用于人乳头瘤病毒16基因检测的生物试剂的制作方法
【专利摘要】本发明提供了用于人乳头瘤病毒16（HPV16）基因检测的生物试剂盒、其制备方法以及在基因检测方面的应用。本发明的技术方案涉及引物和探针的设计、合成和纯化以及细胞提取液的配置和标准品的制备。所述试剂盒的组分包括：DNA提取液，HPV16PCR反应液，HPV16强阳性质控品和阴性质控品。采用本发明的试剂盒可通过PCR基因扩增的方法进行HPV16基因检测，实现对HPV16的筛查和临床诊断。本发明的试剂盒用于基因检测的步骤简便、检测效率高、结果可靠。
【专利说明】用于人乳头瘤病毒16基因检测的生物试剂
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学领域的基因检测技术，尤其涉及用于人乳头瘤病毒16(HPV16)基因检测的生物试剂、其制备方法以及基因的检测方法。
【背景技术】
[0002] 人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)是一种最小的DNA (脱氧核糖核酸)病毒。HPV呈球形，直径约为45~55nm，具有嗜上皮性，在人和动物中分布广泛。HPV在自然界中广泛存在，人类感染HPV十分普遍，感染率也很高。综合国外一些报道，在自然人群中HPV感染率从低于I %到高达50 %，在性活跃人群中20 %~80 %以上的人有HPV感染史。
[0003]HPV病毒在临床上可分为许多的亚型，而不同亚型的病毒可能导致不同的疾病。另外，根据致病力的程度或危险性大小，可将不同的亚型分为低危和高危两大类，其中HPV高危亚型的感染会引起生殖器癌和子宫颈癌上皮细胞病变。人乳头瘤病毒16 (HPV16)属于高危亚型，是宫颈癌的重要致病因素。
[0004]目前宫颈癌的筛查主要是基于细胞学的检测方法，有宫颈巴氏(Pap)涂片、阴道镜活检、液基薄层细胞学或薄片制备细胞学检查(TCT)等多种。
[0005]宫颈巴氏涂片是群体筛查的常规手段，但受取材、涂片制作质量、阅片技术影响，准确性低，假阳性率高，重复性差，敏感性也有限，漏诊率可达30%。TCT法会引起不适、操作不便、费用高，不易为广大患者接受。宫颈组织活检有创伤，不利于人群普查。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种具有特异性强、灵敏度高的检测试剂盒，用于快速检测人乳头瘤病毒16(HPV16)类型。HPV16检测简单易行，标本可由医生采集或患者自取，是对细胞学检测方法的重要补充。
[0007]为实现上述目的，本发明提供了一种用于人乳头瘤病毒16型(HPV16)基因检测的生物试剂、制备方法以及基因检测方法。
[0008]一方面，本发明提供了一种用于HPV16基因检测的试剂盒。所述试剂盒的组分包括:引物、探针、Taq聚合酶、IOXbuffer缓冲液、dNTP、试验标准品、阴性质控品和超纯水。
[0009]其中，合成的引物是由包括CPG、四氮唑、乙酸酐和1-甲基咪唑、碘、dNTP的原料合成。根据HPV的不同分型设计不同引物和探针。
[0010]另一方面，本发明还提供了用于HPV16基因检测的试剂盒的制备方法，其包括下述步骤:
[0011]I)确定待测基因片段:根据科技文献的方向性报道初步选定候选基因片断，然后经研发过程中与待检样本病理相关性的比较，最终确认与临床疾病最具相关性的待测基因片断；
[0012]2)根据所述待测基因片段设计并生产引物和探针，采用多核苷酸合成仪生产所述引物；[0013]3)提取细胞基因组DNA:用DNA提取液提取病人基因组及对照组基因组DNA ；[0014]4)确定PCR扩增条件，其包括酶、探针、引物、基因组DNA用量及PCR的扩增条件:不同组合的引物片断，根据实验结果的特异性，敏感性等技术特征，反复试验，同时进行多条所述待测基因片断的检测反应，最终确定包括所述引物、探针最佳浓度及酶的最佳反应条件，其中，PCR基因扩增的结果由荧光PCR仪来检测；
[0015]5)进行重复性检测以进一步确定反应条件:通过大量实验，反复比较实验结果中包括清晰度和灵敏性的因素，最终确定反应条件；
[0016]6)根据最终确定的所述反应条件，制备试剂盒，其组分包括:引物、探针、dNTP、IOXbuffer缓冲液、Taq聚合酶、试验标准品、阴性质控品和超纯水。
[0017]又一方面，本发明还提供了采用本发明试剂盒进行HPV16基因检测的方法。
[0018]采用本发明的试剂盒进行HPV16基因检测，其中所述试剂盒的组分包括:细胞提取液、引物、探针、dNTPUOXbuffer缓冲液、Taq聚合酶、试验标准品、阴性质控品和超纯水。
[0019]本发明以用基因组提取试剂盒提取的患者的细胞基因组DNA为模板，用试剂盒提供的引物、探针、dNTP、酶、试剂标准品等组分，20 μ L反应体系，按照特定的比例分别加入，采用PCR基因扩增技术，实现对HPV的基因检测。
[0020]具体实验步骤如下:
[0021]I)试剂准备:取PCR反应液备用。
[0022]2)加样:向准备好试剂的0.2ml离心管中，分别加入处理后的样品(包括和强阳性质控品)上清液I μ 1,8，OOOrpm离心数秒，放入仪器样品槽。
[0023]3)程序编辑:按对应顺序设置阴性质控品、以及未知标本(含阳性质控品)，并在样本参数中设置样品名称。设置程序后运行。
[0024]本发明的技术关键涉及引物和探针的设计、合成和纯化以及细胞提取液的配置和标准品的制备。
[0025]本发明的优点是采用PCR基因扩增的方法检测基因分型，方法设计和流程比较简单；医院的投入比较少，一般医院的设备就可以检测；使用方便，无需特殊仪器和酶切步骤；检测耗时较短；检测效率高，结果可靠、有效，可用于HPV的筛查和临床诊断，具有相当大的市场潜力。
[0026]基因扩增是所有DNA分析技术中最灵活和灵敏的手段，本发明以PCR为基础的检测方法是进行HPV DNA检测及分型的最好方法。本发明的试剂盒及其方法可以应用于检测、病毒负荷定量、DNA测序和突变分析，也可以进行多重扩增，同时分析多个DNA序列。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]有关本发明的上述简要介绍以及下述的详细描述，结合附图会得到更好的理解。
[0028]图1描述用试剂盒提取b，c，d三个临床样本的基因组。图中:a表示HPV16阳性对照组，b，c，d分别为三个感染HPV患者的临床样本基因组，e表示阴性对照组。采用HPV16引物16F1，16R1和探针16P1进行PCR，FAM荧光信号检测；结果如图1所示，a显示为标准S型曲线、b，c，d样本的曲线也为S曲线，e显示为直线。因此确定b，c, d患者感染HPV为16亚型。【具体实施方式】
[0029]在对本发明作进一步描述之前，应当理解本发明并不局限于下述有关发明的【具体实施方式】。同时也应当理解，本文所使用的术语只是用于针对特定的实施方式进行描述，而不是用来进行限制。
[0030]所用DNA合成仪为德国polygen，引物的制备方法是采用固相亚磷酰胺三酯法，亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3’端向5’端合成的，相邻的核苷酸通过3’ 一5’磷酸二酯键连接。 [0031]检测中所需要的仪器设备主要有:DNA合成仪，荧光PCR仪等。
[0032]本试剂盒检测分析的原理是:按照HPV16病毒镶嵌在人体基因组中，而正常人中没有，因此，当以两种人的基因组为模板进行聚合酶链式反应的扩增时，病人出现病毒的目的条带即S曲线，而正常人不出现条带即无S曲线。用此种方法来检测宫颈癌病人。
[0033]实施例1.引物的制备
[0034]本例中引物的制备包括以下步骤:
[0035]用德国polygenDNA合成仪合成引物和探针，
[0036]I)打开仪器和软件。
[0037]2)校准试剂选择滑块和校准10个柱子的滑块。
[0038]3)开启自动冲洗功能将液体充满各个管子。
[0039]4)用CPG填充柱子滑块中的孔。
[0040]在合成以前，应将柱子滑块里填充正确的CPG，柱子中填充好的CPG含有对应的3’端的核苷酸，因为仪器合成寡核苷酸的顺序是从3’端到5’端完成的。
[0041]注意:加CPG过程中不能突然触击滤膜，否则可能会有泄漏出现。
[0042]5)将滑块装到仪器上。
[0043]6)合成开始前，输入所需要的序列作为主程序，按开始键开始运行。
[0044]7)运行完后，将滑块从设备中卸下来，用戳子的细头端将柱子里的材料和滤膜去除掉。操作人员将柱子滑块附到模型台架上，并安装稳固。用小收集管将CPG收集好，进行下一步处理。
[0045]8)将寡核苷酸与CPG分离，通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，用PAGE方法纯化引物，用水稀释完后通过微量紫外分光光度计测定其含量。
[0046]NCBI上找到HPV16序列,用primer express软件根据序列设计出引物和探针,再通过NCBI上BLAST比对，发现该引物探针序列是HPV16的特异性序列，因此将其作为检测HPV16的引物和探针。
[0047]设计合成引物(16F1和16R1)和探针(16P1)序列见下表:
[0048]
名称序列
T6F1 ~TCCTGTCCCAGTATCTAAGGTTGTAA
【权利要求】
1.一种用于人乳头瘤病毒16(HPV16)基因检测的试剂盒，其包括DNA提取液，HPV16PCR反应液，HPV16强阳性质控品和阴性质控品，其中: 所述HPV16PCR反应液包括超纯水，缓冲液，dNTP，引物16F1和16R1，以及探针16P1 ； 所述引物16F1的序列为TCCTGTCCCAGTATCTAAGGTTGTAA，所述引物16R1的序列为TGTCCAACTGCAAGTAGTCTGGAT,所述探针 16P1 的序列为 FAM-CACGGATGAATATGTTGCAC-MGBNFQ。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括:DNA提取液2管；HPV16PCR反应液20管；HPV16强阳性质控品I管；阴性质控品I管。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括:DNA提取液2管，500μ I/管；HPV16PCR反应液20管，19 μ I/管；HPV16强阳性质控品I管，200 μ I/管；阴性质控品I管，150μ I/管；其中，所述HPV16PCR反应液包括超纯水14.3 μ 1，IOXbuffer缓冲液2 μ 1，dΝΤΡ0.4 μ 1，引物 16F10.4μ 1,16R10.4μ 1，探针 16Ρ10.4μ I。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述引物是由包括CPG、四氮唑、乙酸酐和1-甲基咪唑、碘、dNTP的原料合成，并且根据HPV的不同分型而设计。
5.用于制备权利要求1所述的试剂盒的方法，其包括下述步骤: 1)确定待测基因片段:根据科技文献的方向性报道初步选定候选基因片断，然后经研发过程中与待检样本病理相关性的比较，最终确认与临床疾病最具相关性的待测基因片断； 2)根据所述待测基因片段 设计并生产引物和探针，采用多核苷酸合成仪生产所述引物； 3)提取细胞基因组DNA:用DNA提取液提取病人基因组及对照组基因组DNA ； 4)确定PCR扩增条件，其包括酶、探针、引物、基因组DNA用量及PCR的扩增条件:不同组合的引物片断，根据实验结果的特异性，敏感性等技术特征，反复试验，同时进行多条所述待测基因片断的检测反应，最终确定包括所述引物、探针最佳浓度及酶的最佳反应条件，其中，PCR基因扩增的结果由荧光PCR仪来检测； 5)进行重复性检测以进一步确定反应条件:通过大量实验，反复比较实验结果中包括清晰度和灵敏性的因素，最终确定反应条件； 6)根据最终确定的所述反应条件，制备试剂盒，其组分包括:引物、探针、dNTP、IOXbuffer缓冲液、Taq聚合酶、试验标准品、阴性质控品和超纯水。
6.采用权利要求1所述的试剂盒进行HPV基因检测的方法，其包括: 以用基因组提取试剂盒提取的患者的细胞基因组DNA为模板，用试剂盒提供的引物、探针、dNTP、酶、试剂标准品等组分，20 μ L反应体系，按照特定的比例分别加入； 采用PCR基因扩增技术，进行PCR反应，实现对HPV的基因检测； PCR结束后，采用琼脂糖专用电泳仪进行电泳、EB染色、成像并进行基因分型，从而实现对HPV的基因检测。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其中所述PCR反应进一步包括: 在0.2mL的PCR管里面，加入患者模板(50ng/μ I )，瞬时离心混匀后放入PCR仪中，在设定的PCR反应体系和扩增程序条件下获得针对正常对照组和感染HPV16基因扩增的对照结果。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其中所述PCR反应体系和反应条件包括: PCR反应体系(20 μ I )，包括:HPV16PCR反应液18μ 1，模板2μ I ;其中PCR反应液的配置:超纯水 14.3 μ 1,10Xbuffer2y 1，d NTP0.4 μ 1，引物 16F10.4μ 1,16R10.4μ 1，探针16Ρ10.4μ I ； 扩增程序，包括:6 0° C30s —95° C2min —95° C15s — 60° Clmin (共 40 个循环)。
【文档编号】C12Q1/68GK103540682SQ201310294133
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年7月12日 优先权日:2012年7月13日
【发明者】钟建, 方平科 申请人:钟建