专利名称：一种抗逆转录因子高效表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗逆转录因子高效表达载体，具体涉及用农杆菌介导法获得的DREB1A抗逆转录因子双元表达载体。
背景技术：
在转基因植物的研究中，应用的技术主要有三种，即基因枪法、花粉管通道法和农杆菌介导法。其中，农杆菌介导法具有一定的优越性。农杆菌是一种天然的植物基因转化系统，农杆菌介导的转化方法能转移较大的DNA片段，转基因拷贝数低，遗传稳定性好。该法目前在双子叶植物中应用较多，由于单子叶植物对农杆菌感染不敏感，极大的限制了农杆菌介导法在单子叶植物上的应用。虽然该方法在一些单子叶植物上获得了一定的转化效率，但总的来说转化效率还很低，特别是在小麦上很少有成功的报道。
此外，干旱、盐渍、低温等逆境条件是严重影响我国农作物生产的主要非生物胁迫因素，培育抗逆新品种适应多变的生态环境是目前迫切需要解决的问题。大量研究和实践表明，与植物抗虫、抗病等其它性状比较，植物的抗逆性状要复杂得多。植物对干旱、高盐及低温耐性的强弱往往不取决于单一因子，其性状受到许多因子的影响。利用单一基因，如脯氨酸合成酶基因或甜菜碱合成酶基因进行转化，虽能改善植物的耐盐性或耐旱性，但不能使植物的抗逆性得到较为理想的综合改良。
发明内容
本发明的目的是从改良或增强一个关键的转录因子的调控能力着手，使植物抗逆性得到综合改良。
本发明用农杆菌介导法获得了一种抗逆转录因子的高效表达载体。所述抗逆转录因子是DREB(dehydration responsive element binding)1A，它可以调控多个与植物抗逆性相关的功能基因的表达。
本发明的技术方案是通过酶切、连接、转化等技术，把DREB抗逆转录因子连接到质粒pC3300表达载体上，从而构建出适合于单子叶植物的农杆菌介导的高效表达载体。经农杆菌中的根癌土壤杆菌LBA4404介导，对植物进行转化实验，PCR分析结果显示DREB1A基因在小麦中转化效率达40％。
上述抗逆转录因子的高效表达载体中，所述抗逆转录因子DREB是DREB1A基因，该基因来源自拟南芥植物。
图1是植物表达载体的构建过程。
图2是pC3300IS-DREB1A质粒的酶切检测电泳图。其中1，6为对照，2-5为EcoRI单酶切，7-10为XbaI单酶切，11为Marker，其中2，3，7，8为正连，4，5，9，10为反连。
图3是对转化植株的鉴定的PCR检测结果。其中M是λDNA/EcoRI+HindIIIMarker；+是阳性对照；-是阴性对照；1-10是转化植株。
具体实施例方式实施例1植物农杆菌介导的双元表达载体的构建1材料1.1菌种和质粒大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α、根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefacience)LBA4404(由山东大学提供)、质粒pAHC25(由清华大学提供)、质粒pC3300(由山东大学提供)、质粒pTripIEx2-IS(由山东大学提供)。
1.2植物材料小麦品种H6756(中国农业科学院作物育种栽培研究所提供)1.3主要生化试剂限制性内切酶EcoRI、HindIII、XbaI，T4DNA连接酶，TaqDNA聚合酶(以上酶均购自宝生物工程公司)，DNA片段快速纯化/回收试剂盒(购自鼎国生物公司)卡那霉素(Kanamycin)、利福平(Rifampicin)，乙酰丁香酮(acetosyringone，AS)。
2方法(见附图1)1.用EcoR I和HindIII双酶切pC3300，电泳回收大片段；用EcoR I和HindIII双酶切pTripIEx2-IS，电泳回收659bp大小的片段；再用T4DNA连接酶连接到回收的pC3300大片段上得到pCIS；2.制备大肠杆菌DH5α感受态，用pCIS质粒转化大肠杆菌，涂板培养过夜。从平板上挑取单菌落接种到液体培养基中振荡培养，然后提取质粒进行EcoR I和HindIII双酶切检测，其中12个转化子的酶切电泳图得到了转化的659bpIS片段，证明这12个转化子为构建的pCIS。
3.HindIII单酶切pCIS，电泳回收，去磷，再电泳回收。
4.HindIII单酶切pAHC25，电泳回收3.2kb大小的片段(包含Ubi1启动子、DREB1A基因和NOS3’终止子)。
5.用T4DNA连接酶连接到去磷的pCIS HindIII酶切位点间得到pC3300IS-DREB1A。制备大肠杆菌DH5α感受态，用pC3300IS-DREB1A质粒转化大肠杆菌，涂板培养过夜。挑取单菌落接种到液体LB培养基中振荡培养，然后提取质粒进行EcoR I和XbaI单酶切检测。
6.最后把构建的pC3300IS-DREB1A用冻融法导入根癌土壤杆菌LBA4404。
7.载体构建的检测结果提取pC3300IS-DREB1A质粒进行EcoR I和XbaI单酶切检测，其中4个转化子酶切电泳图得到预定大小的片段，通过酶切片段可以看出2个为正连，2个为反连(见附图2)。EcoRI酶切得到片段正连10175bp 2670bp 933bp，反连12152bp 933bp 835bp。XbaI酶切得到片段(只在导入的3260bp片段上有酶切位点所以正连和反连酶切片段相同)10835bp2152bp 933bp。
实施例2小麦的转化和再生1.建立受体系统1)种子灭菌取饱满干净的种子用70％乙醇浸泡5分钟，再用0.1％HgCl2浸泡15分钟，然后用无菌水冲洗4次，灭菌期间不断晃动种子。
2)灭菌后的种子放在无菌的三角瓶中，加适量无菌水，放置15-35℃黑暗条件下萌发。
3)种子萌动后转到MS培养基上，放置15-35℃黑暗条件下继续萌发。
待胚芽长至2-3厘米时，剥离胚芽鞘和幼叶，暴露茎尖生长锥用于转化。
2.工程菌的制备将实施例1中获得的带有pC3300IS-DREB1A载体的农杆菌LBA4404在附加利福平、卡那霉素的Yep液体培养基中震荡培养，震荡速率110转/分，培养温度28℃。培养到对数生长期(OD＝0.5)，然后4000rpm/min离心10分钟，弃上清，再将菌体用添加乙酰丁香酮(acetosyringone，AS)的MS液体培养基中悬浮用于转化。
3.转化将无菌苗的茎尖生长锥浸泡在悬浮的农杆菌菌液中6分钟，期间不停晃动，然后倒掉菌液，种子表面用滤纸吸干，再将苗放在MS培养基上，黑暗条件下共培养2-3天。
4.移栽和筛选将植株移栽到装有蛭石的花盆中，植株顶部覆盖蛭石，待长出新叶后，将沾有1/1000Basta除草剂的棉球放置在新叶上，待棉球干燥后取下。未转化的植株逐渐死亡，转化植株对除草剂有抗性存活下来。最后将存活植株移植到大田中。
5.转化植株的鉴定转化的200株无菌苗，经除草剂Basta筛选获得143株抗性植株。对抗性植株进一步做PCR检测，结果显示50株转化植株扩增出特定大小的片段，转化率达40％(见附图3)。
实施例3转基因植株的PCR检测用CTAB法从转化植株叶片中提取总DNA，然后以总DNA为模板作PCR。特异性引物(由博亚公司合成)DREB1A-5F primer(19bp)5’-TTTAGTTACCTTATCCAGT-3’Tm＝41.2℃DREB1A-3R primer(18bp)5’-TTACACTCGTTTCTCAGT-3’Tm＝41.2℃反应体系待测小麦DNA(模板)1ulddH2O3ul10×Buffer 1ulMgCl2(25mM) 0.7ul4×dNTP(each 2mM)1ul5F primer1ul3R primer1ulBSA(0.1％) 1ulTagDNA(3U/ul)0.3ulTotal 10ul反应程序
权利要求
1.一种抗逆转录因子高效表达载体，特征是将抗逆转录因子DREB与质粒pC3300表达载体连接而得到的。
2.权利要求1所述的表达载体，所述抗逆转录因子DREB是DREB1A基因。
3.权利要求1所述的表达载体，所述抗逆转录因子DREB转录因子克隆自拟南芥类植物。
4.权利要求1所述的表达载体的用途，是在转基因植物的研究中，经农杆菌介导的用于单子叶植物基因转化的高效表达载体。
5.权利要求1所述的表达载体的制备方法，特征是把DREB抗逆转录因子连接到质粒pC3300表达载体上而构建出的。
6.权利要求4所述的表达载体的制备方法，所述把DREB抗逆转录因子连接到质粒pC3300表达载体上，是通过酶切、连接、转化技术进行的。
全文摘要
本发明涉及一种抗逆转录因子高效表达载体。本发明通过酶切、连接、转化等技术，把DREB1A抗逆转录因子连接到质粒pC3300表达载体上，从而构建出适合于单子叶植物的农杆菌介导的高效表达载体。经根癌土壤杆菌LBA4404介导，对植物进行转化实验，PCR分析结果显示DREB1A基因在小麦中转化效率达40％。
文档编号A01H1/00GK1618975SQ20031011534
公开日2005年5月25日 申请日期2003年11月20日 优先权日2003年11月20日
发明者刘录祥, 梁欣欣, 赵林姝, 郑企成, 王晶, 赵世荣, 郭会君, 陈文华 申请人:中国农业科学院作物育种栽培研究所