一种提高植物抗逆境能力的方法

一种提高植物抗逆境能力的方法
【专利摘要】本发明涉及一种提高植物抗逆境能力的方法。揭示一种对于提高植物抗逆境能力有用的方法，通过将杨树CBL10多肽的编码基因转入植物中，进而提高植物的耐盐性、耐热性、耐干旱性，并促进植物生长、提高植物生物量。本发明的方法可应用于植物品种的改良。
【专利说明】一种提高植物抗逆境能力的方法

【技术领域】
[0001] 本发明属于基因技术和植物学领域，更特别地，本发明涉及钙调神经素 B亚基类 似蛋白家族基因在植物中提高抗逆境能力的应用。

【背景技术】
[0002] 土壤的盐渍化是一个世界性的资源问题和生态问题，它严重制约了现代农业的发 展。在我国所有的耕地中，盐碱地面积约有1亿亩，而中低产田高达10亿亩，另外还有3亿 亩盐碱荒地可供人们开发和利用。大部分农作物与林木的耐盐阈值低于0. 6%的盐浓度，而 我国大面积的盐碱地的含盐量在1.0%左右。随着现代社会的快速发展，人口不断膨胀，环 境污染和生态恶化日益加剧，灌溉地区的次生盐渍化土地面积也在逐年上升，造成农作物 产量锐减，引起了全世界的高度关注。长期以来人们一直在寻找解决的良策。随着植物耐 盐生理生化、分子生物学和基因组学研究的深入开展，科学家们逐渐确定了一部分植物在 耐盐抗旱过程中起重要作用的蛋白，克隆了编码它们的基因序列，并利用转基因的手段使 某些耐盐相关基因在植物体内过量表达，以使其获得一定的耐盐性。
[0003] 植物的耐盐性是一个多基因控制的复杂性状，其中涉及多种机制与信号通路共同 参与。涉及盐胁迫的信号转导过程比较复杂，往往还与干旱，冷冻以及氧化胁迫的信号途径 相互交叉，因此对于非生物胁迫信号转导途径的解析一直是植物逆境研究领域中的热点问 题。模式植物拟南芥中的SOS信号通路是植物响应盐胁迫信号转导方面的开创性工作。在 盐胁迫下，过量的Na +使细胞质内的Ca2+浓度增加，激活了钙结合蛋白S0S3, S0S3于是与 S0S2结合使其转为活性状态，暴露出催化部位而发挥激酶的功能，S0S2还被S0S3招募到质 膜附近，通过磷酸化作用激活了下游Na+/H +逆向转运蛋白S0S1，从而提高了质膜Na+/H+逆 向转运的能力，防止了 Na+在植物细胞内的过量积累。最近的研究表明，在单子叶禾本科的 水稻中也存在非常类似的SOS信号转导途径参与了水稻响应盐胁迫反应过程。
[0004] 木本植物株型高大（涉及离子和营养物质长距离运输），且一般是多年生（涉及次 生生长）。目前，人们对木本植物的耐盐机理还知之甚少。另一方面，通过转基因技术提高 林木耐盐抗旱等抗逆性一直也是植物基因工程研究的难点之一，目前国内外成功的实例并 不多。


【发明内容】

[0005] 本发明的目的在于提供一种提高植物耐盐性的方法。
[0006] 在本发明的第一方面，提供一种提高植物抗逆境能力或制备抗逆境能力增强的转 基因植物的方法，包括：将杨树CBLlO多肽的编码基因转入到植物中。
[0007] 在一个优选例中，所述的杨树CBLlO多肽选自：杨树CBLlOA或杨树PtCBLIOB。
[0008] 在另一优选例中，所述的杨树CBLlOA包括：（a)如SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列 的多肽；(b)将SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经过一个或多个（如1-20个；较佳地1-10 个；更佳地1-5个；更佳地1-3个）氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有（a) 所述多肽的功能的由（a)衍生的多肽；（c)与SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列同源性高于 70%(较佳地高于80%;更佳地高于90%;如95%，98%，99%)且具有（a)所述多肽的功能的由 (a)衍生的多肽；或
[0009] 所述的杨树CBLlOB包括：（a'）如SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列的多肽；(b'） 将SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列经过一个或多个（如1-20个；较佳地1-10个；更佳地 1-5个；更佳地1-3个）氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有（a'）所述多肽的 功能的由（a'）衍生的多肽；（c'）与SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列同源性高于70%(较 佳地高于80% ;更佳地高于90% ;如95%，98%，99%)且具有（a，）所述多肽的功能的由（a，） 衍生的多肽。
[0010] 在另一优选例中，所述的植物包括：木本植物或草本植物。
[0011] 在另一优选例中，所述的木本植物包括：杨柳科植物（如杨属植物），桑科植物，桃 金娘科植物（如桉属植物），松科植物，柏科植物，胡桃科植物，桦科植物，悬铃木科，锦葵科 植物，锻树科植物，梧桐科植物，蔷薇科植物，蝶形花科植物，黄杨科植物，漆树科植物；或
[0012] 所述的草本植物包括：禾本科植物（如水稻、玉米、小麦），十字花科植物（如拟南 芥），茄科植物（如番茄）和豆科植物（如大豆）。
[0013] 在另一优选例中，所述的方法包括：
[0014] (1)将外源的杨树CBLlO多肽的编码基因转入木本植物组织、器官或种子，获得转 化入所述基因的植物组织、器官或种子；和
[0015] (2)将步骤（1)获得的转入了所述基因的植物组织、器官或种子再生成植物。
[0016] 在另一优选例中，所述的方法包括：
[0017] (si)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有外源的杨树CBLlO多肽的 编码基因；
[0018] (s2)将植物组织、器官或种子与步骤（si)中的农杆菌接触，从而使外源的杨树 CBLlO多肽的编码基因转入植物。
[0019] 在另一优选例中，所述的方法还包括：（S3)选择出转入了外源的杨树CBLlO多肽 的编码基因的植物组织、器官或种子；以及（s4)将步骤（s3)中的植物组织、器官或种子再 生成植物。
[0020] 在另一优选例中，所述的逆境包括：高盐环境、热环境、干旱环境、氧化环境、渗透 环境。
[0021] 在另一优选例中，所述的提高植物抗逆境能力包括：
[0022] 提高植物存活率；
[0023] 增加植物株高；
[0024] 增加植物生物量；
[0025] 促进植物生长。
[0026] 在本发明的另一方面，提供杨树CBLlO多肽或其编码基因的用途，用于提高植物 抗逆境能力。
[0027] 在一个优选例中，所述的杨树CBLlO多肽选自：杨树CBLlOA或杨树PtCBLIOB。
[0028] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。

【专利附图】

【附图说明】
[0029] 图1、杨树中两个PtCBLlO核苷酸和氨基酸序列。
[0030] 图2、杨树中两个PtCBLlO蛋白与PtSOS的序列比对。
[0031] 图3、杨树PtCBLlOA与PtCBLlOB的基因表达模式分析。⑷毛果杨中PtCBLlOA 与PtCBLlOB的基因表达；（B)银中杨中PtCBLlOA与PtCBLlOB的基因表达；（C)PtCBLlOA 与PtCBLlOB基因在根部与地上部分的相对表达量，设定根中表达量的为l，Pt代表毛果杨， Pab代表银中杨；(D)PtCBLlOA与PtCBLlOB受盐诱导表达情况。
[0032] 图4、杨树PtCBLlOA与PtCBLlOB可以互补拟南芥突变体cbl 10地上部分盐敏感表 型。拟南芥野生型植株、CbllO突变体与不同的互补植株在MSO(A)与含有60mM NaCl (B)、 120mM NaCl(C)三种培养基上的生长情况；(D)根长的统计结果；(E)鲜重的统计结果；D、E 两图为三次独立试验统计结果，误差线代表SE ; (F)转基因植株的RT-PCR分子鉴定
[0033] 图5、PtCBLlOA与PtCBLlOB的亚细胞定位。（A)杨树原生质体瞬时转化的结果； (B)农杆菌注射烟草叶片瞬时表达的结果
[0034] 图6、植物表达载体图。
[0035] 图7、转基因杨树的PCR检测和⑶S染色检测。（A) RT-PCR分析；(B)⑶S染色。LA 是PtCBLlOA转基因植株的简称；LB是PtCBLlOB转基因植株的简称。
[0036] 图8、转基因杨树的耐盐表型。WT为未转基因对照株系，其余为转基因株系。分别 用OmM NaCl (A)和IOOmM NaCl⑶处理六周大的杨树，三周后拍照；（C)转PtCBLlOA基因 的转基因株系的相对表达量分析；(D)转PtCBLlOB基因的转基因株系的相对表达量分析； (E)株高的统计结果；(F)地上部鲜重的统计结果；E、F两图为三次独立试验统计结果，误差 线代表SE，*表示在相同的处理条件下与对照株系相比t-test差异显著（P〈0. 05)。
[0037] 图9、将PtCBLlOA在番爺（moneymaker)中组成型表达，显著提高番爺的抗盐性。 其中a，c，e为处理组，b，d为对照组。（a，b)处理前2苗龄大的番茄；（c) 200mM NaCl处理 1周；（d)为B的对照；（e) c中用淡水冲洗后恢复1周。WT为野生型，L19, LI, L2为三个不 同的转基因株系。
[0038] 图10、将PtCBLlOA在番爺（moneymaker)中组成型表达，显著提高番爺的抗旱性。 其中b，c为处理组，a，d为对照组。（a)处理前2周苗龄大的番茄；(b)控水9天后的表型； (c)为B中处理复水2天的表型；（d)为相当于C的苗龄的未控水处理的正对照（2周苗+9 天+2天）。WT为野生型，L19, LI, L2为三个不同的转基因株系。
[0039] 图11、将PtCBLlOA在番爺（moneymaker)中组成型表达，显著提高番爺的抗热性。 其中b，c为处理组，a，d为对照组。（a)处理前2周苗龄大的番茄；(b)42°C高温处理6小 时后在26°C恢复1天后的表型；（c)恢复2天后的表型；（d)为相当于C的苗龄的未控水处 理的正对照（2周苗+2天）。WT为野生型，L19, LI, L2为三个不同的转基因株系。

【具体实施方式】
[0040] 本发明人经过广泛的研究，揭示一种对于提高植物抗逆境能力有用的方法，通过 将杨树CBLlO多肽的编码基因转入植物中，进而提高植物的耐盐性、耐热性、耐干旱性。本 发明的方法可极好地应用于植物品种的改良，为运用转基因等分子育种技术培育植物新品 种提供了非常有价值的基因资源。
[0041] 本发明中，所述的植物（或作物）是适合进行基因转化操作的植物，如各种农作 物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是（不限于）：双子叶植物、单子叶植物、 或裸子植物。较佳地，所述的植物是木本植物或草本植物。
[0042] 本发明中，所述的"木本植物"指根和茎因增粗生长形成大量的木质部、而细胞 壁也多数木质化的坚固的植物；且所述的木本植物天然基因组中含有CBLlO多肽的编码 基因。例如，所述的"木本植物"可以是：杨柳科（Salicaceae)、桑科（Moraceae)、桃金娘 科（Myrtaceae)、石松科（Lycopodiaceae)、（Selaginellaceae)、银杏科（Ginkgoaceae)、 松科（Pinaceae)、苏铁科（Cycadaceae)、天南星科（Araceae)、毛莫科（Ranunculaceae)、 悬铃木科（Platanaceae)、愉科（Ulmaceae)、胡桃科（Juglandaceae)、禅科（Betulaceae)、 称猴桃科（Actinidiaceae)、锦奏科（Malvaceae)、梧桐科（Sterculiaceae)、锻树科 (Tiliaceae)、径柳科（Tamaricaceae)、舊薇科（Rosaceae)、景天科（Crassulaceae)、 苏木科（Caesalpinaceae)、蝶形花科（Fabaceae)、石植科（Punicaceae)、拱桐科 (Nyssaceae)、山莱英科（Cornaceae)、八角讽科（Alangiaceae)、卫矛科（Celastraceae)、 冬青科（Aquifoliaceae)、黄杨科（Buxaceae)、大戟科（Euphorbiaceae)、小盘木科 (Pandaceae)、鼠李科（Rhamnaceae)、葡萄科（Vitaceae)、漆树科（Anacardiaceae)， 撤揽科（Burseraceae)、梧梗科（Campanulaceae)、红树科（Rhizophoraceae)、檀香科 (Santalaceae)、木渾科（Oleaceae)或玄参科（Scrophulariaceae)的植物。
[0043] 作为本发明的优选方式，所述的木本植物是指杨柳科（如杨属，更特别如杨树）或 桑科（如构树属，更特别如光叶楮）、桃金娘科（如桉属，更特别如桉树）的木本植物。
[0044] 本发明中，所述的"草本植物"是一类植物的总称，其植物体木质部较不发达 至不发达，茎多汁，较柔软。例如，所述的"草本植物"可以是：禾本科（Gramineae)， 露兜树科（Pandanaceae)，黑三棱科（Sparganiaceae)，水雍科（Aponogetonaceae)， 眼子菜科（Potamogetonaceae)，茨藻科（Najadaceae，冰沼草科（Scheuchzeriaceae)， 泽泻科（Alismataceae)花蔚科（Butomaceae)，水瞥科（Hydrocharitaceae)，霉草 科（Triuridaceae)，莎草科（Cyperaceae)，掠桐科（模柳科）（Palmae (Arecaceae))， 天南星科（Araceae)，浮萍科（Lemnaceae)，须叶藤科（Flagellariaceae)，帚灯草 科（Restionaceae)，刺鱗草科（Centrolepidaceae)，黄眼草科（Xyridaceae)，谷精 草科（Eriocaulaceae)，凤梨科（Bromeliaceae)，鸭妬草科（Co_elinaceae)，雨久 花科（Pontederiaceae)，田葱科（Philydraceae)，灯心草科（Juncaceae)，百部科 (Stemonaceae)，百合科（Liliaceae)，石蒜科（Amaryllidaceae)，茜 If 薯科（箭根薯 科）（Taccaceae)，暮葡科（Dioscoreaceae)，鸾尾科（Iridaceae)，色蓮科（Musaceae)， 姜科（Zingiberaceae)，美人蓮科（annaceae)，竹芋科（Marantaceae)，水玉替科 (Burmanniaceae)或兰科的植物。
[0045] 作为本发明的优选方式，所述的草本植物是：茄科植物，例如茄科茄属的番茄。
[0046] 本发明中，"转基因"，系指通过任何方法导入植物个体一段外源的双链脱氧核糖 核苷酸（DNA)片段，可以是游离在染色体外，也可以整合到受体植物染色体的基因组上；可 以通过生殖过程传递到后代，也可以不传递到后代。外源基因可以从生物基因组中克隆，也 可以人工合成或用PCR在体外扩增。
[0047] 本发明还包括杨树CBLlO多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语"片 段"、"衍生物"和"类似物"是指基本上保持本发明的杨树CBLlO多肽相同的生物学功能或 活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是（i)有一个或多个保守或非保守 性氨基酸残基（优选保守性氨基酸残基）被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以 是也可以不是由遗传密码编码的，或（ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多 肽，或（iii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽（如前导序列或分泌序列 或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白）。根据本文的定义这些片段、衍生物 和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
[0048] 在本发明中，术语"杨树CBLlO多肽"指具有提高植物抗逆境能力的SEQ ID NO:2 序列（杨树CBL10A)或SEQ ID N0:4序列（杨树CBL10B)的多肽。该术语还包括具有提高 植物抗逆境能力的、SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4序列的变异形式。这些变异形式包括（但 并不限于）：若干个（通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更 佳如1-8个或1-5个）氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或 缺失一个或数个（通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内）氨基酸。例 如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又 比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术 语还包括杨树CBLlO多肽的活性片段和活性衍生物。
[0049] 多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突 变体、在高或低的严紧度条件下能与杨树CBLlO多肽DNA杂交的DNA所编码的蛋白。本发 明还提供了其他多肽，如包含杨树CBLlO多肽或其片段的融合蛋白。
[0050] "杨树CBLlO多肽保守性变异多肽"指与SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:4的氨基酸序 列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相 似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换 而产生。
[0051] 表 1
[0052]

【权利要求】
1. 一种提高植物抗逆境能力或制备抗逆境能力增强的转基因植物的方法，其特征在 于，包括：将杨树CBL10多肽的编码基因转入到植物中。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的杨树CBL10多肽选自：杨树CBL10A或 杨树 PtCBLIOB。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的杨树CBL10A包括：（a)如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨 基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有（a)所述多肽的功能的由（a)衍生的多肽； (c)与SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列同源性高于70%且具有（a)所述多肽的功能的由（a) 衍生的多肽；或 所述的杨树CBL10B包括：(a'）如SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列的多肽；(b'）将SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具 有（a'）所述多肽的功能的由（a'）衍生的多肽；（c'）与SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列 同源性高于70%且具有（a'）所述多肽的功能的由（a'）衍生的多肽。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物包括：木本植物或草本植物。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的木本植物包括：杨柳科植物，桑科植 物，桃金娘科植物，松科植物，柏科植物，胡桃科植物，桦科植物，悬铃木科，锦葵科植物，椴 树科植物，梧桐科植物，蔷薇科植物，蝶形花科植物，黄杨科植物，漆树科植物；或 所述的草本植物包括：禾本科植物，十字花科植物，茄科植物和豆科植物。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括： (1) 将外源的杨树CBL10多肽的编码基因转入木本植物组织、器官或种子，获得转化入 所述基因的植物组织、器官或种子；和 (2) 将步骤（1)获得的转入了所述基因的植物组织、器官或种子再生成植物。
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，包括： (si)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有外源的杨树CBL10多肽的编码 基因； (s2)将植物组织、器官或种子与步骤（si)中的农杆菌接触，从而使外源的杨树CBL10 多肽的编码基因转入植物。
8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的逆境包括：高盐环境、热环境、干旱环 境、氧化环境、渗透环境。
9. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的提高植物抗逆境能力包括： 提高植物存活率； 增加植物株高； 增加植物生物量； 促进植物生长。
10. 杨树CBL10多肽或其编码基因的用途，其特征在于，用于提高植物抗逆境能力。
11. 如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述的杨树CBL10多肽选自：杨树CBL10A 或杨树PtCBLIOB。
【文档编号】C12N15/29GK104278040SQ201310293835
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2013年7月12日 优先权日:2013年7月12日
【发明者】张洪霞, 唐仁杰, 杨阳 申请人:中国科学院上海生命科学研究院