专利名称：鉴别显著影响断奶仔猪水肿与腹泻抗性的a1,2－岩藻糖转移酶基因单核苷酸多态位点及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一个鉴别显著影响断奶仔猪水肿与腹泻病抗性、可用于种猪遗传改良的a1，2-岩藻糖转移酶基因单核苷酸多态位点。
背景技术：
早期断奶仔猪水肿与腹泻病是困扰当前养猪生产的一大难题，对此疾病的防治方法包括免疫接种、药物、卫生和隔离等，然而这些方法并不总是行之有效，尤其是抗菌素的滥用导致畜产品携带大量残留药物，成为药物食品，对人类的健康产生不良影响。因此寻找一条安全可靠且经济可行的防治途径已是当务之急。
Imberchts等报道肠毒素大肠杆菌F18(Enterotoxigenic escherichia coliF18，ECF18)是引起仔猪断奶后水肿和腹泻病的主要病原菌。ECF18通过其粘附素粘附于仔猪小肠粘膜上皮细胞，产生类肠毒素，类肠毒素通过渗透，引起血管壁损伤，水分大量渗出而导致腹泻和水肿。4～12周龄仔猪因此病原菌感染的发病率为30％～40％，发病仔猪死亡率为40％，有时甚至高达90％，这给养猪业造成了极大的经济损失。
ECF18能否引起仔猪断奶后水肿与腹泻病，在于其进入仔猪小肠后能否在小肠粘膜上皮细胞上粘附并产生类肠毒素，而能否粘附的关键在于小肠粘膜上皮细胞有无ECF18受体。瑞士Vogeli等的研究结果表明，ECF18受体蛋白基因位于猪的16号染色体qll区，与血型抑制因子S及兰定尼受体基因位点(RYR1)紧密连锁，其重组率分别为θ＝0.05％和3.1％。他们采用候选基因法与体外粘附实验发现，a1，2-岩藻糖转移酶(a1，2-fucosytransferase，FUT1)基因是ECF18受体蛋白的理想候选基因，该基因开放阅读框第307个核苷酸处存在一个鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)(M307G-4)，显著影响个体的ECF18抗性。基因型AA为ECF18抗性猪，基因型GG为易感猪，等位基因G对A是显性。但申请人对21个中国地方猪种FUT1 M307G-A位点进行多态性检测，发现中国地方猪种中(临高猪除外)只有易感的GG基因型，而不存在抗性的AA基因型。这提示如果FUT1基因M307G-A位点突变是决定猪小肠上ECF18受体表达与否的唯一因素，绝大部分中国地方猪种(临高猪除外)则均不具备抵抗ECF18的遗传基础。而一般而言，在中国养猪生产实践中，中国地方猪种的仔猪抗水肿与腹泻病的能力普遍强于外来猪种，这与Vogeli等人的报道相悖，由此有必要对FUT1基因做进一步深入的研究。鉴于此，申请人深入开展了猪FUT1基因基因编码区SNPs(Coding-region SNPs，cSNPs)的搜寻、鉴定及其影响仔猪抗水肿与腹泻病性状的研究，以期建立标记辅助选择技术开展断奶仔猪水肿与腹泻病的抗病育种工作。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一个鉴别显著影响断奶仔猪水肿与腹泻病抗性的a1，2-岩藻糖转移酶基因单核苷酸多态位点，通过现代分子生物学技术检测该多态位点，利用标记辅助选择(MAS)选择有利的等位基因型个体留种，可以显著提高种群断奶仔猪的抗水肿与腹泻病能力，大大减少仔猪死亡率。
本发明的第二个目的是a1，2-岩藻糖转移酶基因单核苷酸多态位点在选育改良种猪抗水肿与腹泻病性状中的应用。
本发明的第一个目的是这样实现的(1)单核苷酸多态性(SNP)C228T的鉴别根据Meijerink等公布的猪FUT1全基因序列，该基因只存在一个1048bp的外显子。申请人设计了两对引物即引物对1(F5’-ACC CAG GAG TTC AAA GCCAGA-3’；R5’-CGG GGT AGA CGG AAC TGA CTC-3’)和引物对2(F5’-GAT GTCCGA GGA TTA TGC CCA-3’；R5’-GCA GGG TTT CCT CTG AGT CCA-3’)，分别扩增的726bp和812bp片段相互重叠，覆盖整个外显子。选择10个中外猪种(杜洛克、民猪、二花脸、八眉猪、剑河香猪、临高猪、工布江达藏猪、五指山猪、玉山黑猪及长白猪等)，每个猪种取两个公猪个体的DNA(脱氧核糖核酸)样品为模板进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，扩增产物纯化后直接测序，对测序结果采用公用的SEQMAN软件分析，结果发现，位于猪FUT1基因序列的第836个核苷酸(开放阅读框架的第228个核苷酸)位点，由一个胞嘧啶(C)突变为胸腺嘧啶(T)(M228C-G)，导致相应编码的氨基酸由亮氨酸(脂肪簇氨基酸)替代为苯丙氨酸(芳香簇氨基酸)。氨基酸属性的改变很可能引起蛋白质结构和功能的相应改变，使得a1，2-岩藻糖转移酶活性发生变化，改变小肠上皮细胞对肠毒素大肠杆菌F18(ECF18)吸附性，从而最终导致仔猪抗断奶后水肿与腹泻疾病能力的改变；(2)猪FUT1基因序列的第836个核苷酸(开放阅读框架的第228个核苷酸)位点为1 gatgcgggct gcacttatga ctgggaatct gccacccgcc aggagctcag gtaagtggga61 gatgcggatg cctcggaccc aggagccggg ccttcagtac caggaggcgc acccccaacc121 cctaaccccc tgctacccgc aggtgtctcc tgcgccccga cccccaactc ctgctcctcc
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(3)SNP C228T的判型A.PCR-SSCP(Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP单链构象多态性)法设计引物对3(F5’-CTC TTT TAC AGT GGC TTA G-3’；R5’-CGG GTA AAT AGTCCA GGT C-3’)扩增个体基因组DNA，25μl PCR反应体系中包括50ng基因组DNA，0.25μM引物，0.2μM dNTPs(双脱氧核苷酸)，1单位DNA聚合酶(Taq酶)，1×PCR Buffer(缓冲液)(10mM Tris-HCl pH8.4，50mM KCl，0.1％Triton X-100)，1.5mM MgCl2。Taq酶、dNTPs均购自上海生工。PCR循环参数为95℃ 2min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，34个循环；最后72℃延伸10min。将164bp的PCR产物95℃ 3min变性后，加样于12％的聚丙烯酰胺胶(30ml工作液的配制为12ml 30％丙烯酰胺，3ml 50％甘油，3ml 10×TBE，210μl 10％过硫胺酸，12μl TEMED，加入12ml纯水)，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(120伏，电泳14～16小时)，电泳结束后采用硝酸银染色，并拍照留底。
具体判型方法如附图2所示。
B、AMRS-PCR法(amplificationr efractory mutation system，AMRS，难控制突变位点扩增技术)设计一对内引物4(F5’-ATT CCT GTC CCA AGC ATC CTG CCT ACC-3’；RCGGGTA AAT AGT CCA GGT CCC GGA CAA-3’)，及一对外引物5(F5’-CCA GCC CCG AGGATC TGC TAA TTT CAC T-3’；R5’-AAT CCT CGG ACA TCC AGT CGT GAA GCT C-3’)扩增个体基因组，25μl PCR反应体系中包括5 0ng基因组DNA，0.6μM内引物，0.06μM外引物，0.03mM dNTPs，1单位Taq酶，1×PCR Buffer(10mM Tris-HCl PH8.4，50mM KCl，0.1％Triton X-100)，1.8mM MgCl2。Taq酶、dNTPs均购自上海生工。PCR循环参数为95℃ 2min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 45s，34个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离、溴化乙锭染色拍照留底。
具体判型方法如附图3所示。
本发明的第二个目的是这样实现的本发明利用这个多态位点及侧翼DNA序列信息，采用分子生物技术鉴别个体基因型，针对抗水肿与腹泻病性状选育种猪。
本发明鉴别了一个影响断奶仔猪抗水肿与腹泻病性状的a1，2-岩藻糖转移酶(FUT1)基因单核苷酸多态性(SNP)位点，通过现代分子生物学技术检测该多态位点，利用标记辅助选择(MAS)选择有利的等位基因型个体留种，可以显著提高种群断奶仔猪的抗水肿与腹泻病猪能力，大大减少仔猪死亡率。
图1为本发明鉴别的猪FUT1基因SNP C228T突变位点的序列峰图；图2为SNP C228T位点的PCR-SSCP判型图，其中1，3，4，10，11为CC型；2，5，7，9为TC型；6为TT型；图3为SNP C228T位点的ARMS-PCR判型图，其中1，3，5，6为CC型；4为TC型；7为TT型；2为分子量标记；图4为ECF18ab与刷状缘的黏附检测结果，(a)为不黏附型，(b)为黏附型。
具体实施例方式
下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。
选择种猪核心群个体，利用上述的PCR-SSCP或ARMS-PCR等方法鉴别FUT1SNP C228T位点的基因型，选择有利的等位基因型个体留种，群体继代选育后改良种群的抗仔猪水肿与腹泻病性能。
实施例利用自身构建的、以白色杜洛克和中国二花脸猪为祖代亲本、用于功能基因定位的猪资源家系为实验动物。479头资源家系第二代(F2代)公猪个体饲养到240日龄屠宰，取小肠空肠部分，提取小肠上皮细胞刷状缘，利用E.coliF18ab菌株黏附猪小肠上皮细胞刷状缘，通过相差显微镜检测细菌的黏附结果。每个样品检测20个以上的刷状缘，若有10％以上的刷状缘上至少有2个细菌黏附，判该样品为黏附型，若至少有2个细菌黏附的刷状缘不到10％，但有1-2个细菌黏附的刷状缘多于10％，判该样品为弱黏附型，否则判为不黏附型。黏附效果图如附图4所示。
采用上述PCR-SSCP和ARMS-PCR等方法对479头F2代个体进行SNP C228T基因型判定，采用SAS软件包(version.9.0，SAS Inc.，2003)的公用的GLM统计模型yijkl＝u+Si+dj+gk+(sd)ij+(dg)jk+(sg)ik+(dsg)ijk+eijkl(注u为均值；s为公猪效应；d为母猪效应；g为基因效应；e为随机方差)分析该位点的遗传变异与黏附性(抗水肿与腹泻病性状)的方差分析。结果如表1所示，从中可见，基因型CC与TT差异极显著，TT与CT及CC与CT差异不显著，CC型个体是抗水肿与腹泻病型猪的选育改良所需的基因型个体。在商业种猪核心群中，继代选育CC型个体，可以进一步改良种群的抗水肿与腹泻病性状，减少仔猪的死亡率。
表1 SNP C228T基因型与白色杜洛克×二花脸F2群体黏附性状的相关性分析
*不同上标的数值表示差异显著(P＜0.05)
权利要求
1.一个鉴别显著影响断奶仔猪水肿与腹泻病抗性的a1，2-岩藻糖转移酶基因单核苷酸多态位点，其特征在于该多态位点序列如下1 gatgcgggct gcacttatga ctgggaatct gccacccgcc aggagctcag gtaagtggga61 gatgcggatg cctcggaccc aggagccggg ccttcagtac caggaggcgc acccccaacc121 cctaaccccc tgctacccgc aggtgtctcc tgcgccccga cccccaactc ctgctcctcc181 aggagtccac agctcccatc cagacgtggg cctggggctt ctcgctctct acccgacctg241 ttgcttgctg tcacctccat agtggactct gccccgccca cgcaggtcct tgagaaagga301 ggtgggggga cgtgttcaag gtcatggccc tacagcccgc gggacggaga ttccaagatg361 tggggaccag gcggtgggtc ccgcccgtgg catcgctaac tttggaaacc actcgttttc421 accatctccc acccccgaaa ttctgagccc ccaacacctg ctaactcaaa ccccagagcc481 cggctccctt tttccgacgg acccaggagt tcaaagccag agtttcctca tgcccacagg541 cctctcctcc ctgccgctca gcctccagcc ccgaggatct gctaatttca cttttcctcc601 ctgcagccat gtgggtcccc agccgccgcc acctctgtct gaccttcctg ctagtctgtg661 ttttagcagc aattttcttc ctgaacgtct atcaagacct cttttacagt ggcttagacc721 tgctggccct gtgtccagac cataacgtgg tatcatctcc cgtggccata ttctgcctgg781 cgggcacgcc ggtacacccc aacgcctccg attcctgtcc caagcatcct gcctcccttt841 ccgggacctg gactatttac ccggatggcc ggtttgggaa ccagatggga cagtatgcca901 cgctgctggc cctggcgcag ctcaacggcc gccaggcctt catccagcct gccatgcacg961 ccgtcctggc ccccgtgttc cgcatcacgc tgcctgtcct ggcgcccgag gtagacaggc1021 acgctccttg gcgggagctg gagcttcacg actggatgtc cgaggattat gcccacttaa1081 aggagccctg gctgaagctc accggcttcc cctgctcctg gaccttcttc caccacctcc1141 gggagcagat ccgcagcgag ttcaccctgc acgaccacct tcggcaagag gcccaggggg1201 tactgagtca gttccgtcta ccccgcacag gggaccgccc cagcaccttc gtgggggtcc1261 acgtgcgccg cggggactat ctgcgtgtga tgcccaagcg ctggaagggg gtggtgggtg1321 atggcgctta cctccagcag gctatggact ggttccgggc ccgatacgaa gcccccgtct1381 ttgtggtcac cagcaacggc atggagtggt gccggaagaa catcgacacc tcccgggggg1441 acgtgatctt tgctggcgat gggcgggagg ccgcgcccgc cagggacttt gcgctgctgg1501 tgcagtgcaa ccacaccatc atgaccattg gcaccttcgg cttctgggcc gcctacctgg1561 ctggtggaga taccatctac ttggctaact tcaccctgcc cacttccagc ttcctgaaga1621 tctttaaacc cgaggctgcc ttcctgcccg agtgggtggg cattaatgca gacttgtctc1681 cactccagat gttggctggg ccttgaacca gccaggagcc tttctggaat agcctcggtc1741 aacccagggc cagcgttatg ggtctccgga agccccagta acttccggag atgctggtgg1801 tcctgtagca gctggacact tatttcaaga gtgattctaa ttggctggac tcagaggaaa1861 ccctgcagaa gggcttgctg caagggttgg aacattctag aaccagtgga agagcttttc1921 atgatggctg gcaatgtctg gagacgctta atgccattct agacctcgca ttgcccacct1981 gttcttccca gcccgtgtcc agagtacttc tagagggctg tctgccccct tccccaggga2041 actccttgct ccagtgttga ctgtctagaa gagatatttc tcctccccct ggggtgtcag2101 aactgaagga cctcttggag gttgtggggc aagcactcac caaccccccc acctctgttt2161 ctccaagggc tctgggggaa ggtttgctct agagagggtc agtggtaggg tctgtaaaga2221 acccttctgg ccccttccag aggggagggg attctggaat tctcgataac ctccgccaag2281 aagccgatga gggtacaacc agaagctcac cacctcacca ctgctagaaa ggttgatgga2341 agacaaacta cctgtgtagc tggggtggtt tgggagcagg gcggaacttt ccccaacctt2401 ccatccccca gaaaaccaca aaccatagat atactaaaat atgggaggag gaggaaaagg2461 atggatgctg aatggtgcag gttatggagc aaggctctgc agaaatctag ggacaacttt2521 tttttttttt tttttaagcc cccaaactgc caacggtagg tagatgtgca tatgttggct2581 ctgagttcat ttcctctccc actgaaggat atttcctcct tggcagctgg gctgctgagg2641 ctgatggggt cgatttacca aacgccactt ggcataaggg tgcccattgc agagacccgc2701 ccatatcgtg cctcttgcta acccctatct gccccgaatc cacacgacca tgaaatctgg2761 ctttgaacaa gccaggaatg gaaggctctg aaggtatgta gcccatggcc tggcctccaa2821 cccaggcagg agcacagggt ctggccaaag aggatgggac atttgactca ggttttagga2881 tcctcctgat gcgttttgaa gggagtgaag gcagatgctt ttatgataga gttgtctgag2941 aatctaagcc ctcttctagt cttctcaggg aatttgtggg caccggtccc tactcagttg3001 cccttggtgg gagagaggga agtatgaatt aaaagtccac atcaccaacc cgcctctgca3061 ggttttttgg agttctgtgt acacgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt3121 gtgtgtgtaa ggagaagtaa aggtatggag cttctgcaga ctcgcatgac tcatgtcttg3181 ggatactgtt cctgctcttt tgttgctgca gttgtgtggg ttgtggtctc agaacctcaa3241 ttcttttctt ccagactctc agtattggcc cccagacctc tttttcctct gggaccttgg3301 catccagccc cagac。
2.a1，2-岩藻糖转移酶基因单核苷酸多态位点在选育改良种猪抗水肿与腹泻病性状中的应用。
全文摘要
本发明公开了一个鉴别显著影响断奶仔猪水肿与腹泻病抗性、可用于种猪遗传改良的a1，2－岩藻糖转移酶基因单核苷酸多态位点及应用，它先进行单核苷酸多态性(SNP)C228T的鉴别，再采用PCR－SSCP和ARMS－PCR等方法进行SNPC228T基因型判定。本发明通过现代分子生物学技术检测该多态位点，利用标记辅助选择(MAS)选择有利的等位基因型个体留种，可以显著提高种群断奶仔猪的抗水肿与腹泻病猪能力，大大减少仔猪死亡率。
文档编号A01K67/00GK1680599SQ200510023929
公开日2005年10月12日 申请日期2005年2月5日 优先权日2005年2月5日
发明者黄路生, 晏学明, 舒青龙, 任军, 郭源梅, 麻骏武, 丁能水, 艾华水 申请人:江西农业大学