞来自植株或体外培养物。本领域的技术人员能够认识到，中和是部分地或者全部地，可以在为提取重组蛋白而处理植物细胞时进行，植物细胞在提取重组蛋白的过程中破碎。抑制剂优选地在用表达盒转化的植物细胞中重组生产，所述的表达盒含有与其可操作地连接的启动子。另外，抑制剂可以连接到先导肽、信号肽或锚定肽或蛋白，以将所述抑制剂引导或锚定到细胞部分或细胞外隔室上，该方式能保护重组蛋白抵抗提取过程中的植物蛋白酶活性。例如，但不限于，所述的细胞部分可以是选自由线粒体、叶绿体、储存液泡、内质网和细胞溶胶组成的组的细胞器。另外，抑制剂可以由在受组成型或诱导型启动子或组织或发育特异性启动子控制下的基因编码。
要抑制或中和的目标蛋白酶可以选自由半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、多特异性蛋白酶组成的组。
根据本发明的一个特定方面，抑制剂不明显干扰蛋白酶的活性以维持植物细胞或含有该植物细胞的植株的生理或生长。
本发明的另外一个方面是提供一种在植物内中和或调节抑制剂的方法，所述的抑制剂选自抗体或其片段、有义mRNA或反义mRNA、转录抑制剂或其调节剂、翻译抑制剂或其调节剂、先导肽或信号肽的抑制剂、蛋白酶活性的代谢产物(metabolic acquisition)的抑制剂、蛋白酶特异性的蛋白酶、将所述的蛋白酶隔离进细胞器或细胞小室的亲合肽蛋白酶。
优选地，遗传改变的植物是苜蓿或马铃薯。
要中和的目标蛋白酶可以是对胰凝乳蛋白酶抑制剂敏感的丝氨酸蛋白酶或对半胱氨酸蛋白酶抑制剂敏感的半胱氨酸蛋白酶。
优选地，重组蛋白或抑制剂是在所述植物细胞的细胞核或质体中生产。
本发明的另外一个目的是提供提高植物重组蛋白的回收产量的方法，它包括下述步骤a)在破碎所述的植物细胞时，在遗传改变植物细胞中生产重组蛋白，所述的遗传改变调节至少一种遗传反应或代谢反应，以部分地或者全部地中和至少一种蛋白酶的作用或活性；和b)破碎植物细胞后，回收重组蛋白。
植物细胞来自植株或体外培养物。
蛋白酶的作用或活性可以通过抑制其转录或翻译成活性蛋白酶，或者通过植物细胞生成的抑制剂，或者通过以能保护重组蛋白抵抗蛋白酶作用或活性的方式把重组蛋白连接到肽或蛋白来中和。
根据本发明，提供了一种遗传改变的植物细胞或植物，所述的遗传改变调节至少一种遗传反应或代谢反应，以部分地或者全部地中和至少一种蛋白酶的作用或活性，从而改善在破碎所述植物细胞或所述植物的细胞时从植物细胞或植物中回收重组蛋白。
本发明的另外一个目的是提供一种将蛋白酶抑制剂导入植物中以防止重组蛋白在提取过程中发生或进行破碎细胞时发生不利的蛋白水解的方法。
本发明部分地基于在叶片和茎的粗提物中发现了能有效地抑制马铃薯和苜蓿蛋白酶的重要级分的蛋白酶抑制剂。已经测试了马铃薯和苜蓿中的目标蛋白酶在水解目的蛋白(例如人纤连蛋白)方面的活性。这些植物蛋白酶显示出对目标重组蛋白的水解活性，本发明提供了一种新的策略来改变这些蛋白酶在提取过程中的不利活性。
本发明的一个目的也是提供一种通过防止细胞破碎后的蛋白水解但不负面影响宿主植物的正常代谢或发育来提高植物重组蛋白产量的方法。
本发明的一个目的也是提供一种防止重组蛋白在提取过程中破碎细胞时发生蛋白水解的方法，该方法允许例如酸性pH的提取混合物来沉淀蛋白和分离含有目标重组蛋白的可溶级分。
本发明的另外一个目的是英明地选择在植物中表达的抑制剂和其亚细胞定位，以确保抑制剂在植物中的充分积累和该抑制剂在收获、储存和提取时的令人满意的稳定性以便达到重组蛋白在提取过程中破碎细胞时的最佳保护效果。
根据本发明的一个方面，提供了一种提高植物或植物细胞的重组蛋白产量的方法，该方法包括下述步骤获取共同表达至少(a)重组蛋白和(b)参与降解所述的重组蛋白的内源性植物蛋白酶的抑制剂的植物或植物细胞，从而(b)中的抑制剂的控制表达可以防止或减少(a)中的重组蛋白的蛋白酶解降解，从而提高了重组蛋白的回收产量，而不负面影响植物或植物细胞的代谢或发育。
抑制剂可以和目标蛋白一起在植物中共表达，或者与目标蛋白融合。抑制剂可以和重组蛋白在相同的或不同的亚细胞隔室中共表达。
使用抗体或其片段作为蛋白酶特异性的抑制剂是本发明的另外一个方面。
根据本发明的方法，提供了一种遗传改变，例如将DNA片段插入到植物中以抑制蛋白酶的表达。遗传改变可以包括敲除(knockout)或沉默(silencing)方法。本发明还包括这样的方法，其中的抑制作用是组成型的或可诱导型的，这可能通过使用组成型的或可诱导型的启动子来实现。
本发明还提供了一种方法，其中将表达目标重组蛋白的转基因植物与表达至少一种蛋白酶特异性的抑制剂的转基因植物一起收获，以保护目标蛋白对抗在细胞裂解和/或提取过程中释放出来的植物内源性蛋白酶。
为了本发明的目的，下面定义了下述术语。
这里使用的术语“重组蛋白”是指使用重组技术通过植物或植物细胞生产的蛋白、肽或多肽。通过相应的转基因的表达来生产重组蛋白，所述的转基因已经导入植物或植物细胞中，从而遗传修饰植物或植物细胞，并在那里表达。可以重组生产的蛋白或因子可以是例如，但不限于α-、β-、和γ-干扰素，免疫球蛋白，淋巴因子例如白介素1、2和3，生长因子，包括类胰岛素生长因子，表皮生长因子，源自血小板的生长因子，转化生长因子-α、-β等，生长激素，胰岛素，胶原蛋白纤溶酶原激活物，组织纤溶酶原激活物，凝血酶，纤维蛋白原，抑酶肽，血液因子，例如因子I～XII，组织相容抗原，胶原蛋白，明胶，酶例如超氧化物歧化酶，或其它哺乳动物蛋白，特别是人蛋白。
这里使用的术语“启动子”或“启动子区域”或“转录调节序列”指DNA序列，常见于上游(5’)到编码序列，它控制编码序列的表达，这通过为RNA聚合酶和/或其它在正确位点启动转录所必需的因子提供鉴别位点、从而控制信使RNA(mRNA)的生成来实现。如这里所解释的，启动子或启动子区域包括通过下述方法衍生出的启动子变体连接到各种调节序列、随机突变或受控突变、增强子序列的加入或复制。在作为适当的重组载体的一部分导入宿主中时，这里公开的启动子区域及其生物学上的功能等同物负责启动受它们控制的基因序列的转录，这由其生成mRNA的能力所证实。
这里使用的表述“植物细胞”或“植物部分”是指小植株、原生质体、愈伤组织、根、块茎、繁殖体、种子、幼苗、花粉和任何其它植物组织。
术语“蛋白酶”是指直接地或间接地将多肽降解成更小的肽、片段、氨基酸或一种使目标蛋白失去稳定性或活性的形式的酶。
图1A、1B和1C说明了苜蓿叶的蛋白粗提物降解NPTII(A)、人纤连蛋白(B)和人血红蛋白(C)的时间进程。NPTII蛋白(A)从马铃薯叶片的稳定表达和提取物中得到。将市场上可购得的纤连蛋白(B)和血红蛋白(C)加入到苜蓿叶的粗提物中。
图2说明了在含有明胶的聚丙烯酰胺凝胶中的苜蓿(A)和马铃薯(B)蛋白酶的酶解活性；图3说明了诊断的和植物重组PI对苜蓿叶片中的特异性苜蓿叶片蛋白酶的抑制；图4说明了诊断的和植物重组PI对马铃薯叶片中的特异性马铃薯叶片蛋白酶的抑制；图5A和5B说明了通过离子交换层析(A)对苜蓿叶片蛋白酶的分离，和人纤连蛋白对胰凝乳蛋白酶抑制剂和α-1-抗胰凝乳蛋白酶(B)的主要蛋白酶级分的稳定性；图6A、6B和6C说明了通过离子交换层析(A和B)对马铃薯叶片组织蛋白酶D-样活性的分离，和天冬氨酸蛋白酶抑制剂GST-CDI对它的抑制(C)；图7说明了在表达番茄CDI转基因的转基因马铃薯系中的组织蛋白酶D-样活性的降低；图8说明了与对照植物相比，在表达番茄CDI转基因的转基因马铃薯系(CD21A)中的重组NPTII的部分稳定；和图9说明了在植物中重组蛋白酶抑制剂表达的策略变化以阻碍在蛋白回收过程中破碎细胞后的蛋白酶活性。
实施本发明的方式本发明提供了提高从转基因植物或植物细胞中回收重组蛋白的产量的新方法。
另外，本发明涉及一种生产遗传地改变以抑制至少一种蛋白酶的植物系的方法，来保持在提取过程中破碎细胞时目标重组蛋白的完整性。
另外，本发明的一个目的是提供一种防止重组蛋白在提取过程中破碎细胞时发生蛋白水解的方法，该方法允许在提取混合物和使用酸性pH来沉淀蛋白和分离含有目标重组蛋白的可溶级分。
在本发明的一个实施方案中，可以被鉴别和靶向抑制的蛋白酶是在提取过程中特异性地参与降解目标重组蛋白的蛋白酶。
在本发明的另外一个优选实施方案中，选择特异性地表达和靶向重组蛋白和蛋白酶抑制剂的策略，以便不明显地影响或保持转基因植物的代谢或发育。这里应当理解，优选地不改变植物或植物细胞的正常生理，该条件用于抑制回收(包括细胞裂解)目标蛋白时的蛋白酶的活性或作用。例如，但不限于，其中遗传修饰导致其中蛋白酶抑制的植物的生长速度与未修饰的植物相同。在另一方面，在回收或提取目标蛋白时能抑制蛋白酶的植物或植物细胞条件也没有改变蛋白合成。
在本发明的另外一个实施方案中，蛋白酶抑制剂可以靶向在与目标蛋白酶天然位置不同的亚细胞隔室中，以在植物生长过程中保持蛋白酶的生命活性，并加强在提取重组蛋白过程中破碎细胞时对重组蛋白的保护。
根据本发明，提供了一种提供条件的方法，所述的条件能在从植物或植物细胞中回收或提取目标蛋白时部分地或全部地抑制蛋白酶的作用或活性。优选地，该方法以某种方式在遗传工程植物或植物细胞中使用蛋白酶抑制剂和序列，所述的方式能保护在这些转基因植物或植物细胞中生成的重组蛋白抵抗蛋白酶活性。本发明的另外一种抑制蛋白酶活性的条件是，抑制剂直接结合到目标蛋白上，以防止蛋白酶接近切开位点，例如蛋白酶直接结合的位点，从而阻止它的作用或活性。
在本发明的另外一个实施方案中，抑制剂可以选自，但不限于由(i)半胱氨酸蛋白酶抑制剂，(ii)天冬氨酸蛋白酶抑制剂，(iii)金属蛋白酶抑制剂，(iv)丝氨酸蛋白酶抑制剂，(v)苏氨酸蛋白酶抑制剂和(vi)天然的或杂合的宽特异性范围的抑制剂组成的组。
或者，本发明的蛋白酶抑制剂能够改变蛋白酶自身的特异性或条件，该条件能改变蛋白酶对在其回收或提取过程中目标蛋白的特异性。特异性的改变或目标蛋白的蛋白酶优选地不会影响它在植物或植物细胞中的天然活性。
在工程植物上可以应用不同的策略。例如，这可以通过，但不限于1)把蛋白酶抑制剂编码基因插入到植物基因组中来进行。
本发明的另外一个实施方案是提供一种方法，其中任何编码有效蛋白酶抑制剂的基因都可以引入到植物基因组中，以降低对于高产量地生产重组蛋白理想的提取过程中的蛋白酶解活性。可以导入植物的蛋白酶抑制剂的实例包括但不限于植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂OCI、OCII和TMC-8，人丝氨酸蛋白酶抑制剂α-1-抗-胰凝乳蛋白酶(AACT)和天冬氨酸型抑制剂CDI(番茄组织蛋白酶-D抑制剂)。例如，人丝氨酸蛋白酶抑制剂α-1-抗-胰凝乳蛋白酶(AACT)可以用于抑制苜蓿内源性蛋白酶，而番茄CDI可以在马铃薯中表达以阻止内源性天冬氨酸酶(aspartae)蛋白酶。在下文中解释将蛋白酶抑制剂导入苜蓿和马铃薯的方法。
抑制剂可以互换地为蛋白酶前肽。
一种得到特异性抗体或抗体片段的蛋白酶抑制剂(它也是转基因植物的产物)的方法是涉及能阻止它的正常活性的蛋白酶。这种抑制方法依赖于抗体结合到其植物细胞中的抗原的能力。这样，就需要植物生成抗体，这可以通过用生成活性免疫球蛋白所需要的一个或多个转基因进行遗传转化植物来实现。抗体或其片段在植物中的生产是本领域技术人员所熟知的，因为已经有不同的抗体在转基因植物中被表达，包括免疫球蛋白(IgG、IgA和IgM)、单链抗体片段(ScFv)、抗原结合片段(Fab)和重链可变区。
抗体或其片段可以靶向在与目标蛋白酶天然位置不同的亚细胞隔室中，以在植物生长过程中保持蛋白酶的生命活性，并加强特别是在提取或细胞裂解时重组蛋白的保护。
本发明的一个实施方案提供了一种方法，它利用至少一种DNA片段抑制生产重组蛋白的遗传改变的植物中的内源性蛋白酶的表达。
根据本发明的另外一个方面，通过用于转化植物或植物细胞的载体得到植物或植物细胞，所述的载体包含编码重组蛋白的DNA序列和编码抑制剂的DNA序列。
根据本发明的另外一个方面，通过用一种或多种有用的载体转化整株植物、植物细胞、植物原生质体或植物质体得到转基因植物或植物细胞，所述的载体包含至少(a)第一DNA片段，它含有编码目标重组蛋白的可操作地与第一启动子相连接的DNA序列，它与引导蛋白到植物或植物细胞的特定亚细胞或细胞外隔室去的靶向肽融合，或者不融合；和(b)第二DNA片段，它含有编码蛋白酶抑制剂的可操作地与第二启动子相连接的DNA序列，它与引导抑制剂到植物或植物细胞的特定亚细胞或细胞外隔室去的靶向肽融合，或者不融合。
根据本发明的另外一个方面，通过将第一种植物与第二种植物杂交得到植物或植物细胞，所述的第一种植物包含(a)第一DNA片段，所述的DNA片段含有编码重组蛋白的可操作地与第一启动子相连接的DNA序列，它与引导蛋白到植物或植物细胞的特定亚细胞或细胞外隔室去的第一靶向肽融合，或者不融合；所述的第二种植物包含(b)第二DNA片段，所述的DNA片段含有编码蛋白酶抑制剂的可操作地与第二启动子相连接的DNA序列，它与引导抑制剂到植物或植物细胞的特定亚细胞或细胞外隔室去的第二靶向肽融合，或者不融合。
在本发明的一个实施方案中，信号肽的存在或缺少会将蛋白酶抑制剂引导到与目标重组蛋白相同的亚细胞或细胞外隔室中。或者，信号肽的存在或缺少会将抑制剂引导到与目标重组蛋白不同的亚细胞或细胞外隔室中。
在本发明的一个实施方案中，植物的靶向亚细胞或细胞外隔室是选自但不限于线粒体、质体、储存液泡、内质网、细胞溶胶和细胞外隔室。
另外，根据本发明的另外一个方面，通过适合用于质体转化的载体遗传转化植物或植物细胞得到转基因植物或植物细胞，所述的载体包含可操作地与质体中的有效启动子相连的编码重组蛋白的DNA序列和编码抑制剂的DNA序列。
另外，在本发明的一个实施方案中，蛋白酶抑制剂的编码基因可以与目标蛋白基因共同插入植物基因组中，这可以在相同的或不同的亚细胞隔室中。抑制剂可以与要在植物中生产的重组蛋白相融合。表达一种或几种蛋白酶抑制剂的植物可以与表达重组蛋白的植物杂交。
在本发明的另外一个方面，通过用载体遗传转化得到转基因植物或植物细胞，所述的载体含有可操作地连有唯一启动子的与编码蛋白酶抑制剂的DNA序列相融合的编码重组蛋白的DNA序列，它任选地含有引导融合蛋白和抑制剂到植物或植物细胞的特定亚细胞或细胞外隔室去的靶向肽的融合体。
在本发明的另一个实施方案中，用于实现本发明的方法的表达载体可以包含组成型的、可诱导型的、发育特异型的、组织特异型的或应激特异型的启动子。
另外，为了实现本发明的方法，可以直接地或间接地遗传改变蛋白酶的活性或表达。
另外，本发明的一部分是使用组成型的但也使用可诱导型的启动子来控制抑制剂的表达。例如，通过在收割前加入诱导剂，可以仅在收割时诱导抑制剂或其合成。
或者，根据本发明的另外一个方面，该方法可以包括用外因诱导内源性植物抑制剂来在收割时抑制特异性蛋白酶抑制剂，以增加重组蛋白的回收产量。
本发明提供了生产用于分子农业(molecular farming)的植物系的方法。任何植物物种都可以用来实现这里描述的任何方法、策略或方案，以部分地或全部地抑制蛋白酶对目标重组蛋白的作用。
特别重要地，本发明可以应用于苜蓿或马铃薯。
实施例参考下面的实施例可以更容易地理解本发明，这些实施例是用来解释本发明，而不是限制其范围。
实施例I植物叶片蛋白酶对NPTII蛋白的降解材料和方法使用简单模式验证外源蛋白酶抑制剂的表达会减少特定重组蛋白的降解的假设。在没有任何蛋白酶抑制剂蛋白的存在下，在马铃薯中表达了经常用作转基因植物的可选择性标记的新霉素磷酸转移酶(NPTII)蛋白，监测NPTII蛋白的降解。为了模仿蛋白酶抑制剂基因在与nptII基因相同的构建体上存在和表达的情况，将蛋白酶抑制剂基因-番茄组织蛋白酶-D抑制剂CDI(Werner et al，1993，Plant Physioly 1031473)引到NPTII基因旁，但是没有任何启动子，这样阻止CDI基因的表达。
通过BamHI和EcoRI酶切，从表达载体pGEX-3X/CDI分离出番茄CDI-编码DNA序列(Brunelle et al.1999，Arch.Insect Biochem Physiol.4288-98)，并在商业载体pCambia 2300(CAMBIA，堪培拉，澳大利亚)的BamHI和EcoRI克隆位点之间进行亚克隆。用无污染地生长的马铃薯秧苗(Solamum tuberosum L.cultivar Kennebec)作遗传转化的原材料。秧苗维持在加有0.8％(w/v)琼脂(Difco，Detroit，MI)和3％(w/v)蔗糖的MS繁殖培养基中(Murashige and Skoog 1962，Physiologia Plantarum15473-497)，培养间温度22℃，用冷荧光灯照明，光照强度60μmol/m2/s，光照周期16小时/天。按照Wenzler等人(1989，Plant Sci.6379-85)所述的方法，用细菌载体根癌农杆菌LBA4404遗传转化直径约10mm的叶片盘，除了头孢噻肟以外，代替羧苄青霉素，来作根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的生长对照。将重新生出的根转移到含有卡那霉素和头孢噻肟的选择性培养基中，进行根的再生和秧苗的繁殖。为了驯化，将秧苗转移到生长室中14天，生长室的条件为白天/夜间温度周期为24℃/21℃，光照周期为12小时LD，光强度为200μmol/m2/s，相对湿度为60％，在转移到温室之前处于标准生长条件下。根据Edwards等人的方法(1991，Nuc.Acids Res.191349)，使用从约30cm马铃薯植物的第4片、第5片和第6片叶子(从顶点计)提取出的DNA，通过PCT确认卡那霉素抗性植物中的nptII(标记)转基因的整合。
从PCR阳性植物制备出蛋白提取物，并进行时间进程实验，其中通过使用市售抗体的Western分析监测NPTII蛋白的降解。图1A说明了粗提物中的马铃薯叶片蛋白酶对NPTII蛋白的降解，所述的粗提物来自表达nptII基因且含有无启动子的CDI基因的对照转基因系。通过Western印迹技术检测NPTII蛋白。从Western印迹(图1A)可以看出，在孵育的前10分钟内观察到NPTII蛋白的降解。
实施例II植物叶片蛋白酶对临床上有用的蛋白的降解材料和方法其它重组蛋白可以用作提取过程中的通过蛋白酶解而降解的目标。更具体地，该降解对植物药的回收具有非常坏的影响。为了证明在马铃薯中发生的过程也会在其它植物中发生，在苜蓿叶片提取物中监测临床上有用蛋白的降解。该实验包括在体外将市售蛋白加入到苜蓿叶片提取物中，在一段时间内通过Western分析监测这些蛋白的降解。在第一个实验中(图1B)，通过将5μl在含有10mMβ-巯基乙醇的50mM Tris-HCl pH 7.0(1∶3w/v)中制备的苜蓿(cultivar Saranac)叶片提取物与2μg纤连蛋白(Boehringer Mannheim，cat#1080938)相混合，监测在苜蓿蛋白酶存在下人纤连蛋白的体外降解。在37℃孵育混合物，通过加入5μl SDS-PAGE变性/装载缓冲液终止反应。将蛋白样品(T＝0和T＝1小时)装入10％(w/v)SDS-PAGE胶，电转移到硝酸纤维素膜上。用人纤连蛋白的多克隆抗体(Sigma Aldrich，cat#F3648)免疫检测底物蛋白和它们的水解片段。
在第二个实验中(图1C)，通过将20μg在含有0.1％Triton x-100、2mM PMSF和10μM胰凝乳蛋白酶抑制剂的20mM Mops(pH7.5)中制备的苜蓿叶片提取物与200ng血红蛋白(Sigma，cat#H-7379)相混合，终体积为8μl，监测人血红蛋白在苜蓿蛋白酶存在下的体外稳定性。在室温孵育混合物，通过在不同时间(0分，15分，30分，1小时和1小时30分)加入2μl含有β-巯基乙醇的变性/装载缓冲液5X终止反应。将蛋白样品装入15％(w/v)SDS-PAGE胶，电转移到PVDF膜上。用人血红蛋白的单克隆抗体(Fitzgerald Cat#10H03)免疫检测底物蛋白。胶上的“标准(std)”带对应于200ng纯血红蛋白。总之，图1说明了纤连蛋白(B)和血红蛋白(C)在苜蓿叶片提取物存在下的降解，显示出了植物内源性蛋白酶对这些蛋白的水解作用。例如，苜蓿(cultivar Saranac)内源性蛋白酶能容易地降解纤连蛋白，最终水解成先导中间体(图1B)。用苜蓿蛋白酶孵育30分钟后，血红蛋白也被降解(图1C)。
实施例III植物叶片提取物中的主要蛋白酶活性的鉴别材料和方法在不同的植物种中发现了多种蛋白酶。为了表征在苜蓿和马铃薯中发现的主要蛋白酶的活性，从这两种植物的叶片制备出粗蛋白提取物。图2说明了内源性苜蓿(A)和马铃薯(B)叶片蛋白酶(箭头)降解明胶的水解作用。用50mM Tris-HCl(pH7.5)从苜蓿(cultivar Saranak)或马铃薯(cultivarcultivarKennebec)叶片中提取(1∶3 W/V)出可溶蛋白，在非还原性条件下溶解到含有0.1％(w/v)明胶(Michaud et al.，1993，Electrophoresis 1494-98)的10％(w/v)SDS-聚丙烯酰胺平板胶上。通过将胶在25℃的2.5％(v/v)Triton X-100中孵育30分钟进行蛋白酶的复性。通过将胶放入37℃的100mM柠檬酸盐磷酸盐(citrate phosphate)(pH6.0，还含有0.1％TritonX-100和5mML-半胱氨酸)中30分钟来激活明胶酶反应。考马斯亮蓝染色后，蛋白酶在蓝色背景下显示为清晰(分解)带。
该检测方法能容易地实现对得到的多种蛋白酶活性中的一种的特异性蛋白酶抑制剂活性的鉴别。本领域的技术人员能够制备类似的蛋白提取物，加入特异性蛋白酶抑制剂，在明胶上检测分解带的消失，这意味着使用的蛋白酶抑制剂能使该特异性蛋白酶活性失活。
实施例IV各种蛋白酶抑制剂对特异性植物蛋白酶活性的作用材料和方法使用实施例III所述的方法，可以鉴别出哪种蛋白酶活性负责降解特异性的临床上有用的蛋白。由此，令人感兴趣的是能发现选择性地抑制蛋白酶活性的特异性蛋白酶抑制剂。为了这一应用，研究了合成的荧光蛋白酶底物的应用。荧光蛋白酶底物用于检测潜在的各种诊断的或重组PI对特异性植物蛋白酶的抑制。叶片蛋白是在含有10mMβ-巯基乙醇的50mM Tris-HCI(pH7.5)中提取(1∶3 w/v)，用提取缓冲液将蛋白含量调至终浓度1mg/ml。通过将1080μl提取缓冲液、108μ植物提取物与12μl 1mMAla-Ala-Phe-MCA、1mM suc-Ala-Ala-Pro-Phe-MCA、1mMsuc-Leu-Val-Tyr-MCA或1mM Bz-Arg-MCA相混合制备出主要的反应混合物。将100μl主要混合物分布到96孔微板中，最后向反应混合物中加入5μl 100mM PMSF(丝氨酸蛋白酶抑制剂)、1mM抑酶肽(丝氨酸蛋白酶抑制剂)、10mM胰凝乳蛋白酶抑制剂(丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶的抑制剂)、1mg/mlα-1抗胰凝乳蛋白酶(胰凝乳蛋白酶-样蛋白酶抑制剂)、10mM亮抑蛋白酶肽(胰蛋白酶-样蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶的抑制剂)、1mM胃蛋白酶抑制剂(天冬氨酸蛋白酶抑制剂)、100mM E-64(半胱氨酸蛋白酶抑制剂)、重组CDI(组织蛋白酶-D抑制剂；天冬氨酸蛋白酶抑制剂)、重组OCI(米曲半胱氨酸蛋白酶抑制剂I(oryzacystatin I)；半胱氨酸蛋白酶抑制剂)、重组CCII(玉米半胱氨酸蛋白酶抑制剂2；半胱氨酸蛋白酶抑制剂)和重组PMC8(马铃薯多半胱氨酸蛋白酶抑制剂域8；半胱氨酸蛋白酶抑制剂)。使用激发和发射过滤器分别为485nm和520nm的Fluostar Polastar GalaxyTM荧光计(BMG Lab Technologies)，在30℃，在5000秒的时间内检测荧光强度100次。以荧光/分钟为单位表示的蛋白酶活性与发射曲线的斜率相对应。如图3和4所示。可以认为多种类型的蛋白酶可能减少来自苜蓿和马铃薯叶片的蛋白酶的活性，包括丝氨酸(例如，PMSF-、抑酶肽-、胰凝乳蛋白酶-和胰凝乳蛋白酶抑制剂-敏感的)、半胱氨酸(E-64/半胱氨酸蛋白酶抑制剂-敏感的)和天冬氨酸(胃蛋白酶抑制剂-敏感的)蛋白酶。
实施例V苜蓿叶片提取物中纤连蛋白水解的抑制材料和方法人纤连蛋白对苜蓿叶片提取物中的蛋白酶降解是敏感的(图1C)。下面的步骤是要证明使用各种蛋白酶抑制剂来抑制纤连蛋白的降解。通过用丝氨酸类抑制剂α-1抗胰凝乳蛋白酶抑制苜蓿蛋白酶显著增加纤连蛋白的稳定性(图5)。首先，通过层析分离苜蓿叶片的蛋白提取物，分离出含有最高蛋白酶活性的特异性级分。通过在液氮中研磨并重新溶解到含有10mM β-巯基乙醇的50mM Tris-HCI(pH6.8)中提取苜蓿(cultivar Saranac)叶片。粗提物在4℃、10000g离心15分钟，通过0.3μm孔径的过滤器过滤上清液。然后将15mg叶片蛋白装到用提取缓冲液平衡的Mono-Q FPLC柱(Pharmacia)中。用提取缓冲液中的线性梯度KCl(0～0.7M)洗脱蛋白，流速为2ml/分钟。收集500μl的级分，将每个级分的样品装到明胶/PAGE胶上(图5A)。级分#8最大程度地水解了胶中的明胶，用它评估α-1抗胰凝乳蛋白酶的保护作用。
其次，鉴别出的级分#8与各种蛋白酶抑制剂联合使用，以鉴别抑制纤连蛋白水解的潜在备选物。在图5B说明的实验中，将5μl级分#8与350ng纤连蛋白相混合，在2μl H2O(泳道2)、2μl 10mM胰凝乳蛋白酶抑制剂(泳道3)或2μl α-1抗胰凝乳蛋白酶(泳道4)存在下，在37℃孵育15分钟。对照(泳道1)含有5μl代替苜蓿蛋白酶的提取缓冲液。15分钟后停止反应。如图1C免疫检测纤连蛋白。如图5B所示，通过Mono-Q层析洗脱的级分能明显地水解纤连蛋白，但是会被丝氨酸-样蛋白酶的抑制剂、胰凝乳蛋白酶抑制剂和α-1抗胰凝乳蛋白酶抑制。应当指出，蛋白分子(α-1抗胰凝乳蛋白酶)和化学分子(胰凝乳蛋白酶抑制剂)都能有效地减少纤连蛋白的降解。
实施例VI马铃薯叶片提取物中的特异性天冬氨酸-类蛋白酶抑制剂对组织蛋白酶D-样蛋白酶活性的抑制材料和方法与实施例V类似，从马铃薯(cultivar Kennebec)叶片制备出可溶蛋白，用Mono-Q层析分离，上到明胶/PAGE(图6A)，如图5A所述。使用终浓度为6μM的组织蛋白酶D-特异性底物(MOCAc-Gly-Lys-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-D-Arg-NH2)，通过荧光测定法检测每一个层析级分的蛋白酶活性(图6B)。如图6C所示，显示出最高的组织蛋白酶D-样活性的马铃薯叶片蛋白级分(级分#13)中的蛋白酶活性被天冬氨酸-类抑制剂番茄组织蛋白酶D抑制剂“CDI”急剧改变，将CDI-敏感的蛋白酶鉴定为令人感兴趣的目标，它用于开发目的在于通过抑制植物内源蛋白酶来保护蛋白完整性的策略。值得注意的是，我们的数据还表明，抑制一种蛋白酶(或蛋白酶组)就可能足以保护粗提物中的蛋白的主要部分，尽管在介质中还有其它(不敏感的)蛋白酶。
实施例VII在马铃薯中异位表达番茄组织蛋白酶D抑制剂对重组蛋白的稳定化材料和方法为了评价在植物中异位表达重组蛋白酶抑制剂对离体(ex vitro)提取过程中内源性蛋白酶活性的影响，将来自番茄的组织蛋白酶D抑制剂-番茄CDI(Werner et al.1993，Plant Physiology 1031473)整合到表达载体中，并在马铃薯(cultivar Kennebec)中稳定表达。通过整合无启动子的CDI转基因，还设计了表达选择标记新霉素磷酸转移酶(NPTII)但是没有CDI的转基因对照。通过BamHI和EcoRI酶切，从表达载体pGEX-3X/CDI分离出番茄CDI-编码DNA序列(Brunelle et al.1999，Arch.Insect BiochemPhysiol.4288-98)，并在商业载体pCambia 2300(CAMBIA，堪培拉，澳大利亚)的BamHI和EcoRI克隆位点之间进行亚克隆。使用BamHI/SalI处理，从市售质粒pBI-121(Clontech，Palo Alto，CA)分离出CaMV 35S启动子，然后连接在含有CDI转基因的pCambia构建体的BamHI和SalI克隆位点之间。通过整合无启动子的CDI转基因，设计了表达选择标记新霉素磷酸转移酶(NPTII)但是没有CDI的转基因对照(SPCD系)。按照实施例I所述转化马铃薯植物。按照Logemann等人(1987，Anal Biochem.16316-20)的方法，使用从nptii转基因阳性植物的第4、第5和第6片叶子提取出的总RNA，通过RT-PCR和Northern印迹监测转基因系中CDI转基因的表达。
在表达低水平的(Kennebec，SPCD4和SPCD7)或高水平的(CD3A，CD18A，CD21A)CDI mRNA的转基因马铃薯植物中检测组织蛋白酶D-样活性。叶片蛋白的提取与实施例IV相同。如实施例VI进行组织蛋白酶D活性的荧光分析。如图7所示，在表达CDI转基因的转基因马铃薯系中的组织蛋白酶D-样活性被显著降低。使用合适的多克隆抗体的Western印迹(图8)表明，与从转基因对照系SPCD4观察到的降解模式相比，从表达高水平的重组CDI mRNA(克隆21A)的转基因系得到的粗蛋白提取物中的马铃薯叶片蛋白酶对重组标记蛋白NPTII的降解被显著降低。50分钟后仍然可以从表达高水平的CDI的CD21转基因植物提取物中检测出NPTII蛋白，而在含有启动子不及CDI的构建体(SPCD)的对照系中孵育后共计仅降解了10分钟。从实际的观点看，该结果表明番茄CDI有效地抑制了马铃薯叶片提取物中的天冬氨酸蛋白酶活性，保护重组蛋白不被该酶水解。
如上面对苜蓿和马铃薯的描述，植物叶片细胞含有相当量的在提取过程中会释放到介质中的非特异性蛋白酶。通常假设，在酸性到弱酸性pH范围内的蛋白酶活性产生了植物叶片细胞中的大多数非特异性水解活性，它们一般属于半胱氨酸和天冬氨酸类蛋白水解酶。从这里的数据可以看出，不同类型的蛋白酶(例如CDI和对胰凝乳蛋白酶抑制剂敏感的蛋白酶)可能显著影响有用蛋白的稳定性。作为在细胞小室(而不是细胞质)中常见的大多数非特异性蛋白酶，对这些蛋白酶(例如番茄CDI或α-1抗胰凝乳蛋白酶)有活性的抑制剂能以某种方式在叶片细胞(或其它地方)的细胞质隔室中表达，该方式不会不利地干扰体内宿主植物的代谢，然后在回收过程中破碎细胞后作用于内源性蛋白酶。
在实践中，可以用两种不同的策略来达到该目的(图9B和9C)。第一种策略是开发表达合适的蛋白酶抑制剂的苜蓿转基因系，然后用该系作为“抗蛋白水解”(或“低蛋白水解”)工厂来生产表达有用蛋白的双转化株(图9B)。第二种策略是设计包含备选蛋白酶抑制剂和目标蛋白的融合蛋白，二者通过蛋白酶敏感的切割位点连接，在该切割位点能够切割融合体并回收游离蛋白(图9C)。对于策略1，表达蛋白酶抑制剂的转基因系然后作为生产苜蓿异种蛋白的“万能”工厂。策略2具有更高的特异性，因为设计的基因融合体是为了表达每一种特定蛋白，但是一步转化操作就足以保存蛋白。在两种情况下，植物细胞体内都存在伴随抑制剂，它们在提取过程中破碎细胞小室后能抑制任何有活性的植物目标蛋白酶。
尽管已经结合本发明的特定实施方案对其进行了描述，应当理解还能进一步改进它，本申请意在包括总体上属于本发明的基本原理和包括如在本发明所属领域已知的或常用的范围内，如应用了上述的基本特征，如在所附权利要求的范围内偏离本发明公开的内容的任何变体、应用或改变。
权利要求
1.一种提高植物细胞重组蛋白回收产量而不显著改变所述植物细胞天然生理的方法，它包括用在破碎所述植物细胞时从所述植物细胞释放的抑制剂中和至少一种参与降解所述重组蛋白的植物蛋白酶的活性或作用。
2.如权利要求1的方法，其中所述植物细胞来自植株或来自体外培养物。
3.如权利要求1的方法，其中所述中和是部分地或者全部地。
4.如权利要求1的方法，其中所述中和是在为提取所述重组蛋白而处理所述植物细胞时发生。
5.如权利要求1的方法，其中所述植物细胞是在进行提取所述重组蛋白的过程时被破碎。
6.如权利要求1的方法，其中所述的蛋白酶选自由半胱氨酸蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶，金属蛋白酶，丝氨酸蛋白酶，苏氨酸蛋白酶和多特异性蛋白酶组成的组。
7.如权利要求1的方法，其中所述抑制剂在用表达盒转化的植物细胞中重组生产，所述表达盒含有与其可操作连接的启动子。
8.如权利要求1的方法，其中所述抑制剂连接到前导肽、信号肽或锚定肽或蛋白，以将所述抑制剂引导或锚定到细胞部分或细胞外隔室，该方式保护所述重组蛋白抵抗提取过程中的植物蛋白酶活性。
9.如权利要求7的方法，其中所述抑制剂不干扰所述蛋白酶的活性以维持所述植物细胞或含有所述植物细胞的植株的生理或生长。
10.如权利要求7的方法，其中所述细胞部分是选自由线粒体，叶绿体，储存液泡，内质网和细胞溶胶组成的组的细胞器。
11.如权利要求7的方法，其中所述抑制剂选自由抗体或其片段，有义mRNA或反义mRNA，转录抑制剂或其调节剂，翻译抑制剂或其调节剂，前导肽或信号肽的抑制剂，蛋白酶活性的代谢产物的抑制剂，蛋白酶特异性的蛋白酶，将所述蛋白酶隔离进细胞器或细胞小室的亲合肽蛋白酶组成的组。
12.如权利要求8的方法，其中所述遗传改变植物是苜蓿或马铃薯。
13.如权利要求1的方法，其中所述蛋白酶是胰凝乳蛋白酶抑制剂-敏感的丝氨酸蛋白酶。
14.如权利要求1的方法，其中所述蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶抑制剂-敏感的半胱氨酸蛋白酶。
15.如权利要求1的方法，其中所述抑制剂是蛋白酶抑制剂。
16.如权利要求1的方法，其中所述植物细胞是遗传改变的。
17.如权利要求1的方法，其中所述中和是通过一种抑制剂进行的，所述抑制剂由在组成型的或可诱导型的启动子或组织或发育特异性启动子控制下的基因编码。
18.如权利要求3或5的方法，其中所述的重组蛋白或抑制剂是在所述植物细胞的细胞核或质体中生产。
19.一种增加植物重组蛋白的回收产量的方法，它包括下述步骤a)在破碎所述植物细胞时，在遗传改变植物细胞中生产重组蛋白，所述遗传改变调节至少一种遗传反应或代谢反应，以部分地或者全部地中和至少一种蛋白酶的作用或活性；和b)破碎所述植物细胞后，回收所述重组蛋白。
20.如权利要求19的方法，其中所述植物细胞来自植株或来自体外培养物。
21.如权利要求19的方法，其中所述的蛋白酶的作用或活性通过抑制其转录或翻译成活性蛋白酶，或者通过所述植物细胞生成的抑制剂，或者通过保护所述重组蛋白抵抗所述蛋白酶的作用或活性的方式把所述重组蛋白连接到肽或蛋白来中和。
22.一种遗传改变的植物细胞或植物，所述的遗传改变调节至少一种遗传反应或代谢反应，以部分地或者全部地中和至少一种蛋白酶的作用或活性，从而改善在破碎所述植物细胞或所述植物的细胞时从所述植物细胞或植物中回收重组蛋白。
23.如权利要求22的植物细胞或植物，其中所述的调节抑制编码蛋白酶的基因的转录或翻译，或用在所述植物或植物细胞中生产的蛋白酶抑制剂中和蛋白酶。
24.如权利要求22的植物细胞或植物，其中所述重组蛋白或蛋白酶抑制剂以改善保护所述重组蛋白抵抗至少一种蛋白酶方式的连接到前导肽，信号肽或蛋白质。
全文摘要
本发明涉及提高遗传转化植物重组蛋白产量的方法。本发明最特别地涉及预防重组蛋白在收割植物后处理植物产品的过程中发生不利的蛋白水解的方法。更具体地说，本发明集中在将蛋白酶抑制剂导入植物中以防止重组蛋白在提取过程中破碎细胞时发生不利的蛋白水解。
文档编号A01H1/00GK1671848SQ03818146
公开日2005年9月21日 申请日期2003年7月28日 优先权日2002年7月29日
发明者多米尼克·米肖, 丹尼尔·里瓦德, 拉斐尔·安格诺, 索尼娅·特雷帕尼尔, 路易斯－菲利普·韦赞娜, 弗朗斯·布吕内勒 申请人:拉瓦勒大学