专利名称：一种烟草赤星病对菌核净抗药性治理的方法
技术领域：
本发明涉及一种烟草赤星病对菌核净抗药性治理的方法，属于植物保护和农药学领域。
背景技术：
由链格孢菌(Alternaria alternata)侵染引起的烟草赤星病具有潜育期短、流行速度快的特点。该病在世界各烟草产区广泛发生，也是我国烟叶产业的主要病害之一。该病自1892年首次在美国发现以来，曾数次严重危害烟草，给世界烟草生产带来巨大损失。1956年在北卡罗来那州突然爆发流行，造成直接经济损失2100万美元。2000年8月在美国康乃狄克州和麻萨诸塞州大爆发，分别造成两州烟草减产75％和89％。1931年在津巴布韦广泛传播，成为20世纪50年代前非洲烟草生产的重要病害。我国1916年首次在北京附近发现，1963和1964年分别在河南和山东烟区大流行，损失极大，随后此病在全国各烟区日趋严重。1989~1991年，河南省平均每年因赤星病造成烟草损失达人民币2300万元，成为毁灭性病害。近年来，烟草赤星病在我国各烟区间歇性流行发生，是烟草重点监测病害之一。经2004～2005年全国15个省(自治区)烟草侵染性病害调查，赤星病严重危害的省份有黑龙江、广东、江西、四川、湖南；其次为陕西、重庆市、贵州、云南、山东、辽宁、安徽等省，据估测每年因赤星病引起的病害损失达9205.433万元。该病除造成烟叶减产外，还导致烟叶外观质量下降和内在品质不谐调，工业使用价值大大降低。
目前对烟草赤星病的防治仍然以化学防治为主，最有效的药剂是二甲酰亚胺类杀菌剂(Dicarboximides fungicide，DCFs)菌核净(Dimethachlon)。菌核净系20世纪70年代初推出的一类广谱性触杀型保护性杀菌剂。除了菌核净，DCFs还包括乙烯菌核利(Vinclozolin)、速克灵(Procymidone)和扑海因(Iprodione)等。因其具有杀菌谱广，防治效果显著等特点，已被广泛应用于多个类群植物病原真菌，如葡萄孢属、丛梗孢属、青霉属、核盘菌属、链格孢属、长蠕孢属、丝核菌属、茎点霉属、球腔菌属、尾孢属等引起的作物、果树病害防治。而自DCFs开始应用于大田病害防治后不到10年间，就有很多有关植物病原真菌对DCFs抗药性的报道，表现出抗性形成时间短、流行广和病原菌种类多样性的特点。Beever R E等早在1983年就检测到灰霉病菌(Botrytiscinerea)大田抗性菌株的存在。1988年Hutton D G也报道石榴斑点病菌(Alternariaalternata)防治不到5年即产生抗药性。链格孢属病原菌田间抗药性菌株也发生在樱桃、苹果等果树病害防治上。此外，链核盘菌(Monilinia fructicola)、核盘菌(Sclerotinia homoeocarpa)和白腐小核菌(Sclerotium cepivorum)等重要的植物病原真菌均有对DCFs产生田间抗性的报道。在国内，DCFs抗药性产生也屡有报道。刘波等研究了江苏草莓灰霉病菌对速克灵的抗药性。抗性菌株在含1mg/mL速克灵的培养基上生长，而敏感菌株极限生长浓度小于10μg/mL，表明草莓灰霉病已对速克灵产生了很高的抗药性。此外，他们还对抗性菌株和敏感菌株的致病力、产孢能力和抗性稳定性等进行了比较研究，结果表明抗性菌株虽致病力明显低于敏感菌株，但产孢能力强，且抗性菌株的单孢分离后代仍保留抗药性，这就为抗药性的流行创造了条件。随着菌核净在烟草生产上的长期大量使用，赤星病菌逐步产生抗药性，导致防治效果急剧下降甚至完全失效，给烟草生产造成了重大的经济损失。
烟草赤星病抗药性的发生和蔓延为烟草生产防治该病带来了较大的困难，同时缩短了菌核净在烟草生产上的使用寿命。研究开发有效的抗性治理技术是烟草生产上急需解决的重要课题，同时对植物病害抗药性治理研究具有重要的指导作用。目前在烟草赤星病对菌核净抗性治理方面尚无有效的技术措施。经文献检索，未发现与本发明内容相同文献的公开报道。
发明内容
本发明的目的是针对烟草赤星病对菌核净产生抗药性后的抗性治理技术的开发应用，解决烟草生产上赤星病的防治问题，通过赤星病菌对菌核净抗药性的交互抗性研究，开发一种经济高效的烟草赤星病对菌核净抗性治理的方法。
本发明通过2004～2006年从云南省12个烟区采集分离烟草赤星病菌337株，采用生长速率法测定了它们对菌核净的抗药性，结果表明，云南省主要烟区赤星病菌都有抗菌核净菌株出现，其中敏感菌株占2.67％，低抗菌株占32.94％，中抗菌株占61.13％，高抗菌株占3.26％。与早期监测结果相比，抗性水平呈上升趋势、范围呈扩大之势。
然后根据植物病虫害化学农药交互抗性原理，以分离自田间的赤星病菌敏感菌株和抗性菌株为材料，通过室内生长速率法测定化学农药对敏感菌株和抗性菌株的交互抗性情况，获得与菌核净存在负交互抗性的烟草赤星病防治药剂宝丽安、秀安和赤斑特，以这3种药剂作为赤星病菌对菌核净抗药性治理的替代药剂，按照常规剂量和施药方法进行交替使用防治对菌核净产生抗药性的烟草赤星病。
同时，根据植物病原菌抗药性治理策略基本原理，采用综合防治的措施，针对烟草赤星病已产生抗药性的烟区，通过选用较抗赤星病烟草品种G28、K346；严格漂浮育苗健壮苗标准，保证无病壮苗移栽；结合当地气候条件，适时移栽，避免过早或过迟移栽导致的发育异常或感病期延长；因地制宜，按宽行窄株的原则，改善通风透光，减轻病害；根据平衡施肥原理，结合测土配方，确定施肥水平及N、P、K配比，N肥适中，增施K肥有助于提高烟株抗病性；彻底销毁烟株残体，及时中耕除草，减少病菌侵染几率；适度封顶、适时采收等栽培技术措施减少病原菌侵染，降低病害水平，达到治理烟草赤星病对菌核净的抗药性，提高防治效果，减少烟草损失的目的，并有利于阻止和延缓烟草赤星病菌对菌核净抗药性的进一步发展，延长其使用寿命。
本发明是这样实现的烟草赤星病菌的分离、纯化与鉴定赤星病菌分离选择性培养基为RDA培养基，配方为利福平胶囊21粒加甲醇(100％)100毫升，并加入1N NaOH至溶解，制成30000微克/毫升的原液，置4℃下备用。配制PDA，倒平板时每150ml PDA加2ml利福平原液，即成利福平含量为400微克/毫升的RDA培养基。
赤星病菌分离方法为将赤星病样品分别用2种方法作表面消毒，一是单以70％酒精消毒10分钟，二是酒精消毒后经灭菌水浸洗，再用0.1％升汞消毒30-60秒钟。消毒后的病样置RDA平板上，每个样品4皿，每皿4块病组织。25℃下培养4天，挑取菌落边缘移置入新的RDA平板，25℃下培养，如此分离纯化几次后，编号并保存，按Lucas方法鉴定。
2004、2005和2006年分别从云南省文山、楚雄、玉溪、大理、昭通、红河、曲靖、昆明、临沧、思茅、丽江、版纳等12个州市采集烟草赤星病样品116、137和144个，通过分离纯化，分别鉴定出烟草赤星病菌99株、116株和122株，3年共计分离纯化烟草赤星病菌337株。
烟草赤星病菌对菌核净的抗药性测定抗药性测定药剂为92％菌核净原药，由浙江省温州市鹿城植保化学有限公司提供。抗药性测定采用生长速率法将供试菌株以稀释法接种于PDA平板上，25℃培养7天后，用无菌打孔器制成直径0.5cm的菌饼，用于药剂毒力测定。PDA培养基灭菌冷却至50℃左右时加入菌核净药剂混匀，制成浓度分别为1、10、25、50、75、100μg/mL的含药PDA平板上，25℃下培养，每天早晚观察1次，直至空白对照培养皿(药剂浓度为0)内菌丝长满时测量各处理菌落直径。每处理3次重复，计算相对抑制率(％)(＝[(对照菌落直径-菌饼直径)-(处理菌落直径-菌饼直径B)]/(对照菌落直径-菌饼直径)×100％)。根据生物统计几率值换算表，将抑制百分率换算成抑制几率值。以浓度对数为横坐标，抑制几率值为纵坐标，计算菌核净对供试菌株的毒力回归方程和有效中浓度(EC50)。烟草赤星病菌对菌核净抗性表型划分参照FAO标准将抗性表型划分为4类敏感，EC50≤5.0μg/mL；低抗，5.0＜EC50≤10.0μg/mL；中抗，10.0＜EC50≤50.0μg/mL；高抗，50.0μg/mL＜EC50。
抗性测定结果表明，云南省各烟区赤星病菌都有抗菌核净菌株出现，其中敏感菌株9株，占2.67％；低抗菌株111株，占32.94％；中抗菌株206株，占61.13％；高抗菌株11株，占3.26％。
不同化学农药对烟草赤星病菌交互抗药性试验试验药剂为58％甲霜锰锌可湿性粉剂，由江苏宝灵化工股份有限公司(南通染化厂)生产；70％甲基托布津可湿性粉剂，由日本曹达株式会社生产；64％杀毒矾可湿性粉剂，由先正达(苏州)作物保护有限公司生产；75％百菌清可湿性粉剂，由山东大成农药股份有限公司生产；10％宝丽安可湿性粉剂，由日本科研制药株式会社生产；50％敌克松(敌磺钠)可湿性粉剂，由上海金桥化工有限责任公司生产；80％金络可湿性粉剂，利民化工有限责任公司生产；72.2％霜霉威(盐酸盐)水剂，由江苏苏化集团新沂农化有限公司生产；48％东旺(霜霉络铜)，由北京市东旺农药厂生产；65％俊尔(二氰锰锌)可湿性粉剂，由浙江禾益农化有限公司生产；72％苯霜灵锰锌可湿性粉剂，由浙江一帆化工有限公司生产；20％移栽灵(稻恶)乳油，由湖北移栽灵农业科技股份有限公司生产；55％菌斑净可湿性粉剂，由温州市斯佩斯化工农药有限公司生产；50％秀安(异菌脲)可湿性粉剂，由浙江禾益农化有限公司生产；45％菌克(菌核.王铜)可湿性粉剂，由浙江禾益农化有限公司生产；10％菌霸可湿性粉剂，由浙江一帆化工有限公司生产；40％赤斑特可湿性粉剂，由温州农药厂生产。
各药剂对敏感和抗性菌株EC50值的测定采用生长速率法将供试药剂分别用无菌水或有机溶剂配成一定浓度的母液，取700μL供试药剂系列母液加入到70ml已融化并冷却至50℃左右的PDA培养基中，充分混匀后均匀倒入4个灭菌培养皿中，制成系列浓度为0.01、0.1、1、10、50、100μg/mL的含药培养基，以加入等体积的无菌水或有机溶剂的PDA平板为对照。将在PDA培养基上培养5～7d的菌株，用Φ5mm的打孔器于距菌落中心等距，菌丝生长均匀处打取菌饼，移到含有各种药剂系列浓度的PDA培养基平板上，每皿一片，置于26℃恒温箱内培养，4d后测量菌落直径，与对照比较不同杀菌剂处理对菌落扩展的生长抑制率，分析比较不同药剂对供试病菌菌丝生长的影响。根据生物统计几率值换算表，将抑制百分率换算成抑制几率值。以试验中设定的浓度对数为横坐标，抑制几率值为纵坐标，计算药剂的毒力回归直线方程，有效中浓度EC50。
试验结果见表1。17种药剂对赤星病菌敏感菌株的EC50值在10以下的药剂种类有菌核净、宝丽安、秀安、菌克、菌霸和赤斑特等6种，这些药剂是防治烟草赤星病的有效药剂。根据交互抗性原理，对菌核净抗性菌株的EC50值较敏感菌株低的化学药剂与菌核净之间存在负交互抗性。从表1中可见，6种有效药剂中只有宝丽安、秀安和赤斑特对菌核净抗性菌株的EC50值较敏感菌株低，说明它们与菌核净存在负交互抗性。因此，治理烟草赤星病对菌核净抗药性的有效药剂为宝丽安、秀安和赤斑特。
表1.17种化学农药对赤星病菌菌核净敏感和抗性菌株的交互抗性结果
烟草赤星病对菌核净抗药性治理试验示范在烟草赤星病菌对菌核净产生较高抗性水平，防治效果下降的烟区，结合选用抗病品种；培育无病壮苗；适时科学移栽；合理调配水肥；搞好田间卫生；适度封顶、适时采收等栽培技术措施，根据赤星病发生情况选用与菌核净具有负交互抗性的宝丽安、秀安和赤斑特按照常规剂量和施药方法交替使用防治烟草赤星病。2006年分别在昆明市嵩明县、文山州麻栗坡县、楚雄州南华县、大理州祥云县进行烟草赤星病抗药性治理试验示范，各点示范面积分别为3600亩、100亩、504亩和1000亩，各示范点烟草赤星病得到有效控制，示范区增加的经济效益分别为60.91万元、1.31万元、12.34万元和51.22万元。抗性治理示范总面积为5204亩，增加经济效益125.78万元。
具体实施例方式以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。实施例的详细步骤同发明内容部分所述。
实施例一昆明市嵩明县烟草赤星病对菌核净抗药性治理试验示范根据烟草赤星病对菌核净抗药性调查表明，昆明市嵩明县烟草赤星病对菌核净已产生较高水平的抗药性。2006年在该县进行抗性治理试验示范，结合选用抗病品种；培育无病壮苗；适时科学移栽；合理调配水肥；搞好田间卫生；适度封顶、适时采收等农业栽培措施，选用化学农药宝丽安、秀安和赤斑特替代菌核净按照常规剂量和施药方法交替使用防治烟草赤星病，抗性治理调查结果见表2和表3。结果表明，采用抗性治理措施后烟草赤星病发病株率为55.3％，病叶率为16.34％，病情指数为4.44，相对防效为49.2％，每亩用药成本比一般常规田多投入8.8元，但亩产量则增加了4公斤，亩产值增加了178元，每亩增加比例为11.5％。扣除增加成本，每亩增收169.2元。示范面积3600亩，共增加经济效益为609120元。
表2.嵩明示范点烟草赤星病抗性治理防效调查统计表
表3.嵩明点烟草赤星病抗性治理经济效益统计表
实施例二文山州麻栗坡县烟草赤星病对菌核净抗药性治理试验示范根据烟草赤星病对菌核净抗药性调查表明，文山州麻栗坡县烟草赤星病对菌核净已产生较高水平的抗药性。2006年在该县进行抗性治理试验示范，结合选用抗病品种；培育无病壮苗；适时科学移栽；合理调配水肥；搞好田间卫生；适度封顶、适时采收等栽培技术措施，选用化学农药宝丽安、秀安和赤斑特替代菌核净按照常规剂量和施药方法交替使用防治烟草赤星病，抗性治理调查结果见表4。结果表明，采用抗性治理措施后烟草赤星病在采烤期病情指数为0.8，较对照区降低0.3，从调查结果看，示范区发病比对照轻，经济效益比对照高，上等烟比例高4.3个百分点，均价高0.35元，亩产值高130.06元。投入成本示范区用赤斑特比对照区用菌核净每亩少1.2元，则每亩增收131.26元。示范面积100亩，示范区共增加经济效益为13126元。
表4.麻栗坡示范点烟草赤星病抗药性治理结果调查表
实施例三楚雄州南华县烟草赤星病对菌核净抗药性治理试验示范根据烟草赤星病对菌核净抗药性调查表明，楚雄州南华县烟草赤星病对菌核净已产生较高水平的抗药性，2006年在该县进行抗性治理试验示范，结合选用抗病品种；培育无病壮苗；适时科学移栽；合理调配水肥；搞好田间卫生；适度封顶、适时采收等栽培技术措施，选用化学农药宝丽安、秀安和赤斑特替代菌核净按照常规剂量和施药方法交替使用防治烟草赤星病。抗性治理调查结果见表5和6。示范区内赤星病及其它病虫发生较少，烟株清秀，示范效果明显。示范区赤星病病情指数控制在0.5以内，辐射带动了周边非示范区也取得了较好的防治效果，周边非示范区常规田赤星病平均病指仅为0.31。示范区最终取得了较好的经济效益，示范区较非示范区上等烟比例增加8.62％，均价增加0.47元，亩产量增加13.7公斤，亩产值增加230.94元，每亩降低防治成本14元，则每亩增加效益244.94元。示范面积504亩，共增加经济效益123449.76元。
表5.南华示范点烟草赤星病抗性治理防效调查统计表
表6.南华示范点烟草赤星病抗性治理经济效益统计表
实施例四大理州祥云县烟草赤星病对菌核净抗药性治理试验示范根据烟草赤星病对菌核净抗药性调查表明，大理州祥云县烟草赤星病对菌核净已产生较高水平的抗药性，2006年在该县进行抗性治理试验示范，结合选用抗病品种；培育无病壮苗；适时科学移栽；合理调配水肥；搞好田间卫生；适度封顶、适时采收等栽培技术措施，选用化学农药宝丽安、秀安和赤斑特替代菌核净按照常规剂量和施药方法交替使用防治烟草赤星病。抗性治理调查结果见表7和表8。示范区内病虫害发生普遍较轻，烟草赤星病相对防效在43.62％~89.41％之间。示范区亩产量达到179.7公斤、亩产值2052.31元，分别比对照提高35.52公斤、494.45元。示范区均价提高0.62元。示范区防治成本为66.95元/亩，对照区为93.69元/亩，防治成本减少26.74元。示范区每亩增加经济效益512.2元。示范面积1000亩，共增加经济效益51.22万元。
表7.祥云示范点烟草赤星病抗性治理防效调查统计表
表8.祥云示范点烟草赤星病抗性治理经济效益统计表
权利要求
1.一种烟草赤星病对菌核净抗药性治理的方法，包括农业栽培技术措施、烟草赤星病的化学防治，其特征在于(1)本方法中烟草赤星病防治所用的化学农药为宝丽安、秀安和赤斑特，施药方式为交替使用该三种化学农药；(2)本方法所用化学农药宝丽安、秀安和赤斑特由下列步骤得到a.烟草赤星病菌分离纯化和鉴定采集云南省12个州市烟草赤星病样品397个，通过分离纯化，鉴定出烟草赤星病菌337株；b.烟草赤星病菌对菌核净的抗药性测定采用生长速率法测定337株烟草赤星病菌对菌核净的抗性水平，参照FAO标准将抗性表型划分为4类敏感，EC50≤5.0μg/mL；低抗，5.0＜EC50≤10.0μg/mL；中抗，10.0＜EC50≤50.0μg/mL；高抗，50.0μg/mL＜EC50；测定的烟草赤星病菌337株中敏感菌株9株，占2.67％；低抗菌株111株，占32.94％；中抗菌株206株，占61.13％；高抗菌株11株，占3.26％；c.不同化学农药对烟草赤星病菌交互抗药性试验采用生长速率法测定17种药剂对烟草赤星病菌菌核净敏感和抗性菌株的EC50值，根据交互抗性原理，对菌核净抗性菌株的EC50值较敏感菌株低的化学药剂与菌核净之间存在负交互抗性，测定中宝丽安、秀安和赤斑特对菌核净抗性菌株的EC50值较敏感菌株低，表明它们与菌核净存在负交互抗性，认定宝丽安、秀安和赤斑特为治理烟草赤星病对菌核净抗药性的有效药剂。
全文摘要
本发明涉及一种烟草赤星病菌对菌核净抗药性治理的方法，属于植物保护学和农药学领域。本发明筛选出与菌核净存在负交互抗性的宝丽安、秀安和赤斑特3种化学农药，在烤烟生产上替代菌核净交替施用防治对菌核净产生抗药性的烟草赤星病。本发明通过分离纯化鉴定烟草赤星病菌(Alternaria.alternata)，测定赤星病菌对菌核净的抗药性水平，不同农药之间的交互抗性试验，利用宝丽安、秀安和赤斑特3种与菌核净存在负交互抗性的化学农药，并结合农业栽培措施进行烟草赤星病对菌核净的抗药性治理。本发明具有操作简便，防效较高，有利于减少化学农药使用量，减少烟叶农药残留，提高烟叶安全性，延长农药使用寿命等优点，在烟草赤星病抗药性治理方面具有良好的应用前景。
文档编号A01P15/00GK101032250SQ20071006567
公开日2007年9月12日 申请日期2007年2月12日 优先权日2007年2月12日
发明者祝明亮, 白江兰, 李梅云 申请人:云南省烟草科学研究所