专利名称：一种烟草黑胫病对甲霜灵抗药性治理的方法
技术领域：
本发明涉及一种烟草黑胫病对甲霜灵抗药性治理的方法，属于植物保护学和农药学领域。
背景技术：
烟草黑胫病菌最早是由Breda de Haan于1896年在印度尼西亚的爪哇首次发现和描述的，并将其命名为烟草疫霉(Phytophthora parasitica var.nicotianae(Breda de Hean)Tucker)，由该病菌引起的烟草黑胫病是一种分布广泛，为害严重的世界性烟草主要病害之一。烟草黑胫病菌可以在烟草的任何生育阶段侵染为害，但主要为害大田期烟株。苗期发病往往造成烟苗成片死亡，成猝倒状；大田期发病则可以造成整个烟株突然凋萎并伴有根部或茎基部变黑症状，常造成无法挽救的损失。我国20世纪80年代以后随着烟草种植面积的扩大，烟草黑胫病迅速扩展。据1989～1991年全国16个省市主要烟区调查，除黑龙江省尚未发生外，其余各烟区均有发生，以河南、山东、安徽、云南等省发生较重，一般发病率为5％～15％，重者达30％以上，给烟草生产造成很大损失。特别是近年来，随着烟草种植年限延长，全国各烟区发病情况日趋严重。在全国烟草病虫害预测预报网络中已将该病作为重点测报对象之一。
长期以来，主要依靠化学农药防治烟草黑胫病，其有效防治药剂主要是甲霜灵。甲霜灵是瑞士Ciba-Geigy公司推出的苯酰胺类杀菌剂，是防治疫霉菌所致病害的特效药，在实验室条件下1μg/mL即可抑制大多数疫霉菌的菌丝生长。由于甲霜灵(metalaxy)在内吸性、生物活性和持效期等方面均优于同类化合物，因而，在同类杀菌剂中，该药剂在生产上使用最为广泛。但由于甲霜灵对病原菌的作用位点单一，病菌容易对其产生抗药性，已有研究证实自然界存在对甲霜灵敏感性不同的疫霉菌菌株。关于烟草黑胫病菌对甲霜灵的抗药性已有研究报道。Shew测定了317株烟草黑胫病菌对甲霜灵的敏感性，结果表明，甲霜灵浓度为0.1、1.0和10μg/mL时，对烟草黑胫病菌的抑制率分别为8％～57％、46％～85％和89％～95％，而抗甲霜灵菌株在浓度为1020μg/mL时，抑制率才达到80％；Shew对连续使用3年甲霜灵的烟田内877株烟草黑胫病菌的测定结果表明，甲霜灵对各年分离的烟草黑胫病菌的EC50分别为第1年(不用药)0.4μg/mL，第2年(用药)0.3μg/mL，第3年(用药)0.7μg/mL，第4年(用药)1.2μg/mL。我国王革等1994～1995年调查测定了分离自云南省烟区的95株烟草黑胫病菌对甲霜灵的敏感性水平，结果发现它们的EC50值在0.0031～0.343μg/mL之间，平均为0.0325μg/mL，未检测到对甲霜灵具有抗性的菌株；袁宗胜等2001年报道了采集自中国主要烟区的21株烟草黑胫病菌对甲霜灵的敏感性水平，发现它们的EC50值在0.0573～0.8485μg/mL之间，平均为0.2132μg/mL。
烟草黑胫病作为烟草生产上的一种主要病害，目前仍然以甲霜灵作为最主要的防治药剂和手段。在生产实践中存在长期单一用药和不合理施药而引发药剂对病原菌的定向选择作用，导致病原菌抗性群体的积累和扩散。已有研究证明连续使用甲霜灵后，可以增加烟草黑胫病菌对甲霜灵不敏感菌株的群体，而且一旦出现抗性菌株，其群体将迅速扩大。而且随着甲霜灵在烟草生产上的长期大量使用，烟草黑胫病菌逐步产生抗药性，导致防治效果急剧下降甚至完全失效，给烟草生产造成了重大的经济损失。
烟草黑胫病抗药性的发生和蔓延为烟草生产防治该病带来了较大的困难，同时缩短了甲霜灵在烟草生产上的使用寿命。研究开发有效的抗性治理技术是烟草生产上急需解决的重要课题，同时对植物病害抗药性治理研究具有重要的指导作用。目前在烟草黑胫病对甲霜灵抗性治理方面尚无有效的技术措施。经文献检索，未发现与本发明内容相同文献的公开报道。
发明内容
本发明的目的是针对烟草黑胫病对甲霜灵产生抗药性后的抗性治理技术的开发应用，解决烟草生产上黑胫病的防治问题，通过黑胫病菌对甲霜灵抗药性的交互抗性研究，开发一种经济高效的烟草黑胫病对甲霜灵抗性治理的方法。
本发明通过2004～2006年从云南省12个烟区采集分离烟草黑胫病菌142株，采用生长速率法测定了它们对甲霜灵的抗药性，结果表明，云南省主要烟区黑胫病菌都有抗甲霜灵菌株出现，其中敏感菌株占6.34％，中抗菌株占11.97％，高抗菌株占81.69％。与王革等1994～1995年调查结果相比，抗性水平呈上升趋势、范围呈扩大之势。
然后根据植物病虫害交互抗性原理，以分离自田间的黑胫病菌敏感菌株和抗性菌株为材料，通过室内生长速率法测定化学农药对敏感菌株和抗性菌株的交互抗性情况，获得与甲霜灵存在负交互抗性的烟草黑胫病防治药剂菌克和秀安，以这2种药剂作为黑胫病菌对甲霜灵抗药性治理的替代药剂，按照常规剂量和施药方法进行交替使用防治对甲霜灵产生抗药性的烟草黑胫病。
同时，根据植物病原菌抗药性治理策略基本原理，采用综合防治的措施，针对烟草黑胫病已产生抗药性的烟区，通过选用较抗黑胫病烟草品种G28、K346、K326、云烟85等；实行合理轮作，选择水旱轮作地块，特别避免选择与茄科作物轮作、间作的地块栽烟；精细整地，科学起垄，防止积水；结合当地气候条件，适时移栽，使烟株易感病阶段与高温多雨的流行气候错开，达到防病避病目的；使用充分腐熟消毒的农家肥，防止人为传播发病，及时清除病残株及田间杂草，保持烟田卫生；结合当地生产实际，烟株旺长初期及时揭膜，减少染病机会等技术措施减少病原菌侵染，降低病害水平，达到治理烟草黑胫病对甲霜灵的抗性，提高防治效果，减少烟草损失的目的，并有利于阻止和延缓烟草黑胫病菌对甲霜灵抗药性的进一步发展，延长其使用寿命。
本发明是这样实现的烟草黑胫病菌的分离、纯化与鉴定黑胫病菌分离选择性培养基为RDA培养基，配方为利福平胶囊21粒加乙醇(100％)100毫升，并加入1N NaOH至溶解，制成30000微克/毫升的原液，置4℃下备用。青霉素母液胶囊一粒250mg溶于50ml灭菌水。5-氯硝基苯称100mg溶于20ml灭菌水。每100mlPDA培养基各加1ml，混匀后倒平板。
黑胫病菌分离方法为将黑胫病样品分别用2种方法作表面消毒，一是单以70％酒精消毒10分钟，二是酒精消毒后经灭菌水浸洗，再用0.1％升汞消毒30-60秒钟。消毒后的病样置RDA平板上，每地病样4皿，每皿4块病组织。25℃下培养4天，挑取菌落边缘移置入新的RDA平板，25℃下培养，如此分离纯化几次后，编号并保存，按Lucas方法鉴定。
2004、2005和2006年分别从云南省文山、楚雄、玉溪、大理、昭通、红河、曲靖、昆明、临沧、思茅、丽江、版纳等12个州市采集烟草黑胫病样品82、139和135个，通过分离纯化，分别鉴定出烟草黑胫病菌34株、51株和57株，3年共计分离纯化烟草黑胫病菌142株。
烟草黑胫病菌对甲霜灵的抗药性测定抗药性测定药剂为93％甲霜灵(Metalaxyl)原药，由浙江省温州农药一分厂生产提供。抗药性测定采用生长速率法将供试菌株在燕麦培养基(CA)上培养7d，于菌落中心等距，菌丝生长均匀处用无菌打孔器制备直径0.5cm的菌饼，用于毒力测定。CA培养基灭菌冷却至50℃左右时加入甲霜灵药剂混匀，制成浓度分别为0.01、0.1、0.5、1、5、10μg/mL的含药CA平板上，25℃下培养，每天早晚观察1次，直至空白对照培养皿(药剂浓度为0)内菌丝长满时测量各处理菌落直径。每处理3次重复，计算相对抑制率(％)＝([(对照菌落直径-菌饼直径)-(处理菌落直径-菌饼直径)]/(对照菌落直径-菌饼直径)×100％)。根据生物统计几率值换算表，将抑制百分率换算成抑制几率值。以浓度对数为横坐标，抑制几率值为纵坐标，计算甲霜灵对供试菌株的毒力回归方程和有效中浓度(EC50)。
烟草黑胫病菌对甲霜灵抗性表型划分以菌株在甲霜灵浓度平板上菌落生长致死中浓度(EC50)为标准，将抗性表型划分为3类敏感，EC50≤0.001μg/ml；中抗，0.001＜EC50＜0.01μg/ml；高抗，LD50≥0.01μg/ml。
抗性测定结果表明，云南省各烟区赤星病菌都有抗菌核净菌株出现，其中敏感菌株9株，占6.34％；中抗菌株17株，占11.97％；高抗菌株116株，占81.69％。
不同化学农药对烟草黑胫病菌交互抗药性试验试验药剂为58％甲霜锰锌可湿性粉剂，由江苏宝灵化工股份有限公司(南通染化厂)生产；70％甲基托布津可湿性粉剂，由日本曹达株式会社生产；64％杀毒矾可湿性粉剂，由先正达(苏州)作物保护有限公司生产；40％菌核净可湿性粉剂，由温州市鹿城植保化学有限公司生产；75％百菌清可湿性粉剂，由山东大成农药股份有限公司生产；10％宝丽安可湿性粉剂，由日本科研制药株式会社生产；50％敌克松(敌磺钠)可湿性粉剂，由上海金桥化工有限责任公司生产；80％金络可湿性粉剂，利民化工有限责任公司生产；72.2％霜霉威(盐酸盐)水剂，由江苏苏化集团新沂农化有限公司生产；48％东旺(霜霉络铜)，由北京市东旺农药厂生产；65％俊尔(二氰锰锌)可湿性粉剂，由浙江禾益农化有限公司生产；72％苯霜灵锰锌可湿性粉剂，由浙江一帆化工有限公司生产；20％移栽灵(稻恶)乳油，由湖北移栽灵农业科技股份有限公司生产；55％菌斑净可湿性粉剂，由温州市斯佩斯化工农药有限公司生产；50％秀安(异菌脲)可湿性粉剂，由浙江禾益农化有限公司生产；45％菌克(菌核.王铜)可湿性粉剂，由浙江禾益农化有限公司生产；10％菌霸可湿性粉剂，由浙江一帆化工有限公司生产。
各药剂对敏感和抗性菌株EC50值的测定采用生长速率法将供试药剂分别用无菌水配成一定浓度的母液，取700μL供试药剂系列母液加入到70ml已融化并冷却至50℃左右的PDA培养基中，充分混匀后均匀倒入4个灭菌培养皿中，制成系列浓度为0.01、0.1、1、10、50、100μg/mL的含药培养基，以加入等体积无菌水的PDA平板为对照。将在PDA培养基上培养5～7d的菌株，用Φ5mm的打孔器于距菌落中心等距，菌丝生长均匀处打取菌饼，移到含有各种药剂系列浓度的PDA培养基平板上，每皿一片，置于26℃恒温箱内培养，4d后测量菌落直径，与对照比较不同杀菌剂处理对菌落扩展的生长抑制率，分析比较不同药剂对供试病菌菌丝生长的影响。根据生物统计几率值换算表，将抑制百分率换算成抑制几率值。以试验中设定的浓度对数为横坐标，抑制几率值为纵坐标，计算药剂的毒力回归直线方程，有效中浓度EC50。
试验结果见表1。17种药剂对黑胫病菌敏感菌株的EC50值在0.01以下的药剂种类有甲基托布津、杀毒矾、菌核净、宝丽安、敌克松、金络、东旺、苯霜灵-锰锌、秀安、菌克和菌霸等11种，这些药剂烟草黑胫病菌较为敏感。根据交互抗性原理，对甲霜灵抗性菌株的EC50值较敏感菌株低的化学药剂与菌核净之间存在负交互抗性。从表1中可见，11种有效药剂中只有菌克和秀安对甲霜灵抗性菌株的EC50值较敏感菌株低，说明它们与甲霜灵存在负交互抗性。因此，治理烟草黑胫病对甲霜灵抗药性的有效药剂为菌克和秀安。
表1.17种化学农药对黑胫病菌甲霜灵敏感和抗性菌株的交互抗性结果
烟草黑胫病对甲霜灵抗药性治理试验示范在烟草黑胫病菌对甲霜灵产生较高抗性水平，防治效果下降的烟区，结合选用抗病品种；实行合理轮作；精细整地，科学起垄；适时早栽；卫生栽培；适时揭膜等栽培技术措施，根据黑胫病发生情况选用与甲霜灵具有负交互抗性的菌克和秀安按照常规剂量和施药方法交替使用防治烟草黑胫病。2006年分别在曲靖市罗平县板桥镇和钟山乡进行烟草黑胫病抗药性治理试验示范，示范面积均为2000亩，示范点烟草黑胫病均得到有效控制，示范区增加的经济效益分别为27.6和29.2万元。抗性治理示范总面积为4000亩，增加经济效益56.8万元。
具体实施例方式以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。实施例的详细步骤同发明内容部分所述。
实施例一曲靖市罗平县板桥镇烟草黑胫病对甲霜灵抗药性治理试验示范根据烟草黑胫病对甲霜灵抗药性调查表明，曲靖市罗平县板桥镇烟草黑胫病对甲霜灵已产生较高水平的抗药性。2006年在该镇进行抗性治理试验示范，结合选用抗病品种；实行合理轮作；精细整地，科学起垄；适时早栽；卫生栽培；适时揭膜等栽培技术措施，根据黑胫病发生情况选用与甲霜灵具有负交互抗性的菌克和秀安按照常规剂量和施药方法交替使用防治烟草黑胫病。抗性治理调查结果见表2。结果表明，采用抗性治理措施后示范区不同施药时期烟草黑胫病病情指数有所下降，防治效果在65.2％以上，抗性治理效果明显。示范区亩产量增加7公斤，亩产值增加129元，上中等烟比例提高2.7个百分点，每亩防治成本下降9元，每亩增加经济效益138元。示范面积2000亩，示范区增加经济效益27.6万元。
表2.板桥镇示范点烟草黑胫病对甲霜灵抗药性治理调查统计表
实施例二曲靖市罗平县钟山乡烟草黑胫病对甲霜灵抗药性治理试验示范根据烟草黑胫病对甲霜灵抗药性调查表明，曲靖市罗平县钟山乡烟草黑胫病对甲霜灵已产生较高水平的抗药性。2006年在该乡进行抗性治理试验示范，结合选用抗病品种；实行合理轮作；精细整地，科学起垄；适时早栽；卫生栽培；适时揭膜等栽培技术措施，根据黑胫病发生情况选用与甲霜灵具有负交互抗性的菌克和秀安按照常规剂量和施药方法交替使用防治烟草黑胫病。抗性治理调查结果见表3。结果表明，采用抗性治理措施后示范区不同施药时期病情指数有所下降，防治效果在63.2％以上，抗性治理效果明显。示范区亩产量增加8公斤，亩产值增加138元，上中等烟比例提高3.9个百分点，每亩防治成本下降8元，每亩增加经济效益146元。示范面积2000亩，示范区增加经济效益29.2万元。
表5-10钟山示范点烟草黑胫病抗性治理调查统计表
权利要求
1.一种烟草黑胫病对甲霜灵抗药性治理的方法，包括农业栽培技术措施、烟草黑胫病的化学防治，其特征在于(1)本方法中烟草黑胫病防治所用的化学农药为菌克和秀安，施药方式为按常规方法交替使用该两种化学农药；(2)本方法所用化学农药菌克和秀安由下列步骤得到a.烟草黑胫病菌分离纯化和鉴定采集云南省12个州市烟草黑胫病样品356个，通过分离纯化，鉴定出烟草黑胫病菌142株；b.烟草黑胫病菌对甲霜灵的抗药性测定采用生长速率法测定142株烟草黑胫病菌对甲霜灵的抗性水平，将抗性表型划分为3类敏感，EC50≤0.001μg/ml；中抗，0.001＜EC50＜0.01μg/ml；高抗，LD50≥0.01μg/ml；所测定142株烟草黑胫病菌包括敏感菌株9株，占6.34％；中抗菌株17株，占11.97％；高抗菌株116株，占81.69％；c.不同化学农药对烟草黑胫病菌交互抗药性试验采用生长速率法测定17种药剂对烟草黑胫病菌甲霜灵敏感和抗性菌株的EC50值，根据交互抗性原理，对甲霜灵抗性菌株的EC50值较敏感菌株低的化学药剂与甲霜灵之间存在负交互抗性，测定中菌克和秀安对甲霜灵抗性菌株的EC50值较敏感菌株低，表明它们与甲霜灵存在负交互抗性，认定菌克和秀安为治理烟草黑胫病对甲霜灵抗药性的有效药剂。
全文摘要
本发明涉及一种烟草黑胫病菌对甲霜灵抗药性治理的方法，属于植物保护学和农药学领域。本发明筛选出与甲霜灵存在负交互抗性的菌克和秀安2种化学农药，在烤烟生产上替代甲霜灵交替施用防治对甲霜灵产生抗药性的烟草黑胫病。本发明通过分离纯化鉴定烟草黑胫病菌－烟草疫霉(Phytophthora parasitica var. nicotianae)，测定黑胫病菌对甲霜灵的抗药性水平，不同农药之间的交互抗性试验，利用菌克和秀安2种与甲霜灵存在负交互抗性的化学农药，并结合农业栽培技术措施进行烟草黑胫病对甲霜灵的抗药性治理。本发明具有操作简便，防效较高，有利于减少化学农药使用量，减少烟叶农药残留，提高烟叶安全性，延长农药使用寿命等优点，在烟草黑胫病抗药性治理方面具有良好的应用前景。
文档编号A01P3/00GK101032255SQ20071006569
公开日2007年9月12日 申请日期2007年2月27日 优先权日2007年2月27日
发明者祝明亮, 李梅云, 曾嵘, 白江兰 申请人:云南省烟草科学研究所