专利名称：一种植物抗逆诱导剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物抗逆性诱导剂，具体地说是用壳寡糖诱导植物抗旱、 抗涝、抗冻和抗寒性。
背景技术：
抗逆剂是指施在土壤或作物上能增强作物本身抗逆性的化学物质的总 称，近年来生产上研究应用得比较多的主要有以下种类。
抗旱剂l.FA旱地龙是以黄腐酸为主要原料精制而成的多功能植物 抗旱生长营养剂和植物抗蒸腾剂，是有旱抗旱保产、无旱促进增产的理想
药剂。2.6-BA和外源脱落酸(ABA): 6-BA通过调节内源激素水平，阻止水 分胁迫下作物的光合速率、叶绿素含量和叶片水势的下降，提高RuBP羧化 酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性，降低气孔阻力和MDA含量，从而 减轻水分胁迫下活性氧对细胞膜的伤害，增强作物抗旱性。ABA主要通过 调节内源激素而影响作物抗旱性，是植株体内在逆境条件下产生的主要适 应调节物质。3.ABT生根粉是一种广谱、高效、无毒的复合型植物生长调 节剂，又称生根促进剂，其作用机理主要是加快种子萌发，促进种子根的 显著伸长和叶面积的迅速扩大，有利于形成强大的次生根系，增强植株保 水力，提髙作物抗旱性，达到抗旱节水增产的效果。4. 2， 4-D、乙烯利(CEPA)、 多效唑(CCC)和三唑酮水分胁迫条件下，2， 4. D和CEPA施用改变了作物 体内代谢水平，影响物质合成、积累及转运等一系列生理生化过程，最终 反映在生长的生物物理参数变化上，影响作物的生长发育。CCC和三唑酮 能调节作物体的内源激素，抑制顶端生长优势和细胞伸长，促进根系大量 生长，使植株抗旱性显著增强。5.MFB多功能抗旱剂是以天然甜菜碱为主 要成分并经科学组配不同植物营养元素研制而成的一种非毒性渗透调节抗 旱剂，其作用机理是能改善作物体内代谢，提高植株体的束缚水含量，维 持较长的绿叶功能期，从而提高作物抗旱性，促进籽粒灌浆，增加作物产 量(张卫星，赵致，廖景容，吴盛黎(2004)作物抗旱剂的应用研究进 展.中国农学通报.20 (6) : 334-339)。
抗涝剂释氯剂、膜稳定剂、活性氧清除剂及细胞激素等化学调控剂 (抗涝剂)进行调控，可缓解或部分消除淹涝对水稻的不良影响。无论是 在淹涝前还是淹涝后喷施抗涝剂(多德利)，对提高水稻耐淹涝能力都有 较好的效果。
抗冻剂稀土，脱落酸和抗冻蛋白等对植物抗寒抗冻有一定作用。 值得注意的是以上各种抗逆剂能够提供植物抗性，但不能同时提高植物抗病性。作为植物诱导剂的壳寡糖能够提高植物抗逆性，包括提高植物 抗病性。来源于甲壳动物壳中的几丁质和壳聚糖，也是许多真菌细胞壁的
组成成分。其具有多方面的生理功能。几丁质是N-乙酰氨基葡萄糖通过p-l,4
键连接而形成的线性多聚糖，其部分脱乙酰化的产物即为壳聚糖。几丁质 的溶解性很差,壳聚糖能溶于弱酸中，因此壳聚糖较几丁质有较多的应用。 壳聚糖不仅能有效的诱导植物抗病性，在田间对作物病害的防治有明显的 效果，而且对植物病原菌生长有抑制作用。壳聚糖被认为是很有应用潜力 的激发子。但是，由于几丁质和壳聚糖的水溶性差，限制了它们在农业生 产上的应用。因此，水溶性好的寡糖引起了人们的极大关注。作者所在的 课题组应用酶法降解壳聚糖获得的壳寡糖有多方面的生理功能。聚糖、寡 糖在植物体中具有信号识别和传递的作用，其中有些可以作为一种信号分 子调控植物的生长发育和植物抵抗逆境的防卫反应。有人研究了脱乙酰化 几丁质(壳聚糖)对作物抗性的影响，发现其抗性酶活性提高(张学昆，
唐章林，谌禾U，李加纳(2002).脱乙酰化几丁质的乙酰化程度对诱导油菜 抗性的影响.中国农业科学35(3): 287-290.)。目前，关于壳寡糖对植物抗 性酶活性影响与植物抗性机制关系的研究在一些真菌、细菌病害上已见报 道(李曙光，白雪芳，杜昱光(2002).壳寡糖的分离分析及其诱抗活性研 究.中国海洋药物(6) : 1-3.杜昱光，白雪芳，赵小明(2002).壳寡糖对 烟草防御酶活性及同工酶酶谱的影响中国生物防治18 (2) : 83-86)。
寡聚半乳糖醛酸及壳聚糖能够诱导西红柿和鸭跖草气孔开度减少(Lee S., Choi H., Suh S， Doo I. S. ,Oh K. Y. ,CHoi E. J. ,Ann T. ,Taylor S. ,Low P.S. and Lee Y(199外Oligogalacturonic Acid and Chitosan Reduce Stomatal Aperture by Inducing the Evolution of Reactive Oxygen Species from Guard Cells of Tomato and Commelina communis. Plant Physiol 121: 147-152.)。壳聚
糖能够诱导辣椒叶片气孔开度减小，从而较少水份蒸腾，达到抗旱节水的目 的(MarcoB.，MarkusF.， Gaylon C. S. , Everett N. J. ( 2001). Reduction of transpiration through foliar application of Chitosan. Agric. For. Meteorol. 107: 33, 167-175.)。作者发现壳寡糖与壳聚糖相比,诱导植物抗逆性效果更佳。
发明内容
本发明的目的在于提供一种诱导效果好、无污染的植物抗逆诱导剂。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为 一种植物抗逆诱导剂，其以壳寡糖溶液为有效活性成份。
所述壳寡糖溶液的浓度为l-100mg/L，最好为50mg/L 75mg/L;所述 壳寡糖溶液采用的溶剂为水或质量浓度为0-0.1%的醋酸；所述壳寡糖的脱 乙酰度>90%，聚合度2-10。
所述壳寡糖溶液用于诱导植物提高其抗逆性，应用时，将壳寡糖溶液 根灌或喷施于作物叶片上，亩喷施量30-50公斤或亩根灌150-300公斤。利用壳寡糖喷施作物叶片诱导其抗逆(抗旱、抗冻抗寒和抗涝)通 过诱导作物不同程度提高抗性酶活性，明显提高作物脯氨酸含量，气孔开 度明显下降，叶绿素含量提高等提高了作物的抗逆性。 本发明具有如下优点
1. 发明人发现壳寡糖能够诱导作物抗旱。本发明采用壳寡糖诱导作物 抗逆，可视的抗逆结果有力地证明壳寡糖能够诱导作物提高抗逆性。
2. 壳寡糖既能诱导植物抗病性，又能诱导植物抗旱、抗涝和抗寒，对 环境友好，不污染环境。
3. 原料丰富，成本较低。其作为新型生物农药具有广泛的前景。
4. 本发明外施壳寡糖能提高植物抗性，而且无毒不引起环境污染，使 用方法简单。
图1壳寡糖对油菜抗旱性的影响(喷一次，断水第9d);
图2壳寡糖处理油菜抗氧化酶活性的影响；
图3壳寡糖处理油菜抗氧化酶活性的影响；
图4壳寡糖处理油菜1次对气孔开度的影响；
图5壳寡糖处理油菜3次对气孔开度的影响；
图6壳寡糖对低温胁迫下油菜抗性酶活性的影响；
图7壳寡糖对低温胁迫下油菜脯氨酸含量的影响；
图8壳寡糖对水淹胁迫下油菜抗性酶活性的影响；
图9壳寡糖与诱导作物抗旱性效果比较。
具体实施例方式
本发明采用的测定方法包括 1.生理
叶绿素含量的测定用丙酮乙醇提取液(V: V=l: l)叶绿素，用分光
光度计分别测A645、 A663，叶绿素aCa(mg'g"^(12.72A66广2.59A645) V/1000W，叶绿素bCb(mg.g")气22.88A645—4.67A663)V/1000W，式中八645、 A663分别为叶绿素提取液在663 nm和645 nm处的光密度，V为提取体积(ml)， W为材料干重(g)。
气孔开度的测定撕取叶片下表皮，迅速地放入无水乙醇中固定，保 存。把固定好的表皮放在载玻片上，加一滴无水乙醇，盖上盖玻片，用显 微镜观察气孔开度，用显微测微尺测量气孔开度。
2、生化 一 提取粗酶液的方法，取l g叶片置于6ml50mmol/L磷酸缓冲液(ph7.8，内 含1XPVP)，在冰浴中研磨提取酶液，匀浆以10000g ， 4。C离心20min，取
上清为粗酶液，-20°(:备用。
按SOD抑制氮蓝四唑(NBT)光化还原法测定反应体系中含50 mmol/L磷酸缓冲液，13mmol/L甲硫氨酸，75 pmol/L氮蓝四唑(NBT)， 100nmol/L EDTA和4iimol/L核黄素。先在日光灯(4000Lux)下反应10min，然后以黑 暗终止反应，在560nm下比色。以抑制NBT光化还原的50M为一个酶活性单 位。 一
POD活性的测定，反应液中含2.9ml0.05mol/L磷酸缓冲液、1 ml 0.25% 愈创木酚溶液、O.lmL酶液、lml2%H202。连续记录测定25 。C下460nm吸 光值的变化。
脯氨酸含量测定0.5g叶片，放入具塞试管，加入5 tnl 3%的磺基水杨 酸，沸水浴10min，冷却后过滤于带塞玻璃试管中(对照加2ml蒸馏水)，然 后依次加入2ml冰醋酸及4ml酸性茚三酮，盖上玻璃塞，再次沸水浴60min， 冷却后加入4ml甲苯，振荡60s，静置片刻，用胶头吸管取上层萃取液于520 nm波长下比色测定。
实施例l
油菜幼苗分别栽种于同样大小的装有等量、同土质的盆内，浇以充足 的水后分成36组，
l组为无任何胁迫dH20处理的对照l;
8组叶面喷壳寡糖(壳寡糖的脱乙酰度〉90%，聚合度2-10，亩喷施量 30公斤)浓度分别为0 (对照2) 75mg/L连续喷3天，每天喷施1次， 上述材料进行断水。处理温度16-27°C，相对湿度30%-80%，发现叶面 喷50mg/L 75mg/L每天一次或连续喷3天每天喷施1次的提高了作物的 抗旱性；
8组根灌壳寡糖(壳寡糖的脱乙酰度〉90%，聚合度2-10，亩根灌150 公斤)浓度分别为0 (对照2) 75mg/L，连续3天，每天l次，上述材 料进行干旱处理(土壤含水量为3.31%-6.02%)，温度16-27°C，相对湿度 30%-80%，发现根灌50 mg/L 75mg/L的提高了作物的抗旱性；
8组叶面喷壳寡糖(壳寡糖的脱乙酰度>90%，聚合度2-10，亩喷施量 30公斤)浓度分别为0 75mg/L后上述材料进行低温处理(-8°C-0°C)发 现叶面喷50 mg/L 75mg/L 1次的提高了作物的抗冻、抗寒性；
8组叶面喷壳寡糖(壳寡糖的脱乙酰度>90%，聚合度2-10，亩喷施量 30-公斤)浓度分别为0 (对照2) 75mg/L后水淹上述材料叶面喷50 mg/L 75mg/L连续喷3天每天喷施1次的提高了作物的抗涝性。
3组上述材料叶面喷dH20 (对照2) ， 50 mg/L壳寡糖或500mg/L壳聚糖。
分别于取第3、 4片展叶进行抗性酶、游离脯氨酸含量、气孔开度及叶 绿素含量的测定。发现干旱胁迫下叶片抗性酶含量不同程度提高，作物脯 氨酸含量明显提高，气孔开度减小，叶绿素含量提高。低温胁迫和水淹胁 迫下，叶片抗性酶含量不同程度提高。一、壳寡糖对油菜抗旱性的影响
用蒸馏水及浓度分别为25mg/L、 50mg/L、 75mg/L的壳寡糖，分别喷3 次(每天一次，连续喷3天)或根灌后，进行断水试验，断水后以上4组幼苗第 3d开始萎蔫，第9d用蒸馏水及浓度为25 mg/L的壳寡糖处理的喷l次及3次的 幼苗严重萎蔫，50 mg/L和75 mg/L的壳寡糖处理的喷l次及3次幼苗中度萎蔫 (图l)。第12d用蒸馏水及浓度为25mg/L的壳寡糖处理的喷l次及3次的幼 苗干旱死亡，50 mg/L和75 mg/L的壳寡糖处理的喷l次及3次幼苗严重蒌蔫。 第19d用浓度为50mg/L和75 mg/L的壳寡糖处理l次及3次的幼苗干旱死亡。
二、壳寡糖对干旱胁迫下油菜抗性酶活性的影响
1壳寡糖处理对油菜SOD酶活性的影响
如图2-2a所示，干旱胁迫(对照2，对照3)与非胁迫(对照1)相比 其SOD活性明显下降(P0.05)。
干旱胁迫下，25mg/L壳寡糖处理与蒸馏水处理(对照2)的相比在第 3d其SOD活性变化不显著(P0.05)，第6d，第9d其SOD活性显著提高 (P<0.05)。 50mg/L壳寡糖处理与对照2相比在第3d和第6d SOD活性显著 下降(P0.05)，第9d其SOD活性明显提高(P0.05)。 75mg/L壳寡糖处理与 对照2相比第3d其SOD活性变化不明显，第6d明显下降，第9d明显升 高(P0.05)(表2-2a)。
不同浓度壳寡糖处理油菜3次的SOD活性的变化如图2-2c所示，干旱 胁迫下，25mg/L壳寡糖处理与蒸馏水处理相比，在第3d其SOD活性显著 下降；第6d，第9d其SOD活性显著升高(P0.05)。 50mg/L壳寡糖处理在 第3d显著下降；第6d，第9d SOD活性显著升高(P0.05)。 75mg/L壳寡 糖处理其SOD活性在第3d其SOD活性变化不大；第6d，第9d其SOD活 性明显升高(P〈0.05)。
2壳寡糖处理对干旱胁迫下油菜POD酶活性的影响
如图2b所示,干旱胁迫后油菜幼苗POD活性与非干旱胁迫相比第3天 略升高，第6d，第9dPOD活性比非干旱胁迫相比显著下降(P0.05)。
不同浓度壳寡糖处理油菜一次的POD活性的变化如图3所示，干旱胁 迫下，25mg/L壳寡糖处理与蒸馏水处理相比，在第3d其POD活性下降； 第6d，第9d其POD活性升高(P〈0.05)。 50mg/L壳寡糖处理在第3d 、第 6d POD活性显著下降，第9d其POD活性明显提高(P0.05)。 75mg/L壳寡 糖处理其POD活性无明显变化(P0.05)。
不同浓度壳寡糖处理油菜3次的POD活性的变化如图2d所示，干旱 胁迫下，25mg/L壳寡糖处理与对照2相比，在第3d、第6d和第9d其POD 活性明显升高(P0.05)。 50mg/L壳寡糖处理与对照2相比在第3d POD活性 显著升高；第6d和第9d其POD活性无明显变化(P0.05)。 75mg/L壳寡 糖处理与蒸馏水处理相比在第3dPOD活性显著升高；第6d、第9d其POD 活性无明显变化(P0.05)。Control 1:无任何胁迫，dH20处理；control 2， 25*1， 50*1， 75*1分别 为用dH20及浓度分别为25 mg/L、 50 mg/L和75mg/L的壳寡糖处理l次。 Control 3， 25*3， 50*3， 75*3分别为用4^0及浓度分别为25 mg/L、 50 mg/L 和75mg/L的壳寡糖处理l次/d，连续处理3d。表中数据为三株的平均值。(下 同)
三、 壳寡糖对干旱胁迫下油菜游离脯氨酸含量的影响
如图3a所示，干旱胁迫后油菜幼苗游离脯氨酸含量与非干旱胁迫显著 升高(PO,05)。
干旱胁迫下，25mg/L , 50mg/L ，and 75mg/L壳寡糖处理一次油菜幼苗脯氨酸 含量与对照3相似(P0.05)。
如图3所示，干旱胁迫下，25mg/L， 50mg/L， 75mg/L壳寡糖处理与对 照3相比游离脯氨酸不同程度变化，25mg/L， 50mg/L壳寡糖处理3次，在 处理后第3d，第6d和第9d其游离脯氨酸含量与蒸馏水处理相比显著升高 (P<0.05)。 75mg/L壳寡糖处理3次在第3d、第6d和第9d游离脯氨酸与蒸 馏水处理的相近(P〈0.05)。
四、 壳寡糖对对干旱胁迫下油菜气孔开度的影响
1不同浓度壳寡糖处理油菜1次的气孔开度的变化
如图4所示。干旱胁迫后油菜幼苗气孔开度与非干旱胁迫相比变化不
干旱胁迫下，25mg/L， 50mg/L和75mg/L壳寡糖处理1次与蒸馏水处 理相比气孔开度明显减小，其气孔开度在处理后lh最小，仅为蒸馏水处理 的41 % 59 %。壳寡糖处理在第3d气孔开度与蒸馏水处理的相近。在第 6d，第9d25mg/L， 50mg/L和75mg/L壳寡糖处理与蒸馏水处理相比气孔开 度减小，并随浓度提高气孔开度下降。
2不同浓度壳寡糖处理油菜3次的气孔开度的变化
图5所示，25mg/L， 50mg/L和75mg/L壳寡糖处理与蒸馏水处理相比 气孔开度明显减小，其气孔开度在壳寡糖处理在第3d气孔开度与蒸馏水处 理的相比明显减小。在第6d，气孔开度开始回升，第9d25mg/L壳寡糖处 理与蒸馏水处理相比气孔开度相同，50mg/L和75mg/L壳寡糖处理与蒸馏 水处理相比气孔开度达到最小，仅为蒸馏水处理处理的51%和24%。
五、 壳寡糖对干旱胁迫下油菜叶绿素含量的影响 干旱胁迫后油菜幼苗叶绿素含量与非干旱胁迫相比明显减少。 25mg/L壳寡糖处理与蒸馏水处理相比叶绿素含量变化不大。50mg/L
壳寡糖处理1次与蒸馏水处理相比，第3d叶绿素a,叶绿素b含量明显提 高，分别为蒸馏水处理的2.2和2.3倍，第6d，第9d叶绿素a,叶绿素b含 量变化不大。75mg/L壳寡糖处理与蒸馏水处理相比第3d,第6d叶绿素a,叶 绿素b含量略升高，第9d叶绿素含量变化不大。
25mg/L， 50mg/L和75mg/L壳寡糖处理3次与蒸馏水处理相比，叶绿素a,叶绿素b含量明显增加，以50mg/L壳寡糖处理效果最佳，处理后第 3d ，第6d叶绿素a,叶绿素b含量明显提高，处理后第3d叶绿素a,叶绿 素b含量为蒸馏水处理的2.6倍和2.7倍。第9d叶绿素a,叶绿素b含量均 为蒸馏水处理的相比变化不大。25mg/L和75mg/L壳寡糖处理3次与蒸馏 水处理相比第3d ，第6d和第9d叶绿素a，叶绿素b含量一直保持增高趋 势。
实施例2壳寡糖对低温胁迫下油菜抗性酶活性的影响
如图6， 50mg/L和75mg/L壳寡糖处理低温胁迫下油菜1次和3次在第
3d、 6d和第9dSOD活性显著提高(P〈0.05)。
壳寡糖对低温胁迫下油菜脯氨酸含量的影响如图7， 50mg/L和75mg/L
壳寡糖处理低温胁迫下油菜1次和3次在第6d脯氨酸含量显著提高
(P<0.05)。
实施例3壳寡糖对水淹胁迫下油菜抗性酶活性的影响 如图8， 50mg/L和75mg/L壳寡糖处理低温胁迫下油菜1次和3次在第 3d、第6d和第9dSOD活性显著提高(P0.05)。
实施例4壳寡糖与壳聚糖诱导作物抗旱性效果比较 如图9，叶面喷50mg/L壳寡糖或0.in/。壳聚糖，干旱胁迫下，壳寡糖诱 导作物SOD活性显著高于壳聚糖处理的(P0.05)。壳寡糖诱导作物抗旱性效 果明显好于壳聚糖。
壳寡糖的诱导效果相比，在抗涝、抗寒、抗冻效果均好于壳聚糖。 各实施例中叶面喷施和根灌的效果相似。
权利要求
1. 一种植物抗逆诱导剂，其特征在于其以壳寡糖溶液为有效活性成份。
2. 按照权利要求1所述植物抗逆诱导剂，其特征在于所述壳寡糖溶 液的浓度为l-100mg/L。
3. 按照权利要求1或2所述植物抗逆诱导剂，其特征在于所述壳寡 糖溶液采用的溶剂为水或质量浓度为0-0.1%的醋酸。
4. 按照权利要求1所述植物抗逆诱导剂，其特征在于所述壳寡糖的脱乙酰度>90%，聚合度2-10。
5. —种权利要求l所述植物抗逆诱导剂的应用，其特征在于所述壳寡糖溶液用于诱导植物提高其抗逆性，应用时，将壳寡糖溶液根灌或喷施于作物叶片上，亩喷施量30-50公斤或亩根灌150-300公斤。
全文摘要
本发明涉及植物抗逆性诱导剂，其以壳寡糖溶液为有效活性成份。本发明采用壳寡糖诱导作物抗旱、抗涝、抗寒和抗冻的方法，壳寡糖喷施作物叶片或根灌诱导作物抗逆性(抗旱、抗冻抗寒和抗涝)。通过诱导作物叶片不同程度提高抗性酶含量，明显提高脯氨酸含量，气孔开度明显下降，明显提高叶绿素含量等提高了作物的抗逆性。外施壳寡糖能提高作物抗逆性，而且无毒不引起环境污染，使用方法简单。
文档编号A01N63/00GK101543230SQ200810010789
公开日2009年9月30日 申请日期2008年3月28日 优先权日2008年3月28日
发明者艳 李, 杜昱光, 白雪芳, 赵小明 申请人:中国科学院大连化学物理研究所