专利名称：一种利用污水污泥发酵生产生物农药苏云金杆菌的方法
技术领域：
本发明涉及一种用污水污泥发酵生产生物农药苏云金杆菌的方法，是一项利用废弃物生产高效生物农药的技术，属于环境生物技术领域。
二、技术背景我国多数污水处理厂采用活性污泥法进行污水净化，在净化污水的同时会产生占污水进水量约0.3-0.7％的污水污泥。这些数量日益庞大而且高度集中的废弃物的无合适的处置出路，已成为严重困扰着我国污水处理事业的健康发展的重要因素之一。
另一方面，目前使用化学农药防治植物病虫害对农业增产起到重要的作用，但是化学农药的残留对环境和人畜健康都有很大危害。大力发展对人畜无害的生物农药是现代农业特别是有机农业和无公害农业的迫切要求。苏云金杆菌是迄今世界上应用最为广泛也最为成功的生物农药，苏云金杆菌在发育过程中其细胞的一端会形成折光而不易着色的椭圆形芽孢，同时在细胞的另一端形成菱形或近正方形的伴孢晶，随后芽孢和伴孢晶体从细胞中脱落进入发酵介质中。伴孢晶体是一种蛋白质毒素(又称δ-内毒素)，对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、直翅目等昆虫有显著的杀虫毒性，用于防治粮食作物、蔬菜、棉花、果树等多种害虫。其杀虫机理为在有害昆虫的碱性中肠(pH8.9以上)内，蛋白质晶体水解成有毒性的小分子多肽，而毒杀昆虫。由于动物的消化道呈酸性，缺乏使晶体水解的条件，故对人畜无毒。然而，目前苏云金杆菌制剂的生产多以黄豆粉，淀粉，酵母膏等价格较高的农副产品为原料，生产成本较高，限制了苏云金杆菌制剂的进一步推广，据报道苏云金杆菌生产原料占整个生产成本的30～40％，因此，选择低成本的原料是苏云金杆菌制剂商业化生产的关键。
以采用生化二级处理工艺(如活性污泥法)处理生活污水的城市污水处理厂或一些食品加工企业的污水处理厂产生的污水污泥含有丰富的有机碳、氮和无机盐，其中有害物质主要是重金属含量远远底于农用污泥污染物控制标准，用其作原料发酵B.t作为生物农药，既可为生物农药苏云金杆菌的生产提供一种低成本的生产方法，又将污水污泥开发成高价值的生物产品，对解决污水污泥处置出路有重要的意义。
发明内容
技术问题本发明的目的在于提供一种用污水污泥发酵生产生物农药苏云金杆菌的方法，苏云金杆菌制剂传统的发酵生产多用黄豆粉，淀粉，酵母膏等农副产品，成本较高，限制了苏云金杆菌制剂的大范围推广应用。污水处理厂产生的废弃物——污泥含有丰富的有机碳、氮和无机盐，用于发酵生产苏云金杆菌成本低廉，药效可靠，利于苏云金杆菌的大范围推广应用。
技术方案用污水污泥发酵生产生物农药苏云金杆菌的方法1、苏云金杆菌Bacillus thringiensis(B.t)546，南京农业大学资环学院环境微生物实验室分离保存。
2、B.t种子扩大培养从斜面上取一环B.t的菌苔，接种到100mL灭菌的细菌液体培养基(g/L)中(牛肉膏5，蛋白胨10，NaCl 5，pH＝7.2)，置28℃，转速180r/m的摇床上培养12h，做液体种子。
3、发酵罐发酵生产B.t用含固率1.5％～5％的污水污泥(pH用稀HCl或H2SO4或稀NaOH调节至7.2)作原料，在通用式发酵罐中发酵生产B.t菌液，污水污泥经灭菌后，接入1％～4％的B.t种子菌液，28℃，搅拌转速200r/m，通气发酵30h放罐。
4、经检验，活菌数达109个/mL，其中芽孢占90％以上。生产出的苏云金杆菌的液体制剂与用黄豆粉等工业发酵用培养基生产出的液体制剂，B.t活菌数及活芽孢数量相当，其生物毒性前者略高于后者。
有益效果本发明提供的用污水污泥发酵生产生物农药苏云金杆菌的方法，具有以下有益效果1、本发明提供的生产原料是污水处理过程中产生的废弃物——污泥，污泥量大易得，几乎不需成本。
2、以处理生活污水或食品加工业废水为主的污水处理厂所产生的污水污泥含有丰富的有机碳、氮和无机盐，有害物质(主要是重金属)含量少，可完全满足苏云金杆菌发酵生产的营养需求。
3、将污水污泥开发成有价值的生物制品，有利于解决污水污泥处置出路，对保护环境有重要意义四具体实施方式
实施例1(1)采样南京锁金村污水处理厂(处理生活污水)剩余活性污泥，该污泥基本性质见表1，表2。
表1南京锁金村城市污水处理厂污泥养分含量(干物质计)
表2南京锁金村城市污泥重金属含量(mg.kg-1，干物质计)
(2)B.t种子扩大培养从斜面上取一环B.t 546菌苔，接种到100mL灭菌的细菌液体培养基(g/L)中(牛肉膏5，蛋白胨10，NaCl 5，pH＝7.2)，置28℃，转速180r/m的摇床上培养12h。
(3)用污泥和常规黄豆粉培养基发酵B.t的摇瓶比较试验A用含固率2.1％的污水污泥(pH＝7.2)作原料。
B用黄豆粉培养基(g/L)作原料黄豆粉15，葡萄糖5，可溶性淀粉5，K2HPO4.7H2O 1，KH2PO4.7H2O 1，MgSO4·7H2O 0.3，FeSO47H2O 0.02，ZnSO4·7H2O 0.02，CaCO31.0，pH＝7.2。
取两种培养基各100mL分装于500mL三角瓶中，经121℃，20min灭菌后，按2％接入B.t种子菌液，于28℃，转速180r/m的摇床上培养30h。
(4)用污泥做培养基通过7-70L发酵罐发酵B.t将4L细菌液体培养基装入7L种子罐中，121℃，灭菌20min，将100mL液体种子接入种子罐中，培养12h，取2L液体种子移入装有50L污水污泥的70L发酵罐(已121℃，灭菌20min备用)中，温度28℃，转速200r/m，通气量40NL/min，罐压0.03Mpa，发酵30h放罐。
(5)发酵液中B.t细胞数测定取1mL发酵液样品于9mL无菌水中作系列稀释，取0.1mL适当稀释度的菌悬液涂布细菌平板，于28℃，培养24h，计数平板上的菌落数。达4.5×109个/mL。
(6)活孢子数(芽孢数)测定取适当稀释度的菌悬液，在75℃的水浴中，处理10min，以杀死营养体，再涂布细菌平板。于28℃，培养24h，计数平板上的菌落数。达4.0×109个/mL。
(7)主要结果2.1％的污水污泥作原料，摇瓶发酵30h，B.t活菌数为4.5×109个/mL，芽孢数为4.0×109个/mL，即90％以上有芽孢。黄豆粉培养基作原料，摇瓶发酵30h，B.t活菌数4.8×109个/mL，芽孢数量只有107个/mL，摇瓶发酵至40h，B.t活菌数达5.2×109个/mL，90％以上有芽孢。2.1％的污水污泥作原料用70L发酵罐发酵30h，生产的B.t菌液，B.t活菌数3.5×109个/mL，90％以上芽孢。
(8)毒性试验采用表面沾染饲喂法以2龄家蚕作试虫，比较以黄豆粉培养基与2％的污水污泥作原料生产的B.t孢晶混合液生物毒性，发现在相同的稀释倍数下，用污泥培养的B.t孢晶混合液毒性比黄豆粉培养基生产的B.t孢晶混合液毒性略强。
比较而言，在黄豆粉培养基中B.t菌数比在污泥中生长的略高，但两者没有显著性差异，都在109个/mL同一数量级，而在污泥中芽孢形成及脱落的时间比用黄豆粉培养基约缩短时间10小时，在污泥中发酵30h，芽孢数量达109个/ml，并90％的芽孢脱落，已基本满足B.t工业发酵生产要求。生物毒性实验也表明用污泥发酵培养的B.t孢晶混合液毒性不受影响。
实施例2(1)采样苏州城西污水处理厂(处理生活污水)剩余污泥，该污泥性质见表3，表4。
表3苏州城西城市污泥养分含量
表4苏州城西城市污泥重金属含量(以干污泥计)
(2)B.t种子扩大培养从斜面上取一环B.t 546菌苔，接种到100mL灭菌的细菌液体培养基(g/L)中(牛肉膏5，蛋白胨10，NaCl 5，pH＝7.2)，置28℃，转速180r/m的摇床上培养12h。
(3)7-70L发酵罐发酵生产B.t将4L细菌液体培养基装入7L种子罐中，121℃，灭菌20min，将100mL液体种子接入种子罐中，培养12h，2L液体种子接入装有50L城市污泥的70L发酵罐(已121℃，灭菌20min备用)中，温度28℃，转速200r/m，通气量40NL/min，罐压0.03MPa，发酵30h放罐。
(4)发酵液中活菌数测定方法同实例1，B.t活菌数达2.3×109个/mL。
(5)活孢子数测定方法同实例1，芽孢数达2.1×109个/mL。
五
图1为利用污水污泥发酵生产生物农药苏云金杆菌的方法流程图。
权利要求
1.一种利用污水污泥发酵生产生物农药苏云金杆菌的方法。其特征在于，包括如下步骤(1)苏云金杆菌Bacillus thringiensis(B.t)种子扩大培养从斜面上取一环B.t的菌苔，接种到100mL灭菌的细菌液体培养基(g/L)中(牛肉膏5，蛋白胨10，NaCl 5，pH＝7.2)，置28℃，转速180r/m的摇床上培养12h，做液体种子。(2)以污水污泥为原料发酵生产B.t用含固率1.5％～5％的城市生活污泥作原料，发酵罐的装料系数为70％，调节pH＝7.2，121℃，20min灭菌后，按1％～4％(w/w)的比例接入苏云金杆菌液体种子，发酵条件温度28℃，转速200r/m，好气发酵30h后放罐(此时活菌数达109个/mL，其中芽孢占90％以上)。
2.根据权利要求1所述的用污水污泥发酵生产生物农药苏云金杆菌的方法，其特征在于权利要求1中所述的污水污泥是指城市市政污水处理厂或工矿企业内部污水处理厂(站)经过污水二级生化处理工艺后的剩余污泥，包括经过消化的和未消化的，含固率为1.5％～5％的污泥。
3.根据权利要求1所述的用污水污泥发酵生产生物农药苏云金杆菌的方法，其特征在于苏云金杆菌Bacillus thringiensis(B.t)种子扩大培养采用细菌液体培养基培养，配方为(g/L)牛肉膏5，蛋白胨10，NaCl 5，pH＝7.2。
4.根据权利要求1所述的用污水污泥发酵生产生物农药苏云金杆菌的方法，其特征在于用发酵罐发酵生产B.t是指用含固率1.5％～5％的污水污泥(pH＝7.2)作原料，在通用式发酵罐中发酵生产B.t菌液，污水污泥经灭菌后，按1％～4％(w/w)接入苏云金杆菌液体种子，28℃，搅拌转速200r/m，通气发酵30h放罐。
5.根据权利要求1所述的用污水污泥发酵生产生物农药苏云金杆菌的方法，其特征在于调节细菌培养基和污水污泥pH到7.2是指采用稀酸(HCl或H2SO4)或稀碱(NaOH)调节。
全文摘要
本发明是一种利用城市生活污泥发酵生产生物农药苏云金杆菌的方法，是一项利用废弃物生产高效生物农药的技术。用含固率为1.5％～5％的污水污泥作为发酵苏云金杆菌Bacillus thringiensis(B.t)的原料。将污泥装入发酵罐中，pH调节至7.2，经121℃，20min灭菌后，按1％～4％(w/w)的比例接入B.t液体种子，于28℃，200r/m条件下，好气发酵30h后放罐。B.t细胞总数达10
文档编号A01N63/02GK1772879SQ200510094429
公开日2006年5月17日 申请日期2005年9月19日 优先权日2005年9月19日
发明者周立祥, 王世梅 申请人:南京农业大学