专利名称：棉花杂交育种的纯合显性雄性不育系、高效恢复系载体和两系法育种的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工厂领域，涉及利用植物基因工程技术进行植物雄性不育系的人工创建为作物杂种优势的利用提供了一种有效的手段。具体地讲本发明还提供了一种利用纯合显性雄性不育系和高效恢复系载体进行棉花杂交种子制备的两系法育种技术。
背景技术：
植物杂种优势的利用可大幅度地提高作物产量、品质和抗逆性，产生巨大的经济效益和社会效益。棉花杂种F1代具有明显的杂种优势，然而由于棉花是典型的自花授粉植物，其杂种优势的利用及杂交种的制备有赖于其雄性不育系的培育。长期以来，由于缺乏理想的三系配套材料，其杂交种子的制备主要依赖于人工去雄所完成。然而，由于人工去雄授粉的劳动成本高且难以保证去雄的彻底性，给杂交育种工作带来了很大困难，使得棉花杂种优势的利用在很大程度上受到了限制。随着基因工程技术在农业中的广泛应用以及对花药组织特异表达基因的深入研究，利用植物基因工程技术进行植物雄性不育系的人工创建为作物杂种优势的利用提供了一种有效的手段。
在通过植物基因工程技术进行雄性不育人工育种体系的创建策略中，Mariani(1990 Nature 347737，1992 Nature.357384.)等报道了利用花药特异启动子在花药中特异表达Barnase和Barstar基因分别获得不育系和恢复系。目前也先后公布了一些有关的专利(EP0,344,029，WO 92/13956，WO 92/13957，EP 0,412,911)。然而，由于这些方法产生的不育系需要与其原始材料进行回交并利用不育基因与抗除草剂基因的连锁通过喷施除草剂杀死50％可育植株才可是育性得到保持，给不育系的繁育和制种带来了一定的困难。另外，其育性恢复是通过利用不育基因Barnase(BN)的抑制剂Barstar(BS)抑制BN的活性而实现的，是一种蛋白质水平的作用，常受到BS的表达水平、表达后蛋白折叠等因素的影响。
发明内容
本发明的目的一是为了克服目前植物基因工程雄性不育人工育种体系的不足，提供一种可获得纯合显性雄性不育系的植物表达载体。二是提供一种RNA水平上破坏不育基因表达的棉花雄性不育高效恢复系植物表达载体。
本发明的另一目的是提供一种利用本发明的纯合显性雄性不育系植物表达载体和高效恢复系植物表达载体进行的两系法杂交育种技术。
本发明提供了一种由Seq ID No.7所示GST-27启动子序列、Seq ID No.4所示BS编码序列、Nos终止子序列组成的可通过使用Safener使不育基因暂时失活从而获得纯和显性雄性不育系的开关基因GBS，其序列如Seq ID No.8所示。
本发明提供了一种由Seq ID No.5 TA29启动子序列、Seq ID No.1BN基因序列、Nos终止子组成控制不育性状的不育基因TBN，其序列如Seq IDNo.9所示。
本发明提供了一种由开关基因GBS、不育基因TBN组成的可获得纯合显性雄性不育的嵌合基因TBN-GBS，其序列由Seq ID No.9和Seq ID No.8组成。
本发明提供了一种含有纯合显性雄性不育嵌合基因的植物雄性不育表达载体pBin19TN-GSS，如图1所示。
本发明的植物雄性不育表达载体可以是本发明中构建的pBin19TN-GSS，也可以是含有本发明中纯合显性雄性不育嵌合基因TBN-GBS的其它植物表达载体。
本发明提供了一种由Seq ID No.6所示的A9启动子、去除了起始密码子的BN基因正义链如Seq ID No.2、反义链Seq ID No.3、内含子、OCS终止子组成的。在RNA水平上破坏不育基因表达的雄性不育育性恢复基因AdsBN，其核苷酸序列由Seq ID No.6、Seq ID No.2和Seq ID No.3组成。
本发明提供了一种含有本发明的雄性不育育性恢复基因AdsBN的植物雄性不育高效恢复系表达载体p3300ND，如图2所示。
本发明的植物雄性不育育性恢复基因表达载体可以是本发明中构建的p3300ND，也可以是含有本发明中雄性不育育性恢复基因AdsBN的其它植物表达载体。
本发明提供了一种利用纯合显性植物雄性不育表达载体pBin19TN-GSS和植物雄性不育高效恢复系表达载体p3300ND进行棉花杂交种子制备的两系法育种技术。
将本发明的纯合显性植物雄性不育表达载体Bin19TN-GSS载体利用农杆菌介导法或基因抢转化法获得的转基因植株表现为花丝变短、柱头突出、花粉败育，自然生长条件下自交不实等生物学形状，在花期喷施Safener可使育性恢复进行自交得到纯合显性的雄性不育系。
将本发明的雄性不育高效恢复系植物表达载体p3300ND利用农杆菌介导法或基因抢转化法获得的转基因植株表现为育性良好，能进行正常的自交结实，对其自交结实后代在苗期通过喷施5×10-5mol/L的草丁膦除去非转基因植株，进行多代的自交和草丁膦选择获纯和的雄性不育恢复系。
将通过本发明获得的不育系和恢复系杂交即可进行杂交种子的制备，将含有本发明的雄性不育嵌合基因TBN-GBS、高效育性恢复基因AdsBN的植株与其它品种杂交可将其不育形状和育性恢复形状进行转育，获得新的育种材料。
图1.纯合显性雄性不育的植物表达载体图2.高效恢复系的新型植物表达载体具体实施方式
为了更好的理解本发明，通过以下实施例予以进一步地说明，但并非限定本发明。
实施例1不育基因Barnase(BN)及其抑制蛋白基因Brstar(BS)的克隆
(1)核酸酶BN基因的克隆根据Paddon，C.J等人的资料，以BN-I 5’-CgggTACCATggCACAggTTATCAAC-3’和BN-II 5’-TCTAgAgCTCgAgTTATCTgATCTTTgTAAAgg-3’为引物，以HindIII酶切的Bacillus amyloliquefaciens(中科院微生物所保藏)基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR条件为94℃变性5分钟，94℃45秒52℃45秒72℃ 1分30秒30个循环，72℃延伸10分钟。PCR产物经BamHI和SacI双酶切处理后，与pUC载体连接，转化E.coli JM109(TaKaRa公司)后得到带有BN基因的载体pUC-BN，经测序，BN基因的核苷酸序列如Seq.ID No.1所示。
(2)用于恢复系基因构建BN片断的克隆根据Paddon，C.J等人的资料，以PBN-I 5’-AAgCTTggTACCACACgTTTgACggggTT-3’和PBN-II 5’-TCTAgAgCTCgAgTTATCTgATCTTTgTAAAgg-3’为引物，以HindIII酶切的Bacillus amyloliquefaciens(中科院微生物所保藏)基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR条件为94℃变性5分钟，94℃45秒52℃45秒72℃ 1分30秒30个循环，72℃延伸10分钟。PCR产物经与pGEM T-vector(TaKaRa公司)连接，BN-正义链的序列如Seq.ID No.2所示。
(3)不育基因抑制蛋白Brstar(BS)基因的克隆根据Hatley等人的资料，以BS-I 5′-CgggATCCATggggAAAAAAgCAgTCATTCgg-3’和BS-II 5′-gCgAgCTCTTAAgAAAgTATgATggTgATgTC-3’为引物，以HindIII酶切的Bacillus amyloliquefaciens(中科院微生物所保藏)基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR条件为94℃变性5分钟，94℃45秒50℃45秒72℃ 1分30秒30个循环，72℃延伸10分钟。PCR产物经BamH I和SacI双酶切处理后，与pUC T-vector(TaKaRa公司)载体连接，转化E.coli JM109(TaKaRa公司)后得到带有BS基因的载体pUCT-vector-BS，序列如Seq.ID No.4所示。
实施例2TA29、A9、GST27启动子的克隆
(1)烟草花药特异启动子TA29的克隆根据Seunick，J等人的资料，以PTA29-I 5′-CgggATCCATCTAgCTAAgTATAACTg-3’和PTA29-II 5′-CATgCCATggTAgCTAATTTCTTTAAg-3’为引物、EcoRI和HindIII酶切的沙拇逊烟草基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR条件为94℃变性5分钟，94℃45秒54℃ 60秒72℃ 1分30秒30个循环，72℃延伸10分钟。回收特异性扩增的DNA片段。TA29序列如Seq.ID No.5所示。
(2)拟南芥花药特异启动子A9的克隆根据Diane，L.H等人(1993)和Wyatt，P等人(1992)报道的拟南芥花药特异表达启动子A9序列，以PA9-I 5′-gAgCTCgCggCCgCAAACAAACCATgTgTTACC-3′和PA9-II 5′-CTCgAgCCATggTAATTAgATACTATATTg-3’为A9的引物；提取的拟南芥WS生态型(Arabidopsis thaliana)总DNA用上述引物进行PCR扩增。PCR条件为94℃变性5分钟，94℃ 60秒51℃45秒72℃ 1分30秒30个循环，72℃延伸10分钟。PCR产物与pUC18 T-vector(TaKaRa公司)相连接，转化E.coli JM109(TaKaRa公司)后得到带有A9的载体pT-vectorA9。A9启动子序列如Seq.ID No.6所示。
(3)化学诱导启动子GST27的克隆根据Kriete等(1996)等人的资料，PG-I 5′-gAATTCCTgAATAgACgAATAACCC-3’和PG-II 5′-ggATCCATggTgTgTgCAgCTCCTgCC-3’为引物、玉米芽总DNA为模板进行PCR扩增；PCR条件为94℃变性5分钟，94℃ 60秒55℃45秒72℃ 1分30秒30个循环，72℃延伸10分钟。回收特异性扩增的DNA片段。GST27启动子的序列如Seq.ID No.7所示。
实施例3.
用于植物雄性不育的可以化学诱导纯合的新型植物表达载体的构建(1)TA29-BN cassette1)用BamH I和Nco I酶切pTvector-TA29并回收TA29片段，与同样用BamH I和Nco I酶切并回收的pUCBN质粒载体连接，构成pUCTABN。
2)再用BamH I和Sac I酶切pUCTABN并回收TA29BN小片段，与同样用BamHI和Sac I酶切的Rok II(中科院微生物所)(带有35S)质粒载体连接，构成Rok35sTN。
3)再用BamH I和Sac I酶切Rok35sTN并回收TA29BN(含Nos终止子)小片段，与同样用BamH I和Sac I酶切并回收的pBin 19(中科院微生物所)(RB和LB)质粒载体连接，构成pB19TN。
(2)GST inducible cassette1)用Xba I和BamH I酶切7Z-GST并回收GST小片段，与同样用Xba I和BamHI酶切并回收的pUC35Snos质粒载体连接，构成pUC35S-GSTBnos。
2)pUC35S-GSTBnos经Hind III和Xba I双酶切再用Klenow酶切连接得到去了35S片段的pGSTnos。
3)用BamH I和Sac I酶切Tvector BS并回收BS小片段，与同样用BamH I和Sac I酶切的pGSTnos载体连接，构成pGSTBSnos。
(3)pBin19TNGS的构建用EcoR I酶切pGSTBSnos并回收小片段，与同样用EcoR I酶切的pB19TN载体连接，构成pBin19TN-GS，如图1所示。
实施例4.
用于植物雄性不育的高效恢复系的新型植物表达载体p3300ND的构建1)用Sac I和Xho I酶切pT-vectorA9并回收A9片段，与用Sac I和Xho I酶切的质粒pHANNIBAL(Plant Journal，2001，27(6)581-590)回收的载体连接，构成pHAN-A9。
2)用Kpn I和Xho I酶切pGEMT-vectorBN-silence质粒并回收BN片段，与Kpn I和Xho I酶切的pHAN-A9连接，构成pHAN-A9BN。
3)用HindIII和Xba I酶切pGEMT-vectorBN-silence质粒并回收BN片段，与Kpn I和Xho I酶切的pHAN-A9BN连接，构成pHAN-A9BNBN。
4)用Pst I和Sac I酶切pHAN-A9BNBN并回收0.7kb的小片段，与PstI和Sac I酶切的pCAMBIA3300连接，构成p3300ps-sc。
5)用Sac I酶切pHAN-A9BNBN并回收2kb的小片段，与Sac I酶切的p3300ps-sc连接并鉴定方向，最终得到用于植物雄性不育的高效恢复系的新型植物表达载体p3300ND，如附图2所示。
实施例5.
棉花的遗传转化和植株再生与繁育(1)供转化棉花品种和菌株用于转化的农杆菌菌株为LBA4404(pBin19TN-GSS)(本发明提供)，LBA4404(p3300ND)(本发明提供)，供试棉花品种为晋棉7号、柯字312、柯字201以及ZMJI、ZMJ2、ZMJ3、ZMJ4、ZMJ6。
(2)外植体的准备棉花种子经硫酸脱绒后，用70％的酒精浸泡1分钟，再放入30％的过氧化氢中消毒2~3小时，用无菌水冲洗3遍后，浸泡在三角瓶中过夜。次日种子露白后接种于种苗培养基上(1/2MS无机盐，0.22％的Phytogel，pH6.5)。在25□，2000LX的光照强度下培养5~7天，得到供试的无菌苗，以无菌苗的下胚轴作为转化的外植体。
(3)外源基因的转化与植株再生取5天苗龄的无菌苗的下胚轴，切成5~10毫米的切段，浸泡于从液体培养基里悬浮的OD0.4左右的菌液中10~15分钟，接种到铺有滤纸的MS固体培养基上，共培养48小时后，再把其转到诱导与筛选愈伤组织培养基(MS无机盐，10毫克/升VB1，1毫克/升VB6，1毫克/升VPP，0.1毫克/升2，4-D，0.1毫克/升KT，30克/升葡萄糖，0.22％的Phytogel，Km 50mg/L(对于LBA4404(pBin19TN-GSS))或PPT 5×10-5mol/L(对于，LBA4404(p3300ND))，500毫克/升头孢霉素，pH6.5)上，在28□，光强2000 LX的条件下培养。
外植体在诱导与筛选培养基上得到的转化愈伤组织长到蚕豆大小时可转入分化培养基(MS无机盐，10毫克/升VB1，1毫克/升VB6，1毫克/升VPP，1.9克/升KNO3，30克/升葡萄糖，0.22％的Phytogel pH 6.5)，在分化培养基上继代数次后，可看到胚的形成。将分化良好的胚状体转到成苗培养基(将分化培养基中的NH4NO3去掉，另加1克/升谷氨酰胺，0.5克/升天冬素)上，继续发育得到再生植株。
(4)再生株的繁殖采用劈接法，大田推广品种为砧木，转化再生株为接穗。选5~6厘米高、并具有6~7片真叶的转化株作为接穗，用手术刀片将其茎基部削成马蹄型。同时将长有4~5片真叶的砧木削去其顶端部分，只保留2~3片真叶，然后从中间纵向切开1~2厘米，将削成马蹄型的接穗直接插入，使接穗和砧木对齐。并用细塑料绳缠紧。最后将花盆一次浇足水，并扣上2升烧杯，周围用土埋严，避免阳光直射。7天后将烧杯打开2公分通气，10天后完全去掉烧杯，锻炼2周后直接将盆移入大田。
本发明的棉花遗传转化再生株的繁育工艺可使转化出愈率可平均达40％甚至60％；再生植株的基因转化率达30％~60％，再生株成苗率可达90％以上，比再生苗直接移栽可提高长活率2~3倍。
实施例6.
转基因棉花的分子生物学检测(1)棉花总DNA的提取取100mg棉花叶片，加20μl巯基乙醇，加液氮研磨，迅速将植物组织粉末装于1.5ml Eppendorff管中，加入600μl 2×CTAB提取液，摇匀，置于65□水浴中30分钟，期间不时摇动。加入700μl酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，并摇动至溶液呈乳化状态，12000rpm离心5分钟。加入2倍体积无水乙醇，混匀后于-20□沉淀过夜，12000rpm离心1分钟收集沉淀，70％的乙醇洗沉淀，空气干燥，溶于50μl TE中备用。
(2)PCR检测将提取的棉花总DNA稀释100-1000倍，取1μl按标准PCR扩增反应方法进行检测。PCR条件为94℃变性5分钟，94℃ 60秒55℃45秒72℃ 1分30秒30个循环，72℃延伸10分钟。
(3)Southern检测将提取的植物总DNA加入等体积的0.8M的NaOH/20mM EDTA中，100□煮沸10分钟后通过真空点膜器点到Zeta-prob尼龙膜上，6watt的紫外灯相距1厘米照射湿膜15秒钟使DNA片段固定。将用地高辛标记的探针与膜上DNA杂交，之后和抗地高辛的抗体反应，清洗后进行ISPD化学发光检测(具体操作见Roche公司的DIG-High Prime DNA Labeling andDetection Starter Kit II试剂盒说明书)。
实施例7.
转基因棉花雄性不育系的生物学测定转基因棉花雄性不育棉花植株表现出了花丝变短、柱头相对突出，花药干瘪等明显的雄性不育花的特征。以0.5％的碘化钾花粉进行染色，结果表明其花粉的代谢活力很低，并表现出了明显的自交不结实现象。
实施例8.
转基因棉花显性纯和雄性不育系的获得通过本专利获得的转基因棉花雄性不育系通过在开花前和花期喷洒5×10-5mol/L的Safener可使转基因雄性不育系诱导为可育，通过自交保持并进一步纯合。
实施例9.
转基因高效恢复系的的自交纯合经本方法获得的转基因棉花雄性转基因高效恢复系自交结实，其杂交后代通过喷洒5×10-5mol/L的ppt可除去非转基因植株而使转基因高效恢复系得以保留，进一步获得纯合的转基因高效恢复系。
实施例10.
转基因棉花不育基因和恢复基因的转育通过本发明获得的雄性不育系及高效恢复系可通过常规的杂交技术转育到其它目的材料。
实施例11.
利用两系法育种体系进行的杂交种子制备将获得的纯和显性雄性不育系和纯和的高效恢复系按4∶1比例分行种植，常规管理，从不育系材料上收获种子，即可得到具有杂种优势并带有抗除草剂ppt的杂交种子用于生产。
序列表<110>中国科学院微生物研究所<120>棉花杂交育种的纯合显性雄性不育系、高效恢复系载体和两系法育种<130>
<160>9<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>339<212>DNA<213>Bacillus amyloliquefaciens<400>1ggtaccatgg cacaggttat caacacgttt gacggggttg cggattatct tcagacatat 60cataagctac ctgataatta cattacaaaa tcagaagcac aagccctcgg ctgggtggca120aaagggaacc ttgcagacgt cgctccgggg aaaagcatcg gcggagacat cttctcaaac180agggaaggca aactcccggg caaaagcgga cgaacatggc gtgaagcgga tattaactat240acatcaggct tcagaaattc agaccggatt ctttactcaa gcgactggct gatttacaaa300acaacggacc attatcagac ctttacaaag atcagataa 339<210>2<211>342<212>DNA<213>Bacillus amyloliquefaciens<400>2aagcttggta ccacacgttt gacggggttg cggattatct tcagacatat cataagctac 60ctgataatta cattacaaaa tcagaagcac aagccctcgg ctgggtggca aaagggaacc120ttgcagacgt cgctccgggg aaaagcatcg gcggagacat cttctcaaac agggaaggca180aactcccggg caaaagcgga cgaacatggc gtgaagcgga tattaactat acatcaggct240tcagaaattc agaccggatt ctttactcaa gcgactggct gatttacaaa acaacggacc300attatcagac ctttacaaag atcagataac tcgagctcta ga 342
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1.一种由GST27启动子控制的开关基因GBS，其具有如Seq ID No.8所示的核苷酸序列。
2.一种由权利要求1所述的基因和TBN不育基因组成的纯和显性雄性不育嵌合基因GBS-TBN，其核苷酸序列是由如Seq ID No.8所示的核苷酸序列和如Seq ID No.9所示的核苷酸序列组成。
3.一种能使不育系得到高效恢复的恢复基因AdsBN，其核苷酸序列由Seq ID No.6所示的核苷酸序列、Seq ID No.2所示的核苷酸序列和Seq ID No.3所示的核苷酸序列组成。
4.一种用于植物遗传转化的纯和显性雄性不育基因表达载体，它含有权利要求2所述的嵌合基因GBS-TBN。
5.一种用于植物遗传转化高效恢复系表达载体，它含有权利要求3所述的嵌合基因AdsBN。
6.根据权利要求4所述的纯和显性雄性不育基因表达载体是如图1所示的pBin19TN-GSS。
7.根据权利要求5所述的高效恢复系表达载体是如图2所示的p3300ND。
8.权利要求6或/和权利要求7所述的表达载体在转基因植物进行的基因的转育。
9.权利要求6或/和权利要求7所述的表达载体在转基因植物进行的两系法育种中应用。
10.权利要求1-9任选其一项在制备杂交种子中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种将不育基因与化学诱导型启动子控制的恢复基因串联可获得纯合显性雄性不育系植物表达载体，提供了一种利用RNAi能高效介导转录后基因沉默的原理，在花药中特异时空表达不育基因dsRNA的棉花雄性不育高效恢复系植物表达载体。本发明还提供了一种利用纯合显性雄性不育系和高效恢复系载体进行棉花杂交种子制备的两系法育种技术。
文档编号A01H1/00GK1620863SQ200310115248
公开日2005年6月1日 申请日期2003年11月26日 优先权日2003年11月26日
发明者杨怀义, 王寰宇, 张惠军, 石跃进, 朱永红, 裴蕾, 田波 申请人:中国科学院微生物研究所