专利名称：一种猴腿蹄盖蕨组织培养方法
技术领域：
本发明属于农业生物工程技术领域，是一种以孢子为外植体的猴腿蹄盖蕨组织培养的培养基配方与快速繁殖的方法。
背景技术：
猴腿蹄盖蕨(Athyrium multidentatum)别名猴腿儿，猴腿菜，紫茎菜，属蕨类，蹄盖蕨科，蹄盖蕨属低等植物。生于海拔300～400m的针阔混交林中较潮湿的林下、林缘及草地上。我国东北、华北等地广有分布。拳状嫩叶可食，5～6月间采集没有展开的叶和幼茎，其营养成分十分丰富，且具有保健功能，产品可加工成盐渍、干制品等，是深受人们喜爱的绿色保健食品，同时也是出口创汇的主要野生蔬菜之一。近年来由于过度采集，资源遭到破坏，产量锐减，因此，探索人工培养蕨苗的方法及快速繁育技术，以解决人工栽培中蕨苗供应困难的问题，无论对满足人们需要及保护蕨菜资源和生态环境都具有重要意义。
人工繁殖一般采用无性繁殖的方法，即在早春或晚秋在野生蕨菜地挖取地下根茎，在春季或秋季进行移栽，不但繁殖系数低，运输不便，且挖掘根茎既费工费时又对地表植被产生破坏，造成水土流失，使蕨菜资源和生态环境受到破坏，因此采用有性繁殖即孢子繁殖是扩大蕨类植物繁殖有效途径，已引起人们的重视。
孢子直播具有取材方便，成苗量大，成本低等优点，但是由于孢子萌发的温、湿度与真菌孢子萌发的适宜条件类似，导致播种失败。人工蕨菜孢子培养成苗目前只有少量报道，张金文等(1999)将孢子播种在森林土等基质上，得到孢子体幼苗，但仍存在孢子萌发成苗率低等诸多问题，不能适应大量用苗的需要。近年来，通过孢子组织培养繁殖蕨苗越来越受到重视，但目前关于蕨类植物组织培养的报道并不多，而且大部分集中在观赏蕨类和濒危种类上。赵彦芳等(2000)以幼嫩根状茎险段为外植体，报道了山蕨菜组织培养的研究，但存在外植体材料质量的审定困难，移栽成活率低等问题，已在成活率仅在40％左右。华中农大陈龙清等(2000)对荚果蕨孢子进行无菌培养，但需要时间较长，一般从孢子萌发到诱导出孢子体需要约1年的时间。而猴腿蹄盖蕨的组织培养尚未见报道。采用组织培养的方法繁殖猴腿蹄盖蕨，既不破坏资源，又利于其大量繁殖，为保护种质资源和大规模栽培利用提供了一条可行途径。
发明内容
本发明提供了猴腿蹄盖蕨孢子组织培养的培养基配方和快速繁殖方法，可在短时间内得到大量的组培苗。
本发明的技术关键是从调整培养基中盐的含量及植物生长调节剂的种类和含量入手，经2年多反复多次试验，筛选出了用于猴腿蹄盖蕨孢子组织培养的系列培养基配方(包括播种培养基、分化培养基、增殖培养基和生根培养基)。使猴腿蹄盖蕨组织培养获得成功，可以得到大量组培苗。
本发明所用的培养基的大量元素为传统MS培养基用量的1/2，微量元素与MS培养基用量相同；植物生长调节剂有GA3(赤霉素)，6-BA(6-苄基氨基嘌呤)，NAA(奈乙酸)等，植物生长调节剂的含量如下GA35～30mg/L，6-BA0.5～2mg/L，NAA0.1～0.5mg/L。其他成分包括食用白糖，琼脂，活性炭。
具体培养基配方如下a.播种培养基1/2MS+6-BA0.5～1mg·L-1(单位下同)+NAA0.1+0～3g·L-1活性炭；b.原叶体增殖培养基1/2MS+6-BA0.5～1+NAA0.1～0.5+0～3g·L-1活性炭；c.孢子体诱导培养基1/2MS+GA35～20+NAA0.1～0.5+0～3g·L-1活性炭；d.孢子体继代培养基1/2MS+6-BA0.5～1+NAA0.1～1+0～3g·L-1活性炭；e.生根培养基1/2MS+NAA0.1～0.5。
以上培养基均附加3％白糖，0.65％琼脂，PH5.5～5.8。
活性炭并非必须物质，但实验证明播种在附加活性炭的1/2 MS培养基上的孢子比MS培养基提前3～4周萌发，在增殖和继代培养基中添加活性炭，可使培养物生长更旺盛。利用本发明可以在6～8个月内，获得具有完整根茎叶的猴腿蹄盖蕨的组培苗，具有完整根茎叶的组培苗，移栽成活率可达到90％以上。
具体实施例方式
适宜培养温度15～28℃，光照时间8～10h·d-1，光照度1500～2000lx。
1、无菌材料的获得将成熟的孢子包在滤纸内，用70％酒精浸泡30s，无菌水冲洗3～5遍，再用0.1％升汞液消毒5～8min，无菌水冲洗3～5遍，备用。
2、孢子接种及原叶体生长将无菌的孢子分散于适量无菌水中，用滴管吸取孢子水溶液，将孢子溶液滴在a培养基上，每次吸孢子溶液时要先将溶液混合均匀，每瓶滴3～5滴。2～3周后，在培养基上可见绿色小点，表明孢子已经萌发。三周左右可见心形原叶体。在加入活性炭的培养基中，孢子萌发及原叶体生长速度比不含碳的培养基上生长的快，且长势好，颜色浓绿。
3、原叶体增殖与继代培养孢子萌发后4～8周，可进行继代培养。将原叶体移到b培养基上，即可得到大量的配子体，4～6周可增殖15～20倍。
4、孢子体诱导与增殖原叶体叶片长到3mm左右时，将其转移到c培养基上培养，3周左右可见有孢子体形成。为了得到更多的孢子体，可将其转移到d培养基上进行继代培养，每株孢子体均可大量增殖。未分化的原叶体可继续在c培养基上培养，一段时间后仍可形成孢子体。在孢子体诱导过程中，要注意经常向培养基中喷水，可以促进孢子体形成。
5、生根培养与移栽将分化出的孢子体转移到e培养基上，3～4周左右即可见有根长出，生根率可达90％以上。待孢子体长到3cm左右，根长到2cm左右时，即可将其移到栽培基质中进行驯化。移栽时将试管苗根部培养基洗净，移植到经高温消毒的松针土和细砂(1∶1)混合的基质上，覆上薄膜保湿，湿度保持在90％以上，放到荫凉处，10天后可去掉薄膜，但仍要遮荫保湿，不可放在强光下，移栽成活率可达90％左右。
本发明在中国科学院东北地里与农业生态研究所组织培养室中进行组织培养，在温室中进行组培苗的移栽和锻炼。从孢子播种到诱导出孢子体约需6个月时间，此后，进入孢子体分化生长高峰期，每4～6周继代培养一次，增殖率可达15～20倍，每个100ml三角瓶可分化出孢子体苗100～150株，经过3～4周生根培养后，即可长出具有完整根茎叶的组培苗，年繁殖率可达1∶10000以上，具有较高的经济效益，有利于增加农民收入，减轻农民负担，市场前景好。
另外，本发明的应用可有效地保护植被和野生资源，产生良好的生态效益。
权利要求
1.一种以孢子为外植体的猴腿蹄盖蕨组织培养方法，其特征在于筛选出系列培养基配方，具体配方如下a.播种培养基1/2MS+6-BA0.5～1mg·L-1(单位下同)+NAA0.1+0～3g·L-1活性炭；b.原叶体增殖培养基1/2MS+6-BA0.5～1+NAA0.1～0.5+0～3g·L-1活性炭；c.孢子体诱导培养基1/2MS+GA35～20+NAA0.1～0.5+0～3g·L-1活性炭；d.孢子体继代培养基1/2MS+NAA0.1～1+0～3g·L-1活性炭；e.生根培养基1/2MS+NAA0.1～0.5；以上培养基均附加3％白糖，0.65％琼脂；PH5.5～5.8。
全文摘要
本发明属于生物工程技术领域，是一种以孢子为外植体的猴腿蹄盖蕨组织培养与快速繁殖的方法。本发明包含猴腿蹄盖蕨孢子组织培养的系列培养基(包括播种培养基、分化培养基、增殖培养基和生根培养基)配方和植物生长调节剂的种类和含量，以及操作方法。本发明可在6～8个月内得到猴腿蹄盖蕨的组培苗，生根率可达90％以上，组培苗移栽成活率在90％以上。是一种高效的猴腿蹄盖蕨种苗生产技术，并可大规模生产，每个100ml三角瓶可生产100株左右的蕨苗。本发明的应用，可有效地保护野生资源，具有良好的生态效益。
文档编号A01H4/00GK1720787SQ20041001100
公开日2006年1月18日 申请日期2004年7月23日 优先权日2004年7月23日
发明者王新华, 赵恒田, 沈云霞 申请人:中国科学院东北地理与农业生态研究所