专利名称：油菜雄性不育细胞质nau3a的育种方法
技术领域：
本发明公开了一种甘蓝型油菜细胞质及其特征线粒体DNA序列，属于遗传工程 领域和植物育种领域。具体地讲，涉及十字花科植物的杂种优势利用，为十字花科 植物杂交种选育提供新型不育细胞质细胞质。
背景技术：
细胞质雄性不育可以应用于杂交种生产，效益巨大，已经为人们普遍认可。细 胞质雄性不育系用于配置杂交种，可提高油菜菜籽产量15%以上，也可可显著提高 十字花科蔬菜的产量。
目前，在油菜乃至十字花科植物中，主要应用细胞质雄性不育主要是polima CMS、陕2A 、 OguCMS (参见刘平武等，甘蓝型油菜pol CMS育性恢复基因的 分子标记中国油料作物学报，2007, 29 (1): 14—19.)。
polima CMS是傅廷栋教授于1972年在甘蓝型油菜品种波里马中发现19株天然 细胞质雄性不育株，后将稳定下来的不育系称poli服CMS(简称polCMS)，其恢复 基因位于A组染色体上，为一对显性基因。PolCMS不存性也受温度的影响，依其 保持系细胞核基因的不同，可分为高温不育、低温不宵和稳定不育3种类型。通过 筛选，获得缺乏温度敏感基因的保持系，可育成不宵性稳定的polcms系。polCMS 目前的应用面最广。
陕2ACMS是李殿荣(1980)于1976年在甘蓝型油菜品种间复交组合(574-3/(丰收 4号+7207混合授粉)]后代中发现的半不育株，后经连续回交转育得到稳定不育系陕 2A，其恢复基因为1对显性基因。陕2A与pol CMS具有共同的保持系和恢复系， 由其配制的三系杂种"秦油2号"是国际上第一个通过品种审定、并大面积用于生 产的甘蓝型三系杂交种。
Ogu CMS是由0gura(1968)在闩本萝卜Raphanus sativas L.群体中发现天然雄性 不育，选育得到的系统。法国Bannerot等(1977)采用连续回交的方法将这种胞质分 别转育到甘蓝型油菜和甘蓝中，得到油菜萝卜质雄性不育系。oguCMS不育性稳定， 所有甘蓝型油菜品种均是它的保持系，其恢复基因存在于欧洲的萝卜品种中。Ogu CMS生产的杂交油菜已经在英、法等国商品化生产。
目前，全世界已经报导的油菜不育细胞质有22种以上，但是应用较多的细胞质 主要是POLCMS。目前油菜CMS利用中还是存在一些问题，主要是①油菜CMS 育性不稳定问题；②应用的CMS细胞质比较单一，让人不禁想起单一细胞质可能 造成的生产损失。因此，发掘新的油菜CMS系统仍然具有十分重要的意义。我们在油菜原生质体融合后代中，发现不育株，通过杂交和回交，获得了 NAU3A 型细胞质雄性不育系；鉴定分子线粒体DNA，证明NAU3A不育系是由线粒体重组 得到的新型不育系。
发明内容
技术问题本发明的目的在于公开一种细胞质雄性不育NAU3A，该不育胞质是通 过原生质体融合后代选育而得到的。油菜及十字花科杂种优势利用中，存在不育细 胞质单一，育性不稳定等问题，本发明的细胞质雄性不育为解决细胞质单一问题提 供了新手段，可用于油菜及其十字花科杂种优势利用。
技术方案
上述NAU3A雄性不育细胞质，属于新型细胞质雄性不育类型，可用于甘蓝型油菜、 白菜等十字花科植物的杂种优势利用。通过杂交、回交等育种方式，育成NAU3A细 胞质的雄性不育系。
NAU3A不育系的线粒体DNA中含有如下mtDNA重组序列(SEQ ID No. 1):
ATGA
该序列编码的重组蛋白序列(SEQIDNo.2)为:
LFR
有益效果
1、 本发明的目的在于公开一种细胞质雄性不育NAU3A，该不育胞质是通过原生 质体融合后代选育而得到的。
2、 油菜及十字花科杂种优势利用中，存在不育细胞质单一，育性不稳定等问题。 本发明人提供的细胞质是经过线粒体基因组重组而获得的，该重组类型不同于已经大面积应用了 20年的POLIMA不育胞质类型(pol)，该不育胞质的应用将 有利于解决不育细胞质单一的问题。而且该细胞质雄性不育类型的不育性比较 彻底，易于培育彻底稳定不育系。
3、 本发明人提供的不育胞质是线粒体基因组重组的结果利用具有NAP型胞质 的可育亲本原生质体融合，获得融合杂种；由于遗传的异质性，导致线粒体DNA 重组，从而可得到的不育胞质。线粒体DNA的分子实验证明了这个结论。本发 明的细胞质雄性不育不同于NAP型细胞质雄性不育，NAP型细胞质的恢复系是 NAU3A的保持系；也不同于POLIMA型细胞质雄性不育系，POLIMA型不育 系的线粒体编码ORF224蛋白，导致雄性不育，而本发明的不育胞质编码重组 型ORF222R3蛋白。从利用的角度看，NAP细胞质的利用价值不大，而本发明 的NAU3A细胞质利用价值很大。
4、 本发明人提供的不育胞质可以通过种间杂交，转移到白菜、甘蓝等十字花科物 种中去，为这些十字花科物种的杂种优势利用，提供细胞质雄性不育，因此应 用可以很广泛。 ，
5、 研究中，通过基因表达分析，发现NAU3A的重组型基因OT F22Z^在稳定不 育系中表达大，而在可育杂交组合中该重组型基因表达量低，说明该基因与雄 性不育的形成有关。
具体实施例方式
实施例1
以播娘蒿(D"cwm/w'a"TO; /z/a)叶片和甘蓝型油菜("o/ ^)子叶为 材料提取原生质体，采用PEG"高pH、高钙附加DMSO融合方法，液体浅层静 置培养，研究影响播娘蒿与甘蓝型油菜原生质体融合的因素，获得了 19株再生植 株。结果表明4 %纤维素酶+ 0.5 %离析酶+5 mmol/L MES酶解10h和1 %纤维 素酶+ 0.2%离析酶+3 mmol/L MES酶解14h分别适合获得高产率播娘蒿与油菜 原生质体；30%PEG + 0.3mol/L葡萄糖+ 50 mmol/L CaC12 2H20 + 15%DMSO 获得了 10%的融合率；改良B5培养基的原生质体培养效果较好；每次添加不同 的新鲜培养基和添加MES对于防止褐化具有很好的效果；适宜分化培养基为MS + 4.0 mg/L 6-BA + 0.3 mg/L NAA + 5.0mg/L AgN03;适宜生根培养基为MS + 0.1mg/L IBA + 0.1mg/L NAA。
甘蓝型油菜与播娘蒿的原生质体融合获得的再生植株移栽到田间后，对其进 行了形态学、细胞学及花粉活力观察。杂种植株生长缓慢、在叶型、叶片缺刻、 叶缘裂痕、茎杆分枝处颜色、花蕾初期颜色等形态学上表现出播娘蒿的特征，开 花期和成熟期相对较晚；杂种植株花比油菜花小，花粉活力低，结实率低。在融 合杂种中出现了 7个不育株，用甘蓝型油菜与融合杂种进行杂交和回交研究。
5实施例2
利用原生质体融合技术所获得的融合杂种中，出现了不育株。用不育株了与 NAU3B杂交，进一步从杂交F1开始选择彻底不育株与NAU3A回交，经过5代回 交，得到稳定的不育系NAU3A。 NAU3A的不育性在年份间表现稳定不育。通过测 交，已经找到恢复系，实现了三系配套，为杂种优势利用提供了新的授粉控制系统。 研究开创了细胞质方法，通过该方法从融合杂种至回交一代，均发现细胞质重组； 基因克隆的研究表明，回交一代以后细胞质mtDNA保持稳定，不再发生重组。
NAU3A是通过原生质体融合获得的一系列重组细胞质的中的一个。本发明中， 选育不育胞质的方法体系中，结合了 mtDNA重组方法以及和育种选择方法，最后 通过细胞质鉴定，得到了优良的不育细胞质。
实施例3
利用NAU3A不育胞质与白菜(5m^/ca"印^ )品种"上海青"杂交，Fl代 仍然表现为不育，而NAP型胞质的甘蓝型油菜与上海青杂交后，Fl有花粉量基本 正常，说明NAU3A不育胞质可以转移到油菜近缘中去，为杂种优势利用提供新手 段。
实验例4
选用甘蓝型油菜雄性不育细胞质NAU3A的新鲜幼嫩黄化叶片为材料，提取线粒 体DNA。依据数据库中M4尸细胞质雄性不育高度相关的w/222设计引物
上游引物Pl: 5'-TCATCGAAATAGATCGAGTA-3，；
下游引物P2: 5'-TTATGAGCTAGATAAAGCTACT -3，；
以基因组DNA为模板,扩增目的基因。PCR反应条件优化后为94。C预变性5 min 后；94。C变性30s， 54。C退火45s， 72。C延伸60s, 32个循环;72'C再延伸10 min。扩 增出了一条600 700bp大小的特异条带。PCR回收产物连接到PGT克隆载体上，转 化到大肠杆菌TOP10中，以来自目的片段上的引物序列为引物，进行PCR扩增鉴定 目的片段。对此目的片段进行测序，结果表明特异片段大小为669bp，具有起始密 码子(ATG)和终止密码子(TGA)。丌放阅读框完整。但是序列出现了重组，与NAP 型细胞质的ORF222不同，且具有这种重组序列的不存胞质与NAP型的"恢复系和 保持系"关系也不同。 实验例5:
以油菜NAU3A为材料，分别从其根、茎、叶、花蕾以及花等组织中，提取总 RNA，采用随机引物反转录cDNA第一条链，以cDNA第一条链为模板，采用RT-PCR 技术，检测油菜NAU3A不同组织的差异表达情况。
内参基因a"&的引物序列
actinF: 5'-CGCCGAGCGGGAAATCGTC陽3，actinR: 5，-GGAAAGTGCTGAGGGATGC-3，。
以真核生物中组成性表达的基因￡iUa为内标，对cDNA第一链进行半定量分 析，五F7a的PCR扩增程序为95°C2min; 94。C45s， 55°C45s, 72°Clmin， 24个 循环；72°C，延伸10min。结果表明基因在不育系的根、茎、叶、花蕾以及花中 都有表达，但在花器官和茎中的表达较高，均属于组成型表达；在可育杂交组合中 表达量低。说明不育性可能与Oi F222有关。
综上所述，本发明人利用原生质体融合技术，得到了不育株，由不育株的杂交 和回交后代得到稳定不育系NAU3A，其细胞质经过分子鉴定，证明为新型雄性不 育胞质，在ORF222区域得到了重组型DNA序列和基因及其编码蛋白。本发明人 提供了一种新型雄性不育授粉控制系统，为油菜乃至油菜的十字花科近缘种的杂种 优势利用提供了新方法。
本发明涉及的序列及记号分列如下:
(1) SEQ ID NO. 1的信息
(i) 序列特征
(A) 长度669 bp
(B) 类型核苷酸
(C) 链性单链
(D) 拓扑结构线性
(ii) 分子类型核苷酸
(iii) 序列描述SEQIDNO. 1
(2) SEQ ID NO. 2的信息
(i) 序列特征
(A) 长度222 a.a
(B) 类型氨基酸
(C) 链性单链
(D) 拓扑结构线性
(ii) 分子类型蛋白质
(iii)序列描述SEQIDNO.2
(3) SEQ ID NO. 3的信息
(i)序列特征
(A)长度20b
7(B) 类型核苷酸
(C) 链性单链
(D) 拓扑结构线性
(ii) 分子类型核苷酸
(iii) 序列描述SEQIDNO. 3
(4) SEQ IDN0.4的信息
(i)序列特征
(A) 长度22b
(B) 类型核苷酸
(C) 链性单链
(D) 拓扑结构线性
(ii) 分子类型核苷酸
(iii)序列描述SEQIDN0.4
(5) SEQ ID NO. 5的信息
(i) 序列特征-
(A) 长度19b
(B) 类型核苷酸
(C) 链性单链
(D) 拓扑结构线性
(ii) 分子类型核苷酸
(iii) 序列描述SEQIDN0.5
(6) SEQ ID NO. 6的信息
(i) 序列特征-
(A) 长度19b
(B) 类型核苷酸
(C) 链性单链 (D沐扑结构线性
(ii) 分子类型核苷酸
(iii) 序列描述SEQIDN0.6序列表
〈110>南京农业大学
〈120〉油菜雄性不育细胞质NAU3A的育种方法
<130> NAU3A
<140> 2009-7-6
<141> 2009-07-06
〈150> 2009-6-30
〈151〉 2009-06-30
<160> 6
<170〉 Patentln version 3.5
〈210> 1
<211> 669
〈212〉 DNA
〈213> Brassica napus
<400〉 1
atgcctcaac tttactttct c taaaac t ac catcgt3C肪 ctcatgttcg atttttggga gatggcgtcg ggcgcggaat agccgagtgc gccctcgtcg cggtacctag tttcgatga
<210> 2
<211> 222
<212> PRT
〈213> Brassica
<400> 2 Met Pro
tggataaatt cacttatttt tcacaattct tctggttatg ccttttcttc 60
atattttcat atgcaatgat ggagatggag tacttgggat cagcagaatt 120
ggaaccaact gctttcacac tggggtaaga ccatccagag caagctaaag 180
gtaagttcgg ggtcttagcg ttcgccacgc gctatttctt ggtggaaaag 240
tggtcccaaa aatgcggcta gctatatatc taatatatgg.tttgaatttt 300
ttaaatgggg gttgctagga aatgagatat ttcagttcgg cgtcggacca 360
cgcccccagc tctagatctc aacgagcgcc cgccactgca tcttttgtac 420
gctcatatgc tagcgcatat tcggatgttg agagttccga ctctcaacaa 480
aagagataac ccgtgaccta gagggtaagc atgatatcgc gcggcgtc幼 540
atatcatgaa gtgggaggtc aggagcttgg atcaccactt ccgggtcttt 600
etccgtctgcg agattcgaag agagccaagg tgaacgaaat actcga/tcta 660
669
rispus
Gin Leu
1
Cys
Uu Phe Phe 20 Gly 5
Phe
Lys Phe Thr Tyr
Thr Phe Tyr
Gly Val Leu 35
Trp Gly Lys Thr
Ser
His 50 Phe
lie Ser Arg lie 40 Gin
lie 25 Leu
Phe
10
Phe
Lys 65
Leu Met Phe Val
Gly Val Leu Ala 70 Pro
lie 55 Phe
Lys Lys Ala Thr Arg
Ser
Gly Leu Asn Phe 100
Val 85 lie
Phe
Lys Met Arg
Gly lie Lys 105
Leu
90
Trp
Ser
lie
Leu
Leu
Tyr
75
Ala
Gly
Gin
Cys
Arg
Lys
60
Phe
lie
Leu
Phe
Asn
Asn
45
His
Leu
Tyr
ILeu
Phe Trp 15
Asp Gly 30
Gin Leu
Arg Thr
Val Glu
Leu lie 95
Gly Asn 110
Leu
Asp
Leu
Ser
Lys
80
Tyr
Glu
9lie Phe Gin Phe Gly Val Gly Pro Asp Gly Val Ala
115 120 Asp Leu Asn Glu Arg Pro Pro Leu His Leu Leu Tyr 130 135 140
Ser Tyr Ala Ser Ala Tyr Ser Asp Val Glu Ser Ser 145 150 155
Ser Arg Val Gin Glu lie Thr Arg Asp Leu Glu Gly
165 170 Ala Arg Arg Gin Ala Leu Val Asp lie Met Lys Trp
180 185 Leu Asp His His Phe Arg Val Phe Arg Tyr Leu Asp
195 200 Ser Lys Arg Ala Lys Val Asn Glu lie Leu Asp Leu
215 220
Pro Pro Ala Leu 125
Gly Ala Glu Cys
Asp Ser Gin Gin 160
Lys His Asp lie 175
Glu Val Arg Ser 190
Arg Leu Arg Asp 205
Phe Arg
Lys 210 〈210> 3 〈211> 20 <212> DNA
〈213〉 Brassica n聊s 〈400> 3
tcatcgaaat agatcgagta 20 <210> 4 <211> 22 〈212〉 DNA
<213> Brassica n印us <400> 4
ttatgagcta gataaagcta ct 22 <210> 5 <211> 19 <212> DNA
<213> Brassica n即us 〈400〉 5
cgccgsgcgg g幼stcgtc 19 〈210> 6 〈211> 19 〈212〉 DNA
<213> Brassica n抑us <400> 6
ggaaagtgct g鄉gatgc 19
权利要求
1.一种细胞质雄性不育胞质NAU3A利用原生质体融合技术，通过杂交和回交育种方法，得到甘蓝型油菜细胞质雄性不育系和保持系，分别命名为NAU3A和NAU3B
2. 权力要求1所述的细胞质雄性不育系的线粒体DNA具有通过原生质体融合得到 的重组DNA序列Oi F222i 丄其核苷酸序列SEQ ID No. 1为-.
3. 权利要求2所述的一种重组型Oi F222/ 3基因的编码蛋白序列SEQ ID No. 2为:
全文摘要
本发明公开了一种甘蓝型油菜雄性不育细胞质NAU3A的创建方法和特征，属于遗传工程领域和植物育种领域。利用甘蓝型油菜原生质体技术，获得了融合后代，从融合后代中发现了不育株；利用NAU3B保持系与该不育株杂交和回交，得到了稳定不育系NAU3A。提取NAU3A不育系的线粒体DNA，并且利用PCR技术克隆鉴定不育胞质，得到NAU3A不育系的线粒体DNA的一个特征序列SEQ ID NO.1和其编码氨基酸序列SEQ ID NO.2。本发明的细胞质和特征基因序列为首次报导。NAU3A细胞质可广泛应用十字花科植物的杂种优势利用，具有很好的应用前景。
文档编号A01H5/00GK101647398SQ200910031820
公开日2010年2月17日 申请日期2009年7月14日 优先权日2009年7月14日
发明者姜淑慧, 张丽君, 张凤启, 张红生, 杜同庆, 田琳琳, 管荣展, 秀 郑, 陈健美 申请人:南京农业大学