专利名称：小白菜单倍体育种的方法
技术领域：
本发明涉及小白菜育种技术，具体地指一种小白菜单倍体育种的方法，用于快速选育小白菜新品种。
背景技术：
目前，在小白菜育种领域主要采用株系筛选的方法来选育小白菜新纯系。株系筛选法是将符合育种目标的互补型育种材料进行人工剥蕾去雄杂交，获得F1代即杂交一代，再对该F1代进行多代单株自交，并对每代的单株系材料进行经济性状比较，筛选出优良的单株进行下一代的单株自交，从而选育出基本符合要求的小白菜新纯系。株系筛选法虽然可以选育出综合经济性状较好的小白菜常规新品种和杂交组合，但该方法仍存在如下缺陷其一，由于小白菜的染色体数为10对，在不考虑互换和易位重组因素的情况下，可以将每条染色体视作一个遗传连锁体，其自交后代的纯合率仅为2-10即1/1024，这样其任何一个株群中绝大多数均为杂合体，而纯合体非常稀少，且很难鉴别纯合体和杂合体，从而大幅增加了小白菜新品种选育的难度；其二，在小白菜品种的选育过程中，田间表现型优良的单株大多数杂合程度高，而大多数纯合程度高的单株田间表现型较差，这样纯合程度高的植株反而容易被淘汰，导致优良性状丢失，难以获得最优组合型的纯系品种；其三，小白菜杂交后代的自交衰退现象十分严重，使其育成纯系品种的过程漫长，育种工作效率十分低下。
发明内容
本发明的目的就是要克服现有小白菜育种手段进程漫长效率低下的不足，提供一种快速选育小白菜新品种的方法，即小白菜单倍体育种的方法。
为实现此目的，本发明在深入研究小白菜小孢子发育生物学特性的基础上，提出了小白菜单倍体育种的方法，该方法利用小白菜花药单倍体培养技术，同时结合现有的雄性不育系选育技术，来完成小白菜优良纯系的快速选育。该方法包括如下步骤1)外植体制备选择符合育种目标的互补型育种材料剥蕾去雄杂交，获得小白菜的杂交后代，播种其杂交后代，待抽苔开花后取其花药作为外植体；2)单倍体诱导将作为外植体的花药接种于小白菜单倍体诱导培养基上，在温度为33～38℃的条件下暗培养1～2天，然后将其转入温度为20～28℃的条件下暗培养至单倍体胚状体出现为止；3)再生培养将所培养出的单倍体胚状体置于温度为20～28℃的条件下光培养，在单倍体胚状体绿化后转移到小白菜生芽培养基上，此后每25～30天继代一次，当五日滑均温低于28℃时将已分化出芽眼的单倍体再生苗转入到小白菜生根培养基中继续发育；4)大田移植与染色体加倍将根系发育良好的单倍体再生苗移入大田栽培，当长出3～5片真叶时取其叶片下表皮镜检，确定其染色体倍性，对未发生染色体自然加倍的单株进行人工染色体加倍；5)隔离授粉当大田里的单倍体再生苗抽苔后，将其分单株套袋自交，分单株采集种籽；6)经济性状筛选对单株套袋自交所获得的种籽，各取少量于育种目标季节播种，观察并筛选出综合经济性状优良的纯系；7)后期育种程序用于常规新品种选育的，取上述综合经济性状优良的纯系，扩大繁殖，即可获得小白菜新优品种；用于杂交新品种选育的，取上述综合经济性状优良的纯系，人工剥蕾去雄配制杂交组合，所获杂交后代播种后进行组合力测定，取特殊配合力强的纯系，与其近缘不育系进行多代回交，选育出相应的不育系，大量繁殖上述优良组合的不育系和用作父本系的纯系，即可获得小白菜新优杂交品种。
在上述步骤2)中，小白菜单倍体诱导培养基的组份和配比对单倍体胚状体的出胚率至关重要，经多次实验表明有较好出胚率的小白菜单倍体诱导培养基的pH值为5.8～6.0，组份和配比为
组份浓度mg/L(NH4)2SO480.00～200.00CaCl2·2H2O 500.00～1000.00KNO31800.00～3000.00KH2PO4150.00～1900.00MgSO4·7H2O 185.00～740.00FeSO4·7H2O 27.80Na2-EDTA 37.30CoCl2·8H2O 0.025CuSO4·5H2O 0.025H3BO310.00KI 0.75MnSO4·4H2O 10.00ZnSO4·4H2O 1.25NaMoO40.25肌醇0.00～100.00烟酸1.00叶酸1.00VB12.00～10.00VB61.00甘氨酸 1.00生物素 1.00丝氨酸 30.00谷氨酰胺100.00～1000.00谷胱甘肽5.00活性炭 500.00蔗糖100000.00琼酯粉 8000.00本发明的优点在于与现有获得新纯系的常规杂交育种技术体系相比，本发明在选育小白菜新品种的过程中避免了杂合体的产生，大大加快纯系形成的速度，从而实现了快速育种的目的。我们可以就此进行如下的理论分析1.对于一对等位基因，其杂合体在自交和单倍体培养条件下分离情况如下(1)自交分离
F1代Aa↓F1代配子体分离情况 1A:1aF2代组合型分离情况 1AA:2Aa:1aa(纯合体占50％＝2-1)配子体基因型数为21＝2(2)单倍体培养后的基因分离情况F1代 Aa↓F1代配子体分离情况1A:1a单倍体培养物分离情况 1AA:1aa(纯合体占100％＝1-1)配子体基因型数为21＝22.对于两对独立遗传的等位基因，其杂合体在自交和单倍体培养条件下分离情况如下(1)自交分离F1代 AaBb↓F1代配子体分离情况 1AB:1Ab:1aB:1abF2代组合型分离情况AB Ab aB abABAABB*AABbAaBBAaBbAbAABbAAbb*AaBbAabbaBAaBBAaBbaaBB*aaBbabAaBbAabbaaBbaabb*其中纯合体占4/16＝1/4＝2-2，配子体基因型数为22＝4注打*的组合型为纯合体(2)单倍体培养后的基因分离情况F1代 AaBb↓F1代配子体的分离情况 1AB:1Ab:1aB:1ab单倍体培养物的分离情况1AABB:1AAbb:1aaBB:1aabb其中纯合体占100％＝1-2，配子体基因型数为22＝43.对于n对独立遗传的等位基因，其极端杂合体F1代自交产生的配子体组合型数为2n，F1代自交产生的F2代纯合率为2-n，F1代经单倍体培养后纯合率为1-n＝100％4.小白菜有10对染色体，在不考虑互换和易位重组因素的情况下，可以将每条染色体视作一个遗传连锁体，一个杂交组合在自交和单倍体培养条件下，其分离情况如下(1)自交分离配子体基因型数为210＝1024自交F2代纯合率为2-10＝1/1024(2)单倍体培养条件下配子体基因型数为210＝1024双单倍体集合体纯合率为1-10＝100％综上所述，采用小白菜花药单倍体培养技术育种避免了授精过程，从而避免了杂合体的出现，简化了杂合体的纯合程序，极大地缩短了育种周期，提高了育种工作的效率。
具体实施例方式
以下结合具体实施例对本发明所述的小白菜单倍体育种的方法作进一步的详细描述，该方法包括如下步骤1)外植体制备根据育种目标的不同，外植体的制备上亦有所差异用于常规新品种或杂交新品种父本系选育的，选择符合育种目标的互补型育种材料剥蕾去雄杂交，获得杂交一代，分期播种其杂交一代，待抽苔开花后取其花药作为外植体。用于雄性不育系即杂交新品种母本系选育的，选择符合育种目标的现有雄性不育保持系与相应的互补型育种材料剥蕾去雄杂交，获得杂交一代。将该杂交一代播种后进行自交得杂交二代。将该杂交二代播种后分单株自交得杂交三代株系，同时分单株与另外的不育株成对测交，以检查相应杂交三代株系的雄性不育保持率。分期播种保持率100％的杂交三代株系，待抽苔开花后取其花药作为外植体。
2)单倍体诱导于早晨8:00～下午15:00摘取花蕾，经70～75％酒精浸泡30秒、0.1％HgCl2溶液浸泡3～12分钟，再用无菌水冲洗3次，每次3～4分钟。完成上述表面消毒处理程序后，切剥花药作为外植体接种于小白菜单倍体诱导培养基上，在温度为35℃的条件下暗培养1天，然后将其转入温度为25℃的条件下暗培养至出现单倍体胚状体。满足最佳出胚率的小白菜单倍体诱导培养基的pH值可控制在5.8～6.0之间，其最佳组份和配比为组份 浓度mg/L(NH4)2SO4150.00
CaCl2·2H2O 750.00KNO32000.00KH2PO4180.00MgSO4·7H2O 370.00FeSO4·7H2O 27.80Na2-EDTA 37.30CoCl2·8H2O 0.025CuSO4·5H2O 0.025H3BO310.00KI 0.75MnSO4·4H2O 10.00ZnSO4·4H2O 1.25NaMoO40.25肌醇60.00烟酸1.00叶酸1.00VB110.00VB61.00甘氨酸 1.00生物素 1.00丝氨酸 30.00谷氨酰胺500.00谷胱甘肽5.00活性炭 500.00蔗糖100000.00琼酯粉 8000.003)再生培养将所培养出的单倍体胚状体置于温度为23～27℃的条件下光培养，在单倍体胚状体绿化后转移到小白菜生芽培养基上，对于单药成堆出胚的，一经发现，首先进行分散培养，在未绿化的情况下转移到小白菜生芽培养基上，否则其营养吸收不良，胚状体的发育将受到较大的影响。此后每25天继代一次，若某个胚状体上出现丛芽，则要进行切割继代。当五日滑均温低于28℃时，将已分化出芽眼的单倍体再生苗转入到小白菜生根培养基中继续发育。小白菜生芽、生根培养基的pH值一般控制在5.5～5.6之间，其对生芽、生根作用较佳的组份和配比为组份浓度mg/LNH4NO3825.00KNO3 950.00CaCl2·2H2O 110.00～440.00KH2PO4170.00MgSO4·7H2O 185.00～370.00FeSO4·7H2O 27.80Na2-EDTA 37.30CoCl2·8H2O 0.025CuSO4·5H2O 0.025H3BO48.00KI 0.75MnSO4·H2O10.00NaMoO4·2H20.25ZnSO4·H2O1.25肌醇25.00～100.00烟酸1.00VB110.00VB61.00活性炭 500.00蔗糖2000.00琼酯8000.00其中小白菜生芽培养基另加有6-BA0.2～1.0mg/L小白菜生根培养基另加有NAA 0.2～1.0mg/L4)大田移植与染色体加倍将根系发育良好的单倍体再生苗移出培养室，揭去培养瓶封口膜，置于室温下炼苗48小时，然后取出单倍体再生苗，洗净根系上附着的培养基，假植于大棚内，大棚顶上履以棚膜和遮阳网。假植完后再盖上小拱棚，并根据外界温度情况斟情盖上农膜或遮阳网，并逐日加大通风量。一星期后揭去小拱棚，按管理小白菜实生苗的方法进行田间管理。当其成活长出3～5片真叶时，取其叶片下表皮镜检，确定其染色体倍性，对在再生培养阶段未发生染色体自然加倍的单株，用0.4％的秋水仙碱液处理其生长点48小时，进行人工染色体加倍。
5)隔离授粉当大田里的单倍体再生苗在苗床中长到8～10片真叶时，移入留种网室，常规田间管理，抽苔后将其分单株套袋自交，分单株采集种籽。
6)经济性状筛选对单株套袋自交所获得的种籽，各取三分之一于育种目标季节播种，观察并筛选出综合经济性状优良的纯系。
7)后期育种程序用于常规新品种选育的，取上述综合经济性状优良的纯系，扩大繁殖，即可获得小白菜新优品种，直接示范推广。用于杂交新品种选育的，取上述综合经济性状优良的纯系，人工剥蕾去雄配制杂交组合，所获杂交后代播种后进行组合力测定。取满足育种目标的特殊配合力强的纯系，与其近缘不育系进行5～8代的回交，选育出相应的雄性不育系。大量繁殖上述优良组合的雄性不育系和用作父本系的纯系，即可获得小白菜新优杂交品种，用于商品化生产。
权利要求
1.一种小白菜单倍体育种的方法，其特征在于该方法包括如下步骤1)外植体制备选择符合育种目标的互补型育种材料剥蕾去雄杂交，获得小白菜的杂交后代，播种其杂交后代，待抽苔开花后取其花药作为外植体；2)单倍体诱导将作为外植体的花药接种于小白菜单倍体诱导培养基上，在温度为33～38℃的条件下暗培养1～2天，然后将其转入温度为20～28℃的条件下暗培养至单倍体胚状体出现为止；3)再生培养将所培养出的单倍体胚状体置于温度为20～28℃的条件下光培养，在单倍体胚状体绿化后转移到小白菜生芽培养基上，此后每25～30天继代一次，当五日滑均温低于28℃时，将已分化出芽眼的单倍体再生苗转入到小白菜生根培养基中继续发育；4)大田移植与染色体加倍将根系发育良好的单倍体再生苗移入大田栽培，当长出3～5片真叶时取其叶片下表皮镜检，确定其染色体倍性，对未发生染色体自然加倍的单株进行人工染色体加倍；5)隔离授粉当大田里的单倍体再生苗抽苔后，将其分单株套袋自交，分单株采集种籽；6)经济性状筛选对单株套袋自交所获得的种籽，各取少量于育种目标季节播种，观察并筛选出综合经济性状优良的纯系；7)后期育种程序用于常规新品种选育的，取上述综合经济性状优良的纯系，扩大繁殖，即可获得小白菜新优品系；用于杂交新品种选育的，取上述综合经济性状优良的纯系，人工剥蕾去雄配制杂交组合，所获杂交后代播种后进行组合力测定，取特殊配合力强的纯系，与其近缘不育系进行多代回交，选育出相应的不育系，大量繁殖上述优良组合的不育系和用作父本系的纯系，即可获得小白菜新优杂交品种。
2.根据权利要求1所述的小白菜单倍体育种的方法，其特征在于所说的步骤2)中，小白菜单倍体诱导培养基的pH值为5.8～6.0，其组份和配比为组份 浓度mg/L(NH4)2SO480.00～200.00CaCl2·2H2O 500.00～1000.00KNO31800.00～3000.00KH2PO4150.00～1900.00MgSO4·7H2O 185.00～740.00FeSO4·7H2O 27.80Na2-EDTA 37.30CoCl2·8H2O 0.025CuSO4·5H2O 0.025H3BO310.00KI 0.75MnSO4·4H2O 10.00ZnSO4·4H2O 1.25NaMoO40.25肌醇 0.00～100.00烟酸 1.00叶酸 1.00VB12.00～10.00VB61.00甘氨酸 1.00生物素 1.00丝氨酸 30.00谷氨酰胺 100.00～1000.00谷胱甘肽 5.00活性炭 500.00蔗糖 100000.00琼酯粉 8000.00
3.根据权利要求1所述的小白菜单倍体育种的方法，其特征在于所说的步骤2)中，小白菜单倍体诱导培养基的p H值为5.8～6.0，其组份和配比为组份 浓度mg/L(NH4)2SO4150.00CaCl2·2H2O 750.00KNO32000.00KH2PO4180.00MgSO4·7H2O370.00FeSO4·7H2O27.80Na2-EDTA37.30CoCl2·8H2O0.025CuSO4·5H2O0.025H3BO310.00KI0.75MnSO4·4H2O10.00ZnSO4·4H2O1.25NaMoO40.25肌醇 60.00烟酸 1.00叶酸 1.00VB110.00VB61.00甘氨酸1.00生物素1.00丝氨酸30.00谷氨酰胺 500.00谷胱甘肽 5.00活性炭500.00蔗糖 100000.00琼酯粉8000.00
4.根据权利要求1或2或3所述的小白菜单倍体育种的方法，其特征在于所说的步骤3)中，小白菜生芽、生根培养基的pH值为5.5～5.6，其组份和配比为组份 浓度mg/LNH4NO3825.00KNO3 950.00CaCl2·2H2O110.00～440.00KH2PO4170.00MgSO4·7H2O185.00～370.00FeSO4·7H2O27.80Na2-EDTA 37.30CoCl2·8H2O 0.025CuSO4·5H2O 0.025H3BO48.00KI 0.75MnSO4·H2O 10.00NaMoO4·2H20.25ZnSO4·H2O 1.25肌醇 25.00～100.00烟酸 1.00VB110.00VB61.00活性炭 500.00蔗糖 2000.00琼酯 8000.00其中小白菜生芽培养基另加有6-BA0.2～1.0mg/L小白菜生根培养基另加有NAA 0.2～1.0mg/L
全文摘要
本发明公开了一种小白菜单倍体育种的方法，即一种快速选育小白菜新品种的方法，主要解决现有小白菜育种手段进程漫长效率低下的不足。该育种方法通过对小白菜的花药进行离体培养，获得由雄性配子体细胞发育而来的单倍体胚状体，然后对单倍体胚状体进行再生培养、染色体加倍、以及隔离授粉，从而获得一系列不同遗传型的纯系，再对这些纯系进行田间性状比较，筛选出其中的优良纯系，用作常规新品系或杂交亲本。该育种方法避免了小白菜植株的授精过程，从而避免了杂合体的出现，简化了杂合体的纯合程序，大幅缩短了育种进程，提高了育种的效率。
文档编号A01H1/02GK1723768SQ20041006061
公开日2006年1月25日 申请日期2004年7月22日 优先权日2004年7月22日
发明者梅时勇, 邱正明, 聂启军 申请人:湖北鄂蔬农业科技有限公司