专利名称：鉴别显著影响猪背膘厚性状的硬脂酰辅酶a去饱和酶基因单核苷酸多态位点及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一个鉴别显著影响猪背膘厚性状、可用于种猪遗传改良的硬脂酰辅酶A去饱和酶基因单核苷酸多态位点。
背景技术：
硬脂酰辅酶A去饱和酶(Stearoyl-CoA desaturase，SCD)是合成单不饱和脂肪酸的限速酶(rate-limiting enzyme)，它位于内质网中，主要催化饱和性脂肪酸一硬脂酰辅酶A(C16:0)和棕榈酰辅酶A(C18:0)在第9和10碳原子间导入氢键，分别形成单不饱和脂肪酸—油酸(16:1)和棕榈酸(C18:1)。
由于细胞内饱和性脂肪酸与不饱和性脂肪酸的比例显著影响着细胞膜的流体性(membrane fluidity)，进而影响信号传导，因而在人和小鼠中SCD酶活性的改变与高血压、神经性疾病、免疫失调和癌症等疾病密切关联。此外，SCD基因影响肥胖度。SCD基因缺失型小鼠(SCD-/-)尽管在高能量饲粮条件下增加了采食，体脂的沉积却大大减少。瘦蛋白(leptin)缺失型小鼠(ob/ob)表现出极度肥胖的表型，而将ob/ob小鼠与SCD-/-小鼠杂交，形成的SCD和瘦体素Leptin基因双缺失小鼠(ob/ob，SCD-/-)肥胖的表型消失。Cohen等通过基因表达芯片技术揭示出SCD是Leptin信号调控通路中一个重要成分，Leptin在抑制动物进食的同时，通过阻抑SCD基因的表达，促进了机体的能量代谢，进而使体重减轻，体脂沉积减少。当SCD基因的表达被阻抑时，胞内饱和性脂肪酸的含量上升，抑制己酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase，ACC)的活性，阻止丙二酰辅酶A(Malonyl CoA)的形成。丙二酰辅酶A阻抑着胞间游离脂肪酸向线粒体运输，进行氧化反应。因而，SCD酶活性下降可促进脂肪酸的氧化分解。这些研究表明SCD是调控脂肪代谢的一种关键酶，SCD基因是研究哺乳动物脂肪沉积性状的理想侯选基因之一。
近几年来，SCD基因相继在小鼠、人、山羊、绵羊、牛等哺乳动物中被定位、分离和鉴别。目前在小鼠中克隆了五种SCD基因，具有组织表达特异性。SCD功能基因定位于人10号染色体上，在17号染色体上存在一个假基因。绵羊和山羊的SCD基因定位于22q21。Taniguchi等在牛SCD基因开放阅读框架(ORF)中鉴别到3个SNPs位点，其中一个错义突变导致所编码的氨基酸由缬氨酸突变为丙氨酸。日本褐牛(Japanese Black Cattle)在此三个位点上表现为两类单倍型(A和B型)，其中A型个体肌内脂肪的单不饱和脂肪酸含量显著高于B型个体，熔点却低于B型个体(P＜0.001)[5]。申请者开展了猪SCD基因的精细定位、分离、克隆、SNP多态位点的鉴别及其影响脂肪沉积性状的研究，以期为种猪脂肪沉积性状的选育改良提供新的分子育种的手段。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一个鉴别显著影响猪背膘厚性状的硬脂酰辅酶A去饱和酶基因单核苷酸多态位点，通过现代分子生物学技术检测该多态位点，利用标记辅助选择(MAS)选择有利的等位基因型个体留种，可以显著改善种群背膘厚性状，提高瘦肉产出率。
本发明的第二个目的是硬脂酰辅酶A去饱和酶基因单核苷酸多态位点在选育改良种猪中的应用。
本发明的第一个目的是这样实现的(1)、细菌人工染色体(PAC)文库的筛选申请者根据人、羊SCD基因的同源区域及猪EST(表达序列标签)序列设计引物对1(F5’-ATC CGA GAG CCA AGATGC C-3’；R5’-ATG GTA GTG GTG GTT GTG TAG-3’)，扩增含完整第一内含子的591bp DNA(脱氧核糖核酸)片段。经DNA测序后，再次设计猪SCD基因特异性引物对2(5’-CAC AAC TAC CAC CAC ACC-3’；R5’-GTC ATA AGC CAG ACC CAG-3’)，利用该对引物筛选猪PAC基因组DNA文库，获得含全长SCD基因、插入片段长100kb的单个PAC阳性克隆(TAIGP714K1477)；(2)、猪全长SCD基因的克隆阳性PAC克隆DNA经AccI，BamHI，HindIII，KpnI，PntI，SacI和XbaI限制性酶切后，与引物对1和2的扩增产物杂交，选取有杂交信号的限制性片段，将其克隆至pGEM-4Z载体，采用重叠群(contig)构建和亚克隆测序技术，获得了20985bp的SCD基因全长DNA序列(GenBank序列号.AY487830)；(3)、猪全长SCD基因mRNA(信使核糖核酸)的分离利用Trizaol试剂提取肝脏总RNA，采用Super SMARTTMPCR cDNA Synthesis Kit试剂盒合成全长cDNA。通过5’RACE(Rapid Amplification of cDNA End，快速扩增cDNA末端)和3’RACE技术，分离了猪SCD基因全长5034bp的cDNA序列(GenBank序列号.AY487830)，由此鉴别了猪SCD基因的详细结构。5’RACE的引物为5’-ATG GCGTAA CGA AGA AAG GTG-3’；3’RACE的引物为Outer primer，5’-CGA TGT CAAGGT TAC ACG GGT GG-3’；Inner primer，5’-GTG CCA CTG ACT TGC TAT GTG ACC-3’；(4)、外显子2上SNP C3101T的鉴别根据猪SCD基因的全长DNA序列，设计引物对3(F5’-GCA CTT CCA CTC TCT TTC-3’；R5’-GCT GGT GTT TCT ACTCTG-3’)，该对引物的395bp扩增片段包括整个外显子2。以中国二花脸猪×白色杜洛克猪资源家系群体的20个始祖个体(2个白色杜洛克个体，18个二花脸个体)DNA为模板，利用引物对3进行PCR扩增，将PCR产物纯化后，直接测序，比较不同个体的测序结果，鉴别到在第3101号核苷酸(若根据SCD基因开放阅读框、从起始密码子算起，则为第641号核苷酸)存在一个由胞嘧啶(C)突变为胸腺嘧啶(T)的多态性，即SNP C3101T位点，该位点为1tctagaccct ttgaatttcc acttaaattt tagaatctgc ttgtctattt cctcaaagaa61 atctgttgga tttctatagt gattaaatta atctatagat caacactgag tctgtccatt121 tatgaacaca gaatataaca aattcttttt ttctctctat ttaagagttt taaagttttt181 ctcagcattg ttttgatact ttcagtgtag ctatcctata aacatttaga tttattcttt241 gtgacatttt tgatgttctt ttaatttttg tttttttagg gccgcacctg tggcacatga381 agttcctggg ccaggggtcg aatcagagcc aaagctacca gcctatacca ccaccatagc361 aacgccaggt ctggaccgca tctgtgatgt acgccggagc tcgtgacaat gccagatcct421 taacccactg agcaaggcca gcatgtaacc cacaacctcg tggacactag tcgagttctt481 aacccgctga gccacaagga gaactccatt tttgatgcta ttttaaacag tatattttaa541 atttcattct gcaattgttt tttaatagaa tataggacag aataattttt ttatactggt601 ttctatcttg acctttctaa attcacttac caattttgac acttttttgg tggtagattc661 tatacatttt tcatacacac agttaggtct tctgcaaata ataacagttt ctttcttctt721 ttcctatctt tatatctttc atttcttttt tcctgtccat catgcaacct aggatttcta781 gcacaatgtt gactagaaat ggtagacgat tatatgcttg cctgttctct taaggggaaa841 tttttttttt ttttttttgg tctttttaag cctgcaccca tggctaggaa ctgtagctgc901 tggcctatgc cacagccaca gcaacactgg atccgaactg tatctgtgac ctacaccaca961 gctcatggct atgccagatc cttaacccac tgagcgaggc cagggatcga accctcgacc1021 tcacggttcc tagtcggatt cgtctccgct gcgccacaac gggaactccc acgactaatg1081 attaagtaaa atgattcttg tggactgact tgcctaataa ttctatagct gatagctatt1141 tttgtcccac ttacaagtcc ttttgcctgc ttctggatga aggcacacgc tgcgcttcct1201 cccttttctc atgaaagcca ttccaaaatt acaactcgac aatctgaaga atttccaaaa1261 catcccgcac acgttcgggg tggggggggg gcgtgggcac aaggacggga tcgctcactg1321 gtgcctggcg gcgaacgtcc cctgctgggc ttgcctagta gctgaacgcc gtgcgcgcgt1381 gcaggtccac acatctatct atgcatctac gtgtgtgtac acggctgccg gcctggagac1441 cggcgagttc agcagtacgc atctatcgcc ccgccgccag tgggcggcgc agagccattg1501 ttccgccgcc ggccgaccct cagcccctgc ggcacgcgcg ttcgtcacgg agggaggtgg1561 ggcttcgccg ggcccccggc ccccaacccg gggtttgaag gcacgtctcc ccctcccacg1621 cgtctccgcg agctagaagg cgggagtgga gttgtgcgta gcggtcgccc gcgcggcttc1681 acccacactt tccccggaaa cttccctagt gcccatcctt tcgcgaagtg ccccagggcc1741 agtcctgggc tagcacccac ctcccacccc cctactgagt cctcttcctc ttccagggaa1801 gacgctctcg agcgcctccg aggaggcagg acgccgggca gaagcccagc ggccggtgga1861 agagaagctg aggaggagaa agggagggga gggggagtga ggagctcgcg gcagagggaa1921 cagcagattg cgccgagcca atggcaacgg caggacgagg tggcaccaaa ttcccttcgg1981 ccaatgacgc gccagagtct acagaagccc attagcattt ccccaggggc aggggcagag2041 gcaggggctg cggagaccga gccgcggagt gtctgcagca tccagttttt gcgtctccgg2101 cccccagcaa gccccggctc tctgtctcct cccctctccc gcccatgcgg ttctcccacg2161 gtgagccaac tctgcgcact ttgccccttc ttggcagcga ataaaagggg tcagaggaaa2221 tacaggatac ggtcgcccac tgccagctct agcctttaaa tacccagcct ggggagaccc2281 acgcacagca ggtcgggtgc agacaccgac ccaacgtgca gcaaagggtt ccgagcgcag2341 catcgctgat ctccgcgcaa gagccggctc cagcactagt ctacgctcag tgcggtctgc2401 cacgaactcc tccctgaagt ctcatccctg ggaaagtgat cccaacgtcc gagagcccag2461 atgccggccc acttgctgca agaggaggtg agtttccaag taatggcccc cagaccgcgg
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本发明的第二个目的是这样实现的本发明利用这个多态位点及侧翼DNA序列信息，采用分子生物技术鉴别个体基因型，针对脂肪沉积性状选育改良种猪。
本发明鉴别了一个影响猪背膘厚性状的硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)基因单核苷酸多态性(SNP)位点，通过现代分子生物学技术检测该多态位点，利用标记辅助选择(MAS)选择有利的等位基因型个体留种，可以显著改善种猪群体背膘厚性状，提高瘦肉产出率。
图1为本发明鉴别的猪SCD基因SNP C3101T位点的PCR-TaiI-RFLP判型图，其中2、3、5、6、7、9、10、11、12、13号个体为CC型，14号个体为TT型，1、4、8个体为TC型。
具体实施例方式
下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。
选择种猪核心群个体，采用上述的PCR-TaiI-RFLP法鉴别SCD基因SNPC3101T位点的基因型，选择有利等位基因型个体留种，群体继代选育后改良种群的脂肪沉积性能。
实施例利用自身构建的、以白色杜洛克和中国二花脸猪为祖代亲本、用于功能基因定位的猪资源家系为实验动物。132头资源家系第二代(F2代)公猪个体46天断奶，阉割后，在保育栏养至120天，日粮营养水平为21％粗蛋白、3300 KJ消化能、1.25％赖氨酸；然后转送测定站，每栏关10-12头猪，采用自由采食饲养方式，日粮营养水平为16％粗蛋白、3100KJ消化能、0.78％赖氨酸。采用ACEMA64电子喂料自动识别系统(ACEMO，Pontivy Cedex，France)测定记录日采食量、饲料转化率等性状。在240日龄时将测定个体屠宰，测定记录240日龄体重时的肩部、第6-7肋骨、最后肋骨及髋关节处的四点背膘厚，腹部脂肪重，板油重，花油重等脂肪沉积性状。
采用上述PCR-TaiI-RFLP法对132头F2个体进行SNP C3101T基因型判定，采用SAS软件包(version 8.2，SAS Inc.，2001)的FREQ程序、GLM统计模型分析该位点的遗传变异与脂肪沉积性状的相关性。统计模型中以基因型为固定效应、胴体重为协变量。统计结果如表1所示，从中可见，该位点与背膘厚性状显著相关，CC型与TC型个体在第6-7肋骨背膘厚、最后肋骨背膘厚及四点均膘厚差异显著(P＜0.05)，CC型个体的背膘更薄，是瘦肉型猪的选育改良所需的基因型个体。在商业种猪核心群中，继代选育CC型个体，可以进一步改良种群的背膘厚性状，提高瘦肉产出率。
表1自身淬灭引物和其它荧光探针技术的比较
本发明所述试剂盒利用自身淬灭引物技术检测分泌物中淋病奈瑟菌，并经检测淋病患者标本，获得了很好的检测效果，该试剂盒能够准确、灵敏、快速检测淋病奈瑟菌，并能够极大地降低成本。
以下结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。
图1为自身淬灭引物荧光强度变化的原理图，其中横坐标代表自身淬灭引物构象，纵坐标代表相对荧光强度。该图表明，随着自身淬灭引物构象的变化，相对荧光强度逐渐增强。
图2为将本发明试剂盒阳性标准模板进行梯度稀释后，实施荧光定量PCR所得荧光曲线，横坐标代表循环数，纵坐标代表相对荧光强度，图中平行于横坐标的直线代表荧光阈值。
图3为将本发明试剂盒阳性标准模板进行梯度稀释后，实施荧光定量PCR所得标准曲线，横坐标代表不同稀释度阳性标准模板的浓度，纵坐标代表荧光阈值。
权利要求
1.一个鉴别显著影响猪背膘厚性状的硬脂酰辅酶A去饱和酶基因单核苷酸多态位点，其特征在于该多态位点序列如下1 tctagaccct ttgaatttcc acttaaattt tagaatctgc ttgtctattt cctcaaagaa61 atctgttgga tttctatagt gattaaatta atctatagat caacactgag tctgtccatt121 tatgaacaca gaatataaca aattcttttt ttctctctat ttaagagttt taaagttttt181 ctcagcattg ttttgatact ttcagtgtag ctatcctata aacatttaga tttattcttt241 gtgacatttt tgatgttctt ttaatttttg tttttttagg gccgcacctg tggcacatga301 agttcctggg ccaggggtcg aatcagagcc aaagctacca gcctatacca ccaccatagc361 aacgccaggt ctggaccgca tctgtgatgt acgccggagc tcgtgacaat gccagatcct421 taacccactg agcaaggcca gcatgtaacc cacaacctcg tggacactag tcgagttctt481 aacccgctga gccacaagga gaactccatt tttgatgcta ttttaaacag tatattttaa541 atttcattct gcaattgttt tttaatagaa tataggacag aataattttt ttatactggt601 ttctatcttg acctttctaa attcacttac caattttgac acttttttgg tggtagattc661 tatacatttt tcatacacac agttaggtct tctgcaaata ataacagttt ctttcttctt721 ttcctatctt tatatctttc atttcttttt tcctgtccat catgcaacct aggatttcta781 gcacaatgtt gactagaaat ggtagacgat tatatgcttg cctgttctct taaggggaaa841 tttttttttt ttttttttgg tctttttaag cctgcaccca tggctaggaa ctgtagctgc901 tggcctatgc cacagccaca gcaacactgg atccgaactg tatctgtgac ctacaccaca961 gctcatggct atgccagatc cttaacccac tgagcgaggc cagggatcga accctcgacc1021 tcacggttcc tagtcggatt cgtctccgct gcgccacaac gggaactccc acgactaatg1081 attaagtaaa atgattcttg tggactgact tgcctaataa ttctatagct gatagctatt1141 tttgtcccac ttacaagtcc ttttgcctgc ttctggatga aggcacacgc tgcgcttcct1201 cccttttctc atgaaagcca ttccaaaatt acaactcgac aatctgaaga atttccaaaa1261 catcccgcac acgttcgggg tggggggggg gcgtgggcac aaggacggga tcgctcactg1321 gtgcctggcg gcgaacgtcc cctgctgggc ttgcctagta gctgaacgcc gtgcgcgcgt1381 gcaggtccac acatctatct atgcatctac gtgtgtgtac acggctgccg gcctggagac1441 cggcgagttc agcagtacgc atctatcgcc ccgccgccag tgggcggcgc agagccattg1501 ttccgccgcc ggccgaccct cagcccctgc ggcacgcgcg ttcgtcacgg agggaggtgg1561 ggcttcgccg ggcccccggc ccccaacccg gggtttgaag gcacgtctcc ccctcccacg1621 cgtctccgcg agctagaagg cgggagtgga gttgtgcgta gcggtcgccc gcgcggcttc1681 acccacactt tccccggaaa cttccctagt gcccatcctt tcgcgaagtg ccccagggcc1741 agtcctgggc tagcacccac ctcccacccc cctactgagt cctcttcctc ttccagggaa1801 gacgctctcg agcgcctccg aggaggcagg acgccgggca gaagcccagc ggccggtgga1861 agagaagctg aggaggagaa agggagggga gggggagtga ggagctcgcg gcagagggaa1921 cagcagattg cgccgagcca atggcaacgg caggacgagg tggcaccaaa ttcccttcgg1981 ccaatgacgc gccagagtct acagaagccc attagcattt ccccaggggc aggggcagag2041 gcaggggctg cggagaccga gccgcggagt gtctgcagca tccagttttt gcgtctccgg2101 cccccagcaa gccccggctc tctgtctcct cccctctccc gcccatgcgg ttctcccacg2161 gtgagccaac tctgcgcact ttgccccttc ttggcagcga ataaaagggg tcagaggaaa2221 tacaggatac ggtcgcccac tgccagctct agcctttaaa tacccagcct ggggagaccc2281 acgcacagca ggtcgggtgc agacaccgac ccaacgtgca gcaaagggtt ccgagcgcag2341 catcgctgat ctccgcgcaa gagccggctc cagcactagt ctacgctcag tgcggtctgc2401 cacgaactcc tccctgaagt ctcatccctg ggaaagtgat cccaacgtcc gagagcccag2461 atgccggccc acttgctgca agaggaggtg agtttccaag taatggcccc cagaccgcgg2521 gctcgccagt gctggttggg cttctaggtg actcggtgta gaagagagtt gagatcgccg2581 aggacagcca cctttttcga gttgtatagt cttcagtttg ttgggaatgt ggattgtaat2641 ttgggaactt agttctccaa cttttgtttc ctaaagcttc aaagaaaaat ctggtggtac2701 ctgtaccctg atgtgtgtag gcatgcgggc tttcctttgt gtgtttgaag gggtgcgagt2761 gttttacccc tctatttccc cttcccctga ggtttcaccc tcctccccaa tttctccgca2821 cagttcctgg ggacttgcgt ctcttccatc taggatagac cttgccctca ggtaacctgg2881 gtattggggc caggtctgtg cctatacccc gcccttcccc cagctagacc agggagtgaa2941 gtggccccta gtgtctccac gtgtcctccc ctctctccca gctctgcact tccactctct3001 ttcagatctc tagctcctac acaaccacca ctaccatcac agcaccttcc tccagggtcc3061 tgcagaatgg agggggcaag ttggagaaga ctccccaata cgtggaagaa gacatccgcc3121 ctgaaatgaa agatgacatc tatgacccaa cctaccagga taaggagggc ccaaggccca3181 agcttgaata tgtttggaga aacatcatcc tcatgagtct gctacacttg ggagccctgt3241 atgggatcat attgatcccc acctgcaaga tatacacctt gctctggggt aagaggtccc3301 cttgtcctcc tgtctcagta tcccaggttc tctccactct tttaatacag tagcaactta3361 cacagagtag aaacaccagc ccctccaggc cgaggttttt ccaaccattt ctcttaggtg3421 ttgtggtggg ctgggaaggg agtctagggg gtttgggatg caggagtgtc gattctgggg3481 cctttaattt gggggggggg ttggagaggg agccctggga ccatgggcca caggctttga3541 agtgagtaga tctgtgccag ggagtcagct tttctgtttc aagtcatttt cttgactgct3601 tgtcccagcc ctgccagcct agaaagaatc aaggccctta cctggatgca tgggaacatg3661 gggctagact agtgtgactt tagagggcac atgctgggta tagtcacggg gtagcaagag3721 aaactactca ggaagagggt taagcagaag aggggggaag agagctgtgg tcatccatga3781 aattattttg ccctgatcct tagccttatc aggctcctta attacacaga cagaggaagg3841 cggctcctgc ataactcatg ttacatggat gtcttgctct gtgactccac gtgggtctcc3901 agggaactgc acatgccact caagaaaatg ttctaatgaa ataaggttaa agaaacgttt3961 cctgccccat tccccaccca tcctgctcca gcccctctcc cctgatgcca ggagtgcctc。
2.硬脂酰辅酶A去饱和酶基因单核苷酸多态位点在脂肪沉积性状选育改良种猪中的应用。
全文摘要
本发明公开了一个鉴别显著影响猪背膘厚性状的硬脂酰辅酶A去饱和酶基因单核苷酸多态位点及应用，它先进行PAC文库的筛选，再经过猪全长SCD基因的克隆、猪全长SCD基因mRNA的分离、外显子2上SNP C3101T的鉴别，最后经过PCR－RFLP法等方法进行SNP C3101T基因型判定。本发明通过现代分子生物学技术检测该多态位点，利用标记辅助选择(MAS)选择有利的等位基因型个体留种，可以显著改善种猪群体背膘厚性状，提高瘦肉产出率。
文档编号A01K67/00GK1680600SQ200510023930
公开日2005年10月12日 申请日期2005年2月5日 优先权日2005年2月5日
发明者黄路生, 任军, 丁能水, 艾华水, 麻骏武, 郭源梅, 陈从英, 高军 申请人:江西农业大学