专利名称：一种用于防治松毛虫的白僵菌制剂及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物制剂，具体属于一种用于防治松毛虫的白僵菌制剂，特别是属于一种适用于北方干旱地区防治松毛虫的白僵菌制剂，以及它的制备方法和应用。
背景技术：
松林是我国森林的主要类型，是天然林保护工程的主要内容，对我国的生态安全起着重要作用，特别在北方生态脆弱区，松林发挥的屏障作用巨大。但是，松毛虫一直是松林的主要害虫。我国松毛虫有27种(含4亚种)，在南方以马尾松毛虫分布最广，危害最重。北方是油松毛虫、赤松毛虫、华山松毛虫和落叶松毛虫危害最重，连年成灾，被称为“无烟的森林火灾”。以往多采用化学杀虫剂防治松毛虫，引起环境污染、农药残留、杀伤天敌、使害虫产生抗药性、形成再猖獗等一系列问题。应用昆虫病原菌开展生物防治，是实现森林健康和害虫可持续控制的重要途径。国际上对此十分重视，特别在发达的美国、日本、欧洲等。我国从20世纪70年代以来，就开展了利用白僵菌防治松毛虫的研究，取得了很大成绩。但是，由于白僵菌生长繁殖需要较高的湿度和适当的温度，使其应用至今仍局限在南方12个省区，以防治马尾松毛虫为主。北方限制白僵菌应用的主要原因有2个，第一，缺乏适应北方森林干旱低温环境的本地优良菌种。在南方应用的白僵菌菌种是从染病的马尾松毛虫上分离获得，它们一般具有适应南方湿热气候和适应在原寄主马尾松毛虫上寄生的遗传特点，对北方不能很好适应。第二，缺乏适合北方森林环境应用的合适剂型和施用技术。目前，在南方森林的高温高湿环境中，喷洒白僵菌的孢子悬浮液、孢子油剂或喷撒干的孢子粉，孢子能够存活和实现侵染，达到防治效果。但在北方，由于森林内的干燥低温，应用上述剂型和方法后，白僵菌的孢子会很快因失水干死或低温冻死，或因吸收不到水分，孢子不能萌发或活力降低，不能成功侵染，使防治失败。因此，在北方成功应用白僵菌防治松毛虫就必须在上述两个限制因子上实现突破，即必须获得北方森林环境中自然生存的松毛虫病原白僵菌的菌种，研制出适应北方森林特点的特殊制剂和相应的应用技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种防治松毛虫的白僵菌制剂，特别是适用于北方干旱地区防治松毛虫的白僵菌制剂及其制备方法和应用。
本发明提供的一种防治松毛虫的白僵菌制剂，采用保藏号为CGMCC No.1573的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)菌种，通过固体培养，将培养物与营养型湿填料配制而成。
所述的菌种，是本发明人从2002年3月份采于山西省北部地区灵丘县林场人工油松林内越冬油松毛虫自然染病的僵尸上分离获得的，鉴定为球孢白僵菌(Beauveriabassiana)。该菌种的菌株已于2005年12月22日保藏在北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌种保藏号为CGMCC No.1573。
本发明白僵菌制剂的制备方法，包括如下步骤(1)一级斜面菌种培养将保藏号为CGMCC No.1573的球孢白僵菌菌种接入装有含有健康油松毛虫虫尸浸出液和蛋白胨的PDA斜面培养基的试管中，放入培养箱，温度为20℃-28℃、相对湿度为75％-85％条件下培养，待菌丝长满斜面并产孢子时备用；一般培养时间为10-15天。
(2)二级固体培养在无菌条件下，将培养好的斜面菌种及其培养基一同接入装有固体培养基的罐头瓶中培养，每1罐头瓶接种量为1个试管斜面菌种，将接种后的罐头瓶置于温度为20℃-28℃、相对湿度为75％-85％条件下培养至长满白色菌丝，制得二级菌种；一般培养时间为20-23天。
(3)三级固体扩大培养将二级菌种，按体积比为1∶10-25的接种量接入灭过菌的固体培养基中，在温度为20℃-28℃、相对湿度为75％-85％条件下培养至长满白色菌丝，即得三级培养物；一般培养时间为25-30天。
(4)营养型湿菌粉制备将原料按重量百分比计麦麸68-72，谷壳26-30，奶粉0.5-1.5，保水剂0.5-1.5混匀，并按原料总重量加水60％-80％搅拌均匀，灭菌，冷却至室温，制得营养型湿填料；再将三级培养物与营养型湿填料按1∶4-6比例在无菌室内搅拌均匀，分装，即得营养型湿菌粉白僵菌制剂产品；其中，步骤(2)、(3)中所述的固体培养基是将原料按重量百分比计麦麸60-80，谷壳20-40混匀，并按原料总重量加水60％-80％搅拌均匀，灭菌，制得。
所述斜面培养基成分及其配比优选为马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蛋白胨20g，松毛虫幼虫干虫尸30g，水1000mL。
所述二级和三级固体培养基原料成分及其配比按重量百分比计优选为麦麸70，谷壳30。
所述营养型湿填料原料成分及其配比按重量百分比计优选为麦麸70，谷壳28，奶粉1，保水剂1。其中，保水剂选自交联聚丙烯酰胺、聚丙烯酸盐(钾盐或钠盐)和聚丙烯酰胺共聚体、“科瀚98”高效抗旱保水剂等。
本发明营养型湿菌粉白僵菌制剂，可用于防治松毛虫，特别是适用于北方干旱地区防治松毛虫中推广使用。本发明当然还可用于南方气候湿润地区防治松毛虫中使用。
白僵菌制剂的林间施用方法将配好的营养型湿菌粉白僵菌制剂带到松毛虫发生的林间，将树根基部松毛虫隐藏的枯落物轻轻刨开，均匀撒施菌粉，然后再把枯落物盖好即可。用量为150-250g/株，根据树盘的大小而定。应用时间从冬天11月份松毛虫越冬开始，一直到来年春季3月底都可以。
效果检查在4月中旬当松毛虫出蛰上树前，采用抽样方法检查防治效果。计数健康活虫和染病死亡的数量百分比，再根据对照计算出校正死亡率。一般防效在65％-85％之间。除此之外，当时还未死亡的松毛虫由于已经带菌，出蛰后还会继续死亡，并形成菌种的进一步扩大传播。菌种在使用后能持续在林间发挥作用，达到生物持续控制的长期效应。
本发明优点及效果评价1、应用营养型湿菌粉白僵菌制剂在春季和冬季防治越冬松毛虫幼虫具有很好效果，使幼虫染病死亡率达到65％-85％。说明应用营养型湿菌粉制剂是北方地区防治松毛虫生物防治的有效方法，它突破了北方森林环境干燥低温对病原真菌的应用的限制。
2、营养型湿菌粉白僵菌制剂直接提供了白僵菌在林地内最需要的营养和水分，在林间应用后对改善枯落物下白僵菌生存的小环境，对保存白僵菌的存活、生长、繁殖和侵染具有重要作用。在局部使白僵菌的数量增加很多，形成优势菌种群落，使感染病菌的机会大大提高。
3、应用营养型湿菌粉白僵菌制剂在林地不仅能对当代油松毛虫幼虫造成直接控制，而且它能在枯落物下长期保存，对来年越冬幼虫再次形成侵染，也可以由已经染菌但还能继续出蛰松毛虫幼虫携带到树冠或其他部位，形成传播。因此，通过人工撒施营养型湿菌粉制剂，可以大大增加林间的菌量，依靠这种群集性和虫体之间的相互感染，病菌传播的更快，促使流行病发生，形成持续控制的良好效应。
4、应用营养型湿菌粉白僵菌制剂对于树根下越冬的油松毛虫进行防治，还具有施用菌量相对集中，范围小，容易操作又省工，生物防治无污染，整个冬季和早春都可应用，并利用了农村和林区剩余劳力等优点。
总之，本发明生产工艺简单，容易操作，原料容易取得，成本低廉，无污染，所得产品防治松毛虫效果显著，特别是适用于北方干旱地区防治松毛虫中大量使用，推广应用前景广阔。
菌种说明本发明采用的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)的菌株已于2005年12月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌种保藏号为CGMCCNo.1573。保藏中心地址北京中关村北一条13号中国科学院微生物研究所院内，邮政编码100080。
具体实施例方式
实施例1本发明营养型湿菌粉白僵菌制剂的制备(一)一级斜面菌种培养1、斜面培养基的制备斜面培养基成分及其配比马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蛋白胨20g，干虫尸30g，水1000mL。其制备步骤①、称3-5龄的油松毛虫幼虫干虫尸30g，加入1000mL清水浸泡2小时。
②、将马铃薯去皮挖芽后称取200g，切成长宽约1cm的小块后加入到浸泡的干虫尸液体中共煮沸，至马铃薯发软后用纱布过滤，取滤液。
③、将此滤液补充水至1000mL，加入20g蛋白胨，加热直至全部溶解。
④、煮沸过程中加入琼脂20g，完全溶解后加入20g葡萄糖，纱布过滤。培养基为自然PH值。
⑤、滤液通过漏斗注入试管中，约占试管的1/5。
⑥、试管用1.5Kg/cm2高压灭菌30min。取出将试管摆成斜面(高度约为试管的1/2)。
⑦、待培养基冷却凝固后，放入25℃恒温培养箱中培养72h，做无菌考察。然后取合格的试管准备接种。
2、一级斜面菌种培养将保藏号为CGMCC No.1573的球孢白僵菌接种于装有上述斜面培养基的试管中，放入培养箱，在温度为25℃、相对湿度为75％条件下，培养12天，待菌丝长满斜面并产孢子时，转入固体二级培养。
(二)二级固体罐装培养1、二级固体培养中固体培养基的制备二级固体培养基原料成分及其配比麦麸7Kg，谷壳3Kg。其制备步骤①、两种原料按比例称好掺水混合均匀，加水量相当于原料总重量的60％-80％，直到用手握抓时刚刚滴水为止，搅拌匀后装于罐头瓶。
②、在罐头瓶中央部分捅一眼到瓶底，便于菌落生长，瓶口用四层纱布和两层牛皮纸盖好扎紧。
③、用1.5Kg/cm2的高压灭菌40分钟，灭菌后取出，冷却至室温，即可在无菌环境下接种。
2、二级固体罐装培养将培养好的试管中菌株在无菌条件下连培养基一同刮下放入装有上述二级固体培养基的罐头瓶中培养，接种量为每试管菌种接种一瓶，将接种后的罐头瓶放入恒温培养箱，在温度为25℃、相对湿度为75％条件下，培养20天，直至培养罐中长满白色菌丝。
(三)三级固体袋装扩大培养1、三级固体扩大培养中固体培养基的制备三级固体培养基原料成分及其配比麦麸35Kg，谷壳15Kg。其制备步骤①、原料按比例称好掺水混合均匀，加水量相当于原料总重量的60％-80％，直到用手握抓时刚刚滴水为止，搅拌匀后装于三级培养袋中。培养袋的材料为聚丙乙烯，直径为20cm，袋长30cm。袋口密封。
②、用1.5Kg/cm2的高压灭菌40min，灭菌后取出，冷却至室温，即可在无菌环境下接种。
2、三级固体袋装扩大培养将培养好的二级菌种，按每瓶菌种接7袋(相当于接种量体积比1∶20)，接入上述灭过菌的三级培养袋中，在温度为25℃、相对湿度为75％、无菌条件下，培养25天，待菌丝和孢子长满培养袋即得三级培养物。
(四)营养型湿菌粉的制备1、营养型湿填料的制备营养型湿填料原料成分及配比优选为麦麸70％，谷壳28％，奶粉1％，保水剂交联聚丙烯酰胺1％。其制备步骤①、将原料按比例混合，并按原料总重量加水60％-80％搅拌均匀。
②、用1.5Kg/cm2的高压灭菌40min，灭菌，冷却至室温，制得营养型湿填料。
2、营养型湿菌粉的制备将三级培养物，从培养袋内取出，在密封搅拌器内与营养型湿填料按1∶5比例混合并搅拌均匀，即得到营养型湿菌粉白僵菌制剂。然后分装成袋，即可到林间施用。袋的材料为聚氯乙烯，直径25cm，长40cm，每袋装营养型湿菌粉2.5kg。
实施例2营养型湿菌粉白僵菌制剂的林间施用试验(1)营养型湿菌粉白僵菌制剂的冬季北部地区应用2003年11月，在山西省北部地区灵丘县西山矿物局林场35年生人工油松林内施用，防治面积为15公顷。将配制好的营养型湿菌粉带到松毛虫发生的林间施用。将树根基部松毛虫隐藏的枯落物轻轻刨开，均匀撒施菌粉，然后再把枯落物盖好即可。用量为250g/株。
效果检查在4月下旬当松毛虫出蛰上树前，采用抽样方法检查防治效果。计数健康活虫和染病死亡的数量百分比，再根据对照计算出校正死亡，防效在70.4％-85.4％。
(2)营养型湿菌粉白僵菌制剂的春季北部地区应用2004年3月下旬，在山西省北部地区灵丘县西山矿物局林场35年生人工油松林内施用，防治面积为10公顷。将配好的营养型湿菌粉带到松毛虫发生的林间施用。将树根基部松毛虫隐藏的枯落物轻轻刨开，均匀撒施菌粉，然后再把枯落物盖好即可。用量为150g/株。
效果检查在4月下旬当松毛虫出蛰上树前，采用抽样方法检查防治效果。计数健康活虫和染病死亡的数量百分比，再根据对照计算出校正死亡，防效在47.1％-54.5％。
(3)营养型湿菌粉白僵菌制剂的春季南部地区应用2005年3月中旬，在山西省东南部地区中条山森林经营局管辖的端氏林场40年生人工油松林内施用，防治面积为10公顷。将配好的营养型湿菌粉带到松毛虫发生的林间施用。将树根基部松毛虫隐藏的枯落物轻轻刨开，均匀撒施菌粉，然后再把枯落物盖好即可。用量为150g/株。
效果检查在4月下旬当松毛虫出蛰上树前，采用抽样方法检查防治效果。计数健康活虫和染病死亡的数量百分比，再根据对照计算出校正死亡，防效在62.5％-65.9％。
除此之外，当时还未死亡的松毛虫由于已经带菌，出蛰后还会继续死亡，并形成菌种的进一步扩大传播。菌种在使用后能持续在林间发挥作用，达到生物持续控制的长期效应。
权利要求
1.一种用于防治松毛虫的白僵菌制剂，其特征在于，采用保藏号为CGMCC No.1573的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)菌种，通过固体培养，将培养物与营养型湿填料配制而成。
2.按照权利要求1所述的白僵菌制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤(1)一级斜面菌种培养将保藏号为CGMCC No.1573的球孢白僵菌菌种接入装有含有健康油松毛虫虫尸浸出液和蛋白胨的PDA斜面培养基的试管中，放入培养箱，温度为20℃-28℃、相对湿度为75％-85％条件下培养，待菌丝长满斜面并产孢子时备用；(2)二级固体培养在无菌条件下，将培养好的斜面菌种及其培养基一同接入装有固体培养基的罐头瓶中培养，每1罐头瓶接种量为1个试管斜面菌种，将接种后的罐头瓶置于温度为20℃-28℃、相对湿度为75％-85％条件下培养至长满白色菌丝，制得二级菌种；(3)三级固体扩大培养将二级菌种，按体积比为1∶10-25的接种量接入固体培养基中，在20℃-28℃、相对湿度为75％-85％条件下培养至长满白色菌丝，即得三级培养物；(4)营养型湿菌粉制备将原料按重量百分比计麦麸68-72，谷壳26-30，奶粉0.5-1.5，保水剂0.5-1.5混匀，并按原料总重量加水60％-80％搅拌均匀，灭菌，冷却至室温，制得营养型湿填料；再将三级培养物与营养型湿填料按1∶4-6比例在无菌室内搅拌均匀，分装，即得营养型湿菌粉白僵菌制剂产品；其中，步骤(2)、(3)中所述的固体培养基是将原料按重量百分比计麦麸60-80，谷壳20-40混匀，并按原料总重量加水60％-80％搅拌均匀，灭菌，制得。
3.按照权利要求2所述的白僵菌制剂的制备方法，其特征在于，所述的斜面培养基成分及其配比马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蛋白胨20g，松毛虫干虫尸30g，水1000mL。
4.按照权利要求2所述的白僵菌制剂的制备方法，其特征在于，所述的固体培养基原料成分及配比按重量百分比计麦麸70，谷壳30。
5.按照权利要求2所述的白僵菌制剂的制备方法，其特征在于，所述的营养型湿填料原料成分及配比按重量百分比计麦麸70，谷壳28，奶粉1，保水剂1。
6.按照权利要求1所述的白僵菌制剂的用途，用于防治松毛虫。
7.如权利要求6所述的白僵菌制剂的用途，用于北方地区林地防治松毛虫。
全文摘要
本发明涉及一种防治松毛虫的白僵菌制剂，特别是一种适用于北方干旱地区防治松毛虫的营养型湿菌粉白僵菌制剂。该制剂采用保藏号为CGMCC N0.1573的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)菌种，通过固体发酵、配制制得。其生产方法采用上述菌种经一级斜面培养、二级罐装培养、三级袋装培养、与营养型湿填料混合配制而成营养型湿菌粉。产品用于松毛虫林间防治，将菌粉均匀撒施于松毛虫越冬的树干基部枯落物下，用量150－250g/株，防治效果达70－85％。该制剂适应北方森林环境的特性，提供了菌种在林地生存和繁殖最需要的营养和水分，提高了菌种活力和成功侵染机会；具有用菌量少，方法简便，无污染等优点。
文档编号A01P5/00GK1823593SQ20061001232
公开日2006年8月30日 申请日期2006年1月10日 优先权日2006年1月10日
发明者谢映平, 原贵生, 薛皎亮, 王国昌, 牛宇, 范丽华 申请人:山西大学