专利名称：含太子参环肽b组培苗的培养方法
技术领域：
本发明涉及植物生物技术领域，尤其涉及一种含太子参环肽B组 培苗的培养方法。
组织培养是指在人工控制的条件下，把植物体的一个器官、 一种 组织、单个细胞或离体胚等置于盛有一定培养基的容器中进行生长分 化的一种培养方法。组织培养技术克服了整体植物研究中的困难，一 方面是由于所用的培养材料是离体的，取自植物体的一部分，减少了 整体植物中复杂的相互关系；另一方面，在人工控制条件下，人们可
以有意识地去选择和设置一些能引起某种生理变化的因素进行处理， 以便探索离体培养下组织和细胞发展变化的规律。植物组织培养是一 种很有潜力的新兴生物技术。
太子参[尸5"e〃JosteJ7ar/a力etej"。py^77a (Miq. ) Pax ex Pax et Hoffm.]系石竹科(Caryophyllaceae)假繁缕属(Pseudostellaria) 植物。又名异叶假繁缕，孩儿参等。被《中华人民共和国药典》2005 年版收载。太子参以块根入药，是一种珍贵的中药材。性平；味甘， 微苦。归脾、肺经。益气健脾，生津润肺。用于脾虚体倦，食欲不振， 病后虚弱，气阴不足，自汗口渴，肺燥干咳。
太子参的化学成分主要包括环肽类如太子参环肽A-H等；苷类如
太子参皂苷、尖叶丝石竹皂苷等；糖类如蔗糖、麦芽糖、a-槐糖等; 氨基酸类如赖氨酸、苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、蛋氨酸等；油脂类如 甘油单硬脂酸酯、磷脂酰基醇等；挥发油等。其中，环肽成分是中药 太子参的特征和主要成分，而太子参环肽B(Heter邻hyllin B，HB)尤 是其商品药材中的共有成分，可作为太子参药材质量控制的化学成 分。目前己开发的以太子参为原料的保健产品有复方太子参口服液、 太子参胶囊、太子参止咳平喘精(散)、太子宝、真空膨化太子参等系 列产品。原料药材市场需求量逐年加大，药材价格也随之攀升，致使 野生资源采挖过度，日趋减少，进一步发展道地太子参药材生产迫在 眉睫。但是太子参生长过程中很容易被多种病虫害侵袭，最终影响太 子参栽培药材的产量和品质，使太子参的栽培规模难以扩大。采用组 织培养方法，对植物体进行脱毒并提高太子参有效成分太子参环肽B 的含量是解决目前资源匮乏的有效途径之一。
现有技术目前尚无专门针对太子参环肽B含量提高的组织培养技 术的文献报道和应用，而报道过的方法仅是针对繁殖系数和生物量提 高的一些培养方法。这些方法存在着不定根诱导步骤复杂，需经过外 植体到愈伤组织再到不定根的复杂步骤；愈伤组织诱导率低，扩繁速 度慢，诱导不定根的材料受限；植物通过愈伤组织后形成的培养系不 稳定；激素使用复杂，不定根诱导时间过长，以及太子参有效成分含
发明内容
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本发明的目的在于针对现有技术存在的不足，基于太子参环肽B 在植物体内分布的特点及其在药理方面的活性，提供一种含有效成分 太子参环肽B组培苗的培养方法，此方法简便易行，太子参组培苗及 不定根生物量提高快，太子参环肽B含量高，是获取大量含高含量太 子参环肽B的太子参材料的有效方法。
为了实现本发明的目的，本发明提供了如下的技术方案 含太子参环肽B组培苗的培养方法，包括以下步骤
(1) 太子参丛生芽的诱导、培养取太子参幼枝，经洗涤消毒 后，无菌显微条件下剥离茎尖的叶片，取带有生长点的茎尖置于丛生 芽培养基中培养；
(2) 太子参组培苗培养系的建立及太子参环肽B含量测定将步
骤(1)所得丛生芽近顶端部分切成O. 8-1. Ocm带节间的外植体置于生 根培养基内，20—25'C条件下光照培养诱导生根，生根后继续培养， 并对太子参环肽B的含量进行测定。
上述的培养方法，还可以进一步包括以下第(3)步骤
(3) 太子参不定根的液体培养与太子参环肽B含量测定将太 子参组培苗中诱导初出的不定根用解剖刀切下，用无菌蒸馏水洗去不 定不定根表面的培养基，在无菌条件下称取0. 5g置于液体培养基中， 在100-130r/min的旋转震荡器中悬浮扩大培养；并进行太子参环肽 B含量分析。
本发明具体的方法如下
步骤(1)中所采用的消毒方法为太子参幼枝用自来水清洗3-5 遍，置于肥皂液中浸泡1小时后再用流水冲洗1-2小时，取出用无菌滤纸吸干表面水分，用75%的乙醇浸泡消毒20-40秒，然后用无菌 水冲洗3次，吸干表面水分后置于10%的过氧化氢溶液中浸泡13分 钟，取出后用无菌蒸馏水冲洗6次，吸干表面水分并在无菌显微条件 下进行茎尖剥离后置于丛生芽诱导培养基MS + 6-卞基氨基嘌呤 (6-BA) 1.5mg/L中培养，灭菌前培养基PH值精密调至6. 5。
步骤(2)是将步骤(1)中所得的丛生芽置于MS固体培养基中 分别加入奈乙酸(NAA) 0. 1-2. Omg/L、吲哚乙酸(IAA) 0. 1-3. Omg/L、 吲哚丁酸(IBA) 0. 1-4.0mg/L、 6-糠基氨基嘌呤(KT) 0. 1-2. Omg/L、 6-卞基氨基嘌呤(6-BA) 0. 1-1. 0 mg/L、脱落酸(ABA) 0. 1-1. Omg/L、 2， 4-二氯苯氧乙酸(2,4-D) 0.5-1.5mg/L中的一种或几种植物激素
所配制的培养基中进行不定根的诱导；灭菌前培养基PH值精密调至 6.5;太子参组培苗中太子参环肽B的含量用高效液相色谱(HPLC) 测定，条件如下安捷伦生产的Agilent 1100 series;色谱柱为Agilent ZORBAXSB-C18， 5 u m， 4.6X 150mm;柱温30°C;流动相为水 乙腈=73: 27;流动相流速lml/min;检测波长192nm; HB的保 留时间(RT)为14.003min;总环肽溶液进样后收取14min的吸收峰 进行FAB-质谱分析，得到分子量为777的[M-i;r峰，证明为 HB[M=778]。
将步骤(1)中所得的丛生芽置于MS固体培养基中分别加入奈乙 酸(NAA)O. l-2.0mg/L、卩引哚乙酸(IAA)O. 1-3. Omg/L、卩引哚丁酸(IBA) 0. l-4.0mg/L、 6-糠基氨基嘌呤(KT) 0. 1-2. Omg/L、 6-卞基氨基嘌呤 (6-BA) 0. l-1.0mg/L、脱落酸(ABA) 0. 1-1. Omg/L、 2， 4-二氯苯氧 乙酸(2,4-D) 0.5-1.5mg/L中的一种和几种植物激素所配制的培养 基NAA或NAA + IBA或NAA+IBA+2. 4-D或NAA+IBA+ABA或NAA+ IBA+6-BA或NAA+IAA+6-BA或NAA+IBA+IAA+KT或NAA+IBA+ IAA+KT+6-BA中进行不定根的诱导。
步骤(3)是将步骤(2)中丛生芽直接诱导出的HB含量较高即 不低于850. 31 ii g/g组培苗干重的不定根从组培苗中切下，洗去培养 基后精密称量0. 5g接种到含有奈乙酸(NAA) 0. 1-2. Omg/L、吲哚丁 酸(IBA)O.卜4. 0mg/L、6-卞基氨基嘌呤(6-BA)0. 1-1. Omg/L的1/2MS 液体培养基中，悬浮扩大培养，其含量测定方法同权利要求3中步骤 (2)。
其中上述所有步骤太子参环肽B含量分析采用Excel软件进行分 析评价。
与现有技术相比较，本发明的优异性在于:本发明不定根诱导步 骤简化，只需经过外植体至不定根的步骤；不定根的诱导率高、诱导 时间短，生物量生长快，培养系稳定，太子参环肽B含量较高；诱导 与培养方法简单、效率高，其中太子参生长点诱导成苗率在97%以 上，丛生芽诱导不定根的生根率大于99%;本发明太子参组培苗生 物量增长快，不定根生长迅速，太子参环肽B含量高。
具体实施例方式
下面对本发明的实施例作详细说明。本实施例在以本发明技术方 案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但 本发明的保护范围并不以此为限。
实施例1:
取太子参[尸sei/J。5^e77ar/a力"aro/ 力/77a (Miq.) Pax ex Pax et Hoffm.]幼枝，用自来水清洗3 — 5遍，置于肥皂液中浸泡1小时后再
用流水冲洗1一2小时。取出用无菌滤纸吸干表面水分，用75%的乙 醇浸泡消毒20—40秒，然后用无菌水冲洗3次，吸干表面水分后置 于0. 1%的氯化汞溶液中浸泡20分钟，取出后用无菌蒸馏水冲洗6次， 吸干表面水分并在无菌显微条件下进行茎尖剥离。无菌显微条件下剥 离茎尖的叶片，取带有生长点的茎尖置于丛生芽诱导培养基MS+6-卞基氨基嘌呤(6-BA) L5mg/L (灭菌前培养基PH值精密调至6. 5) 中培养。
将步骤(l)所得丛生芽用解剖刀将近顶端部分切成0.8-1.0cm带 节间的外植体，将外植体的生物学下端插入特制MS固体培养基(MS +NAA1. 5mg/L，灭菌前培养基ra值精密调至6. 5)中进行不定根的诱 导。每瓶插5苗，置于距30W日光灯35cm的培养架中光照培养。培 养7d时外植体开始生根，其生根率大于99%。培养60d时对该组培 苗进行收获，平均每瓶太子参组培苗的干重为0.405g是接种量的 40. 5倍。
太子参组培苗中太子参环肽B的含量用高效液相色谱(HPLC)测 定，条件如下安捷伦生产的Agilent 1100 series;色谱柱为Agilent Z0RBAXSB-C18， 5um， 4.6X 150mm;柱温30°C;流动相为水 乙腈=73: 27;流动相流速lml/min;检测波长192nm。 HB的保 留时间(RT)为14.003分钟。总环肽溶液进样后收取14分钟的吸收 峰进行FAB-质谱分析，得到分子量为777的[M-l]-峰，证明为 HB[M=778]。
经HPLC分析，得出该条件下诱导培养的太子参组培苗中太子参 环肽B的含量为492. 33 ii g/g组培苗干重。
实施例2:
先按实施例1的方法步骤(1)获得丛生芽，然后用解剖刀将丛
生芽近顶端部分切成0. 8-1. Ocm带节间的外植体，将外植体的生物学 下端插入特制MS固体培养基中(MS+NAAO. 8mg/L+IBA0. 5mg/L)，每 瓶插5苗，置于距30W日光灯35cm的培养架中光照培养。培养7d时 外植体开始生根，其生根率大于99%。培养60d时对该组培苗进行 收获，平均每瓶太子参组培苗的干重为0. 25g是接种量的25倍。再 进行HPLC分析(所用方法与实施例1相同)，得出该条件下诱导培养 的太子参组培苗中太子参环肽B的含量为170. 07 u g/g组培苗干重。 实施例3:
先按实施例l的方法步骤(O获得丛生芽，然后用解剖刀将丛 生芽近顶端部分切成0. 8-1. Ocm带节间的外植体，将外植体的生物 学下端插入特制MS固体培养基中(MS+NAAO. 8mg/L+IBA0.5mg/L +2， 4-Dl. Omg/L)，每瓶插5苗，置于距30W日光灯35cm的培养架 中光照培养。培养7d时外植体开始生根，其生根率大于99%。培 养60d时对该组培苗进行收获，平均每瓶太子参组培苗的干重为 0. 24g是接种量的24倍。经HPLC分析，得出该条件下诱导培养的 太子参组培苗中太子参环肽B的含量为134. 32 u g/g组培苗干重。
实施例4:
先按实施例l的方法步骤(1)获得丛生芽，然后用解剖刀将丛 生芽近顶端部分切成0. 8-1. Ocm带节间的外植体，将外植体的生物 学下端插入特制MS固体培养基中(MS+NAAO. 8mg/L+IBA0.5mg/L +ABA0. 3mg/L)，每瓶插5苗，置于距30W日光灯35cm的培养架中 光照培养。培养7d时外植体开始生根，其生根率大于99%。培养
60d时对该组培苗进行收获，平均每瓶太子参组培苗的干重为0. 29g 是接种量的29倍。经HPLC分析，得出该条件下诱导培养的太子参 组培苗中太子参环肽B的含量为323. 93 u g/g组培苗干重。 实施例5:
先按实施例l的方法步骤(1)获得丛生芽，然后用解剖刀将丛 生芽近顶端部分切成0. 8-1. Ocm带节间的外植体，将外植体的生物 学下端插入特制MS固体培养基中(MS+NAAO. 8mg/L+IBA0. 5mg/L + 6-BAO, 2mg/L)，每瓶插5苗，置于距30W日光灯35cm的培养架中 光照培养。培养7d时外植体开始生根，其生根率大于99%。培养 60d时对该组培苗进行收获，平均每瓶太子参组培苗的干重为0. 30g 是接种量的30倍。经HPLC分析，得出该条件下诱导培养的太子参 组培苗中太子参环肽B的含量为320. 32 y g/g组培苗干重。
实施例6:
先按实施例l的方法步骤(1)获得丛生芽，然后用解剖刀将丛 生芽近顶端部分切成0. 8-1. Ocm带节间的外植体，将外植体的生物 学下端插入特制MS固体培养基中(MS+NAAO. 6mg/L+IAA0.5mg/L +6-BA0. lmg/L)，每瓶插5苗，置于距30W日光灯35cm的培养架中 光照培养。培养7d时外植体开始生根，其生根率大于99%。培养 60d时对该组培苗进行收获，平均每瓶太子参组培苗的干重为0. 38g 是接种量的38倍。经HPLC分析，得出该条件下诱导培养的太子参 组培苗中太子参环肽B的含量为372. 30 u g/g组培苗干重。
实施例7:
先按实施例1的方法步骤(1)获得丛生芽，然后用解剖刀将丛
生芽近顶端部分切成0. 8-1. Ocm带节间的外植体，将外植体的生物学 下端插入特制MS固体培养基中(MS+NAA0.5mg/L+IBA0.5mg/L+ IAAO. 5mg/L+KT0. 5mg/L)，'每瓶插5苗，置于距30W日光灯35cm的 培养架中光照培养。培养7 d时外植体开始生根，其生根率大于99 %。培养60 d时对该组培苗进行收获，平均每瓶太子参组培苗的干 重为0. 41g是接种量的41倍。经HPLC分析，得出该条件下诱导培养 的太子参组培苗中太子参环肽B的含量为695. 23 P g/g组培苗干重。 实施例8:
先按实施例1的方法步骤(1)获得丛生芽，然后用解剖刀将丛生 芽近顶端部分切成1cm带节间的外植体，将外植体的生物学下端插入 特制MS固体培养基中(MS十NAAO. 5mg/L+IBA0. 5mg/L+IAA0. 5mg/L +KTO. 5mg/L+6-BAO. 2mg/L)，每瓶插5苗，置于距30W日光灯35cm 的培养架中光照培养。培养7d时外植体开始生根，其生根率大于99 %。培养60d时对该组培苗进行收获，平均每瓶太子参组培苗的干重 为0. 45g是接种量的45倍。经HPLC分析，得出该条件下诱导培养的 太子参组培苗中太子参环肽B的含量为850. 31 u g/g组培苗干重。 实施例9:
取太子参幼枝，用自来水清洗3—5遍，置于肥皂液中浸泡1小 时后再用流水冲洗1一2小时。取出用无菌滤纸吸干表面水分，用75 %的乙醇浸泡消毒20—40秒，然后用无菌水冲洗3次，吸干表面水 分后置于10%的过氧化氢溶液中浸泡13分钟，取出后用无菌蒸馏水 冲洗6次，吸干表面水分并在无菌显微条件下进行茎尖剥离。无菌显 微条件下剥离茎尖的叶片.，取带有生长点的茎尖置于丛生芽诱导培养 基MS+6-卞基氨基嘌呤(6-BA) 1.5mg/L中培养得丛生芽。用解剖刀
将丛生芽近顶端部分切成0. 8-1. Ocm带节间的外植体，将外植体的生 物学下端插入特制MS固体培养基(MS+NAAO. 5mg/L+IBA0. 5mg/L+ IAAO. 5mg/L+KT0. 5mg/L+6-BAO. 2mg/L，灭菌前培养基PH值精密调 至6. 5)中进行不定根的诱导。每瓶插5苗，置于距30W日光灯35cm 的培养架中光照培养。培养7d时外植体开始生根，其生根率大于99 %。培养60d时对该组培苗进行收获，平均每瓶太子参组培苗的干重 为0. 45g是接种量的45倍，经检测其太子参环肽B含量为850. 31 u g/g组培苗干重。
按上述丛生芽直接诱导不定根的方法诱导出太子参不定根，诱 导出根后5天，将太子参不定根从组培苗中小心切下，洗去培养基后 精密称量0.5g接种到液体培养基中(l/2MS + NAA0.5mg/L + IBAO. 5mg/L+6-BAO. 2mg/L，灭菌前培养基PH值精密调至6. 5)，以 转速为120r/min的速度悬浮扩大培养。培养20d时对该组培苗进行 收获，平均每瓶太子参不定根的干重为0.79g是接种量的74倍。经 HPLC分析，得出该条件下诱导培养的太子参不定根中太子参环肽B 的含量为209.85"g/g组培苗干重。液体培养基中太子参环肽B的 含量为7.2ug /ml培养液。
太子参组培苗中太子参环肽B的含量用高效液相色谱(HPLC)测 定，条件如下:安捷伦生产的Agilent 1100 series;色谱柱为Agilent Z0RBAXSB-C18， 5um， 4.6X 150mm;柱温30°C;流动相为水 乙腈=73: 27;流动相流速lml/min;检测波长192nm。 HB的保 留时间(RT)为14.003分钟。总环肽溶液进样后收取14分钟的吸收 峰进行FAB-质谱分析，得到分子量为777的[M-l]-峰，证明为 HB[M=778]。
权利要求
1、含太子参环肽B组培苗的培养方法，包括以下步骤(1)太子参丛生芽的诱导、培养取太子参幼枝，经洗涤消毒后，无菌显微条件下剥离茎尖的叶片，取带有生长点的茎尖置于丛生芽培养基中培养；(2)太子参组培苗培养系的建立及太子参环肽B含量测定将步骤(1)所得丛生芽近顶端部分切成0.8-1.0cm带节间的外植体置于生根培养基内，20-25℃条件下光照培养诱导生根，生根后继续培养，并对太子参环肽B的含量进行测定。
2、 根据权利要求1所述的含太子参环肽B组培苗的方法，其特 征是经过步骤(1)和(2)之后，可进一步进行下述第(3)步骤(3) 太子参不定根的液体培养与太子参环肽B含量测定将步 骤(1)和(2)太子参组培苗中诱导出的不定根用解剖刀切下，用无 菌蒸馏水洗去不定根表面的培养基，在无菌条件下称取0. 5g置于液 体培养基中，在100-130r/min的旋转震荡器中悬浮培养；同时进行 太子参环肽B的含量测定。
3、 根据权利要求1所述的含太子参环肽B组培苗的培养方法， 其特征是步骤(1)中所采用的消毒方法为太子参幼枝用自来水清 洗3-5遍，置于肥皂液中浸泡1小时后再用流水冲洗1-2小时，取出 用无菌滤纸吸干表面水分，用75%的乙醇浸泡消毒20-40秒，然后 用无菌水冲洗3次，吸干表面水分后置于10%的过氧化氢溶液中浸泡 13分钟，取出后用无菌蒸馏水冲洗6次，吸干表面水分并在无菌显 微条件下进行茎尖剥离后置于丛生芽诱导培养基MS + 6-卞基氨基嘌1002 96.71呤(6-BA) 1. 5mg/L中培养。
4、 根据权利要求1所述的含太子参环肽B组培苗的培养方法， 其特征是步骤(2)是将步骤(1)中所得的丛生芽置于MS固体培养 基中分别加入奈乙酸(NAA) 0. 1-2.0mg/L、吲哚乙酸(IAA ) 0. l-3.0fflg/L、 B引哚丁酸(IBA) 0. 1-4.0mg/L、 6-糠基氨基嘌呤(KT) 0. 1-2.0mg/L、 6-卞基氨基嘌呤(6-BA) 0. 1-1. Omg/L、脱落酸(ABA) 0. l-1.0mg/L、 2， 4-二氯苯氧乙酸(2，4-D) 0. 5-1. 5mg/L中的一种 或几种植物激素所配制的培养基中进行不定根的诱导；灭菌前培养基 TO值精密调至6. 5;太子参组培苗中太子参环肽B的含量用高效液相 色谱(HPLC)测定，条件如下安捷伦生产的Agilent 1100 series;色 谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18, 5 u m， 4.6X150mm;柱温30°C;流动相为水乙腈=73: 27;流动相流速lml/min;检测波长192nrn; HB的保留时间(RT)为14.003min;总环肽溶液进样后收 取14min的吸收峰进行FAB-质谱分析，得到分子量为777的[M-l]' 峰，证明为太子参环肽B[M-778]。
5、 根据权利要求1或4所述的含太子参环肽B组培苗的培养方 法，其特征是将步骤(1)中所得的丛生芽置于MS固体培养基中分别 加入奈乙酸(醒)0. 1-2. Omg/L、吼哚乙酸(IAA) 0. 1-3. Omg/L、吲 哚丁酸(IBA) 0. l-4.0mg/L、 6-糠基氨基嘌呤(KT) 0. 1-2. Omg/L、 6-卞基氨基嘌呤(6-BA) 0. 1-1.0mg/L、脱落酸(ABA) 0. 1-1. Omg/L、 2， 4-二氯苯氧乙酸(2，4-D) 0.5-1.5mg/L中的一种和几种植物激素 所配制的培养基NAA或NAA+IBA或NAA + IBA+2. 4D或NAA+IBA + ABA或NAA+IBA+6-BA或NAA+IAA+6-BA或NAA+IBA+IAA+KT或 NAA+IBA + IAA+KT+6-BA中进行不定根的诱导。
6、 根据权利要求2所述的含太子参环肽B组培苗的培养方法， 其特征是步骤(3)是将步骤(2)中丛生芽直接诱导出的太子参环肽 B含量较高即不低于850. 31 P g/g组培苗干重的不定根从组培苗中切 下，洗去培养基后精密称量0.5g接种到含有奈乙酸0. 1-2.0mg/L、 吲哚丁酸0. 1-4. 0mg/L、卞基氨基嘌呤0. 1-1, 0 mg/L的1/2MS液体 培养基中，悬浮扩大培养，其含量测定方法同权利要求4的步骤(2)。
7、 根据权利要求1所述的含太子参环肽B组培苗的培养方法， 其特征是太子参环肽B含量分析采用Exel软件进行分析评价。
全文摘要
本发明基于太子参环肽B在植物体内分布的特点及其在药理方面的活性，提供一种含有效成分太子参环肽B组培苗的培养方法，包括太子参丛生芽的诱导、培养和太子参组培苗培养系的建立及太子参环肽B含量测定，还可进一步包括太子参不定根的液体培养与太子参环肽B含量测定。本方法简便易行，太子参组培苗、不定根生物量生长快，太子参环肽B含量高，是获取大量高含量太子参环肽B的太子参材料的有效途径。
文档编号A01H4/00GK101352147SQ200810058900
公开日2009年1月28日 申请日期2008年9月11日 优先权日2008年9月11日
发明者军 唐, 张颖君, 朱宏涛, 许文彦, 谭宁华 申请人:中国科学院昆明植物研究所