专利名称：：一种繁殖甘蓝型油菜自交不亲和系的方法
技术领域：
：本发明属于油菜育种领域，具体涉及一种繁殖甘蓝型油菜自交不亲和系的方法。
背景技术：
：优质(低芥酸、低硫苷)+杂优(杂种优势)育种是国内外油菜育种的发展方向。利用杂种优势的前提是有能够大量生产杂交种种子的系统(或途径)。自交不亲和系统具有选育周期短、恢复源广、无不良细胞质效应等优点，是甘蓝型油菜杂种优势利用的一个重要途径。二十世纪八十年代初，我国科学家就利用自交不亲和系、自交不亲和保持系禾C自交不亲和恢复系得到了甘蓝型油菜自交不亲和三系杂交种(刘后利等，甘蓝型油菜自交不亲和系保持系及其恢复系的选育初报，华中农学院学报，1981(3):9-17)，但是繁殖甘蓝型自交不亲和系方法的缺乏限制了自交不亲和杂种在生产上的大面积推广。甘蓝型油菜自交不亲和系自交和兄妹交都不结实。虽然可以利用剥蕾授粉法、电助授粉法、热助授粉法和C02处理(傅廷栋主编，杂交油菜的育种与利用，武汉，湖北科学技术出版社，1995)等方法来繁殖和保存甘蓝型油菜自交不亲和系，但这些方法费工费时、成本高、技术要求严格，且实施比较困难，大面积应用受到限制。已有研究表明，利用适宜浓度的盐水对花期的甘蓝型油菜自交不亲和系植株进行喷施，可以收到一定的效果。安彩泰等报道了利用盐水(NaCl)溶液可以克服芸苔属作物的自交不亲和性(安彩泰等，用化学方、法克服油菜等芸薹属作物自交不亲和性的研究，甘肃农业大学学报，1989(4):29-35);f疾国佐等从单因子试验角度，报道了利用NaCl溶液克服甘蓝型油菜自交不亲和系不亲和'牲的方法，但是对甘蓝型油菜自交不亲和系的繁殖的具体步骤并未涉及(候国佐等，NaCl溶液克服甘蓝型油菜自交不亲和系不亲和性的研究种子，I卯9(2):9-11)。由于甘蓝型油菜自交不亲和系的繁殖涉及一系列原原种和原种的培育及选择等关键步骤，而目前国内外还没有这方面的报道。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提出一种简单、有效繁殖甘蓝型油菜自交不亲和系的方法，以解决甘蓝型油菜自交不亲和系的原原种和原种的大量繁殖问题，加快甘藍型油菜自交不亲和性杂种优势的开发利用。本发明通过以下技术方案实现一种甘蓝型油菜自交不亲和系的快速繁殖方法，其步骤如下1、一种甘蓝型油菜自交不亲和系的快速繁殖方法，其步骤如下(1)在中国长江中下游的冬油菜地区于每年的8月下旬至9月上旬隔离条件下播种甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300,设株、行距分别为2米和1米，培育尽可能多分枝的大侏型甘蓝型油菜自交不亲和系，于该自交不亲和系的蕾薹期用60目的尼龙纱帐套住每一个甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300单株，在尼龙纱帐内配置蜜蜂辅助授粉；对该自交不亲和系的主花序套袋，使其自交，鉴定该自交不亲和系植株的亲和性；(2)在甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300的开花期，对隔离条件下的甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300植株每天上午喷施3%NaCi溶液1次，累计喷20-30次(每天1次)；(3)在甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300的成熟期分单株收获所述自交不亲和系的种子，按亲和指数=籽粒数/花朵数的公式计算亲和指数，淘汰亲和指数大于2的植株，分析每一单株种子的芥酸和硫苷含量，选芥酸含量小于1%、硫苷含量小于30umol/g植株的种子《乍为原原种，保存在-2(TC冰箱中备用，得到甘蓝型油菜自交不亲和系原原种；(4)在下一个繁殖季节继续在隔离条件下播种步骤(3)的原原种，并在所述的自交不亲和系的开花期每天上午喷施3。/。的NaCl溶液l次，共喷20-30次，配置蜜蜂辅助授粉，收获得到作为生产上应用的甘蓝型油菜自交不亲和系原种。本发明的优点在于1、本发明属于一种繁殖甘蓝型油菜自交不亲和系的方法，克服了传统繁殖甘蓝型油菜自交不亲和系方法的困难，其操作简单，且不受气候条件的影响。2、通过培育分枝数多的甘蓝型油菜自交不亲和植株，一次就可以得到足够多的If、原种种子，供多年繁殖原种使用，不需要每年生产原原种，也不需要每年检查原原种的亲和性，从而简化了育种的工序，节约了育种的时间，大大提高育种的效率。3、本发明的方法采取-20'C冰箱保存甘蓝型油菜自交不亲和系的种子，克服了原If、种年年繁殖引起的自交衰退，并保证了原原种的纯度。避免了田间杂油菜花粉影响甘蓝型油菜自交不亲和系植株的不亲和性。更详细的技术方案见《具体实施方式》。图1:是本发明的技术路线图。4图2:在隔离棚内未采用本发明方法的甘蓝型油菜自交不亲和系S-UOO几乎不结籽。图3:采用本发明的方法繁殖甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300的效果对比，图左边为NaCl溶液加蜜蜂辅助授粉处理的S-1300，表现为正常结籽；图右边为未处理的S-1300(对照)，表现为几乎不结籽，花而不实。图4:用本发明繁殖的甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300原种用于杂交油菜制种现场。具体实施例方式实施例l(1)采用早播的方式(即比中国长江中下游地区冬油菜正常播种时间的9月下旬至10月上旬提前20天左右，即播种期定为每年的8月下旬至9月上旬)在隔离棚条件下播禾中甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300(S-1300来源见马朝芝等，甘蓝型油菜双低自交不亲和系的选育，华中农业大学学报，1998，17(3):211-213)。设计株距为2米，行距为1米，底肥为有机肥拌和化学肥料，施用量为常规栽培方法的3倍(常规栽培方法每公顷化学月巴料施用量为碳酸氢铵300-375kg，过磷酸钙225-375kg，草木灰2250kg或硫酸钾75-150kg，硼砂7.5kg，参见杨文钰，屠乃美主编，作物栽培学各论，中国农业出版社，2003,212-213)，培育分枝多的大株型甘蓝型油菜自交不亲和系。于甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300的蕾薹期(现蕾至初花)用60目的尼龙纱帐套住每一个甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300单株，在尼龙纱帐内配置蜜峰辅助传粉；对主花序进行套袋，使其自交，以鉴定该自交不亲和系植株的亲和性；(2)在甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300的开花期(从油菜的始花期至终花期)对种植在隔离条件下的甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300植株每天上午喷施1次3%的NaCl溶液，累计喷20-30次；(3)在成熟期分单株收获所述甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300的种子，计算亲和指数(计算公式为亲和指数=籽粒数/花朵数，方法参见华中农学院作物育种组油菜科研纟且，甘蓝型油菜自交不亲和系的选育简报，中国油料，1975，(4):77~84)，淘汰亲和指数犬于2的植株，同时分析每一单株上种子的芥酸、硫苷含量，选择芥酸含量小于1%、硫劳含量小于30umol/g的植株的种子作为原原种，保存在-20'C冰箱中备用，得到甘蓝型油菜自交不亲和系原原种；(4)取步骤(3)的原原种少量种子，在下一个繁殖季节中继续播种于隔离条件T"，于甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300的蕾薹期(现蕾至初花)用60目的尼龙帐套住隔离棚，以阻止外面的花粉进入；在甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300的开花期(始花至终花)的每天上午喷施3%的NaCl溶液1次，共喷20-30次(每天1次)，配置蜜蜂以辅助授粉，得到甘蓝型油菜自交不亲和系的原种。在本实施例中，申请人进行了系列试验，以获得最好的实施方式。具体步骤如下1、利用不同浓度NaCl溶液繁殖甘蓝型油菜自交不亲和系的试验以甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300为试验材料，于2001年秋天将所述的S-1300播种在湖北省武汉市华中农业大学试验农场的隔离棚，隔离棚长为14米，宽为3.5米，中间走道长为50cm，两边按大田生产密度种植试验材料，即行宽30cm、株距15cm，每10行试验材料为l个小区，每两小区之间空l行，便于迸行不同的处理，共设10个小区。2002年春天，在S-1300开花前的3月10日，用尼龙帐套住隔离棚阻止外面花粉进入隔离棚。于油菜开花期(始花期至终花期)，对隔离棚的各小区分别实施套袋自交、喷施3。/。NaCl溶液、喷施3%NaCl溶液+蜜蜂辅助授粉、喷施4%NaCl溶液+蜜蜂辅助授粉、喷施5WNaCl溶液+蜜蜂辅助授粉等五种处理，每处理重复2次。成熟时，于每小区随机选择20株考察每一单株的花朵数和籽粒数，计算亲和指数(计算公式亲和指数=籽粒数/花朵数)试验结果见表l。表l显示种植在隔离棚内的甘蓝型油菜自交不亲和系采用自交的植株几乎不结籽，平均亲和指数仅为0.178。喷施NaCl溶液可以一定程度克服甘蓝型油菜自交不亲和系的不亲和性，但若不采用蜜蜂辅助授粉，其繁殖效果也较差。比较试验表明，以3。/。NaCl溶液+蜜蜂辅助授粉的处理效果最好。表1不同浓度NaCI溶液和蜜蜂辅助授粉繁殖甘蓝型油菜S-1300的结籽情况(以亲和指数表示)处理III平均亲和指数差异显著性值0.050.013%NaCl溶液+蜜蜂辅助授粉8.37.57.9A4%NaCl溶液+蜜蜂辅助授粉7.97.47.65eibA5%NaCl溶液+蜜蜂辅助授粉76.76.85bA3。/oNaCl溶液，无蜜蜂辅助授粉2.31.51.9cB隔离棚自交处理0.801.00.9cB2、利用NaCl溶液繁殖不同甘蓝型油菜自交不亲和系试验2002年秋天将甘蓝型油菜自交不亲和系种子S-1300、S-1310、S-1320播种在华中浓业大学试验农场隔离棚，隔离棚长为14米，宽3.5米，高度为2米，中间走道长50cm，试验材料行宽30cm,株距15cm，每]O行为1个小区，两小区之间空3行；每份试验冲才6料种植3小区，共9个小区。2003年春天，于蕾薹期用60目的尼龙纱帐套住隔离棚阻止外面花粉进入隔离棚。于甘蓝型油菜开花期(始花至终花)，对小区种植的上述甘蓝型油菜植株分别实施套袋自交、隔离棚自交、喷施3%盐水溶液+人工授粉三种处理。于成突&期，每小区随机选择20个单株考察每一单株的花朵数和籽粒数，计算亲和指数(计算方法同实施例l，试验效果见表2)。甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300、S-1310、S-1320在套袋自交的条件下的亲和指数分别为0.08、0.33和0.55，其中S-1300最低。在本试验中，3个甘蓝型油菜自交不亲和系在套袋自交和自然自交情况下的亲和指数均<2，显著低于经过NaCl溶液处理后并蜜蜂辅助授粉的亲和指数。对甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300喷3%NaCI溶液+蜜蜂辅助授粉的亲和指数为7.03，较自然自交(对照)的亲和指数0.88提高了6.99倍；S-1310和S-1320喷3"/。NaCl溶液后人工授粉的亲和指数分别为6.49和5.84，较对照的亲和指数0.15、0.35分别提高了42.26倍和15.68倍。说明喷施NaCl溶液对克服甘蓝型油菜的自交不亲和'性的效果是非常显著的。喷施相同浓度的NaCl溶液加蜜蜂辅助授粉，3个甘蓝型油菜自交不亲和系之间的亲和指数存在一定的差异，但差异不显著。表23个甘蓝型油菜自交不亲和系在隔离棚内不同处理下的结籽性试验(2002-2003年)材料名调查植株平均亲称处理数每株角果数每株总粒数和指数s-簡套袋自交1036.453.030.08自然自交(CK)50272.820.883%NaCl溶液+人工授粉20147.03腿.227.03S-1310套袋自交1042.4513.50.33自然自交(CK)5011.8925.640.153%NaCl溶液+人工授粉2073.96479.786.49S-簡套袋自交1037.1517.540.55自然自交(CK)503413.20.353%NaCl溶液+人工授粉2096.5504.085.842003-2004年重复进行上述试验，试验结果与2002-2003年的相似(表3)。表33个甘蓝型油菜自交不亲和系在隔离棚内不同处理下的结籽性试验(2003-2004年)调査植株每株角果每株总粒平均亲和指材料名称处理数(株)数(个)数数S-1300套袋自交1042.63.190.07自然自交(CK)1522.6124.60.353%NaCl溶液+人工授粉1098.73700.926.83S-1310套袋自交1041.831.90.73自然自交(CK)1547.84131.990.463%NaCl溶液+人工授粉10117.7麵.78.79<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>自交的亲和指数=籽粒数/花朵数说明甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300,S-1310,S-1320的来源参见(马朝芝等，甘蓝型油菜双低自交不亲和系的选育，华中农业大学学报，1998,17(3):211-213)3、不同喷施频度繁殖甘蓝型油菜自交不亲和系2003年秋天将自交不亲和系S-1300播种在华中农业大学试验农场隔离棚，隔离棚长14m,宽3.5m，中间为50cm的走道；试验材料行宽30cm、株距15cm，每10行为1个小区，两小区空3行；每份试验材料种植3小区，共9个小区。2004年春天，用60目的尼龙帐套住隔离棚阻止外面花粉进入隔离棚；2004年春季于油菜开花期(始花至终花)，同样用3M的NaCl溶液，同时某些处理中用到了NaCl溶液+0.3X的硼砂溶液进行喷雾来繁殖S-1300;成熟期，每小区随机选择20株考察每一单株的花朵数和籽粒数，计算亲禾口指数(表4)。表4甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300在不同处理下的结籽性试验(2003-2004年)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>四种喷施方式(3%NaCl溶液+人工授粉，1次/ld、3%NaCl溶液+人工授粉，1次/2d、3%NaCl溶液加0.3%硼砂+人工授粉，1次/2d和3%NaCl溶液，1次/2d)的亲和指数均明显高于对fi^，分别较对照提高了29.45倍、23.11倍、18.51倍和29.94倍。但方差分析结果表明，四个处理的亲和指数间无显著性差异。对五种处理的单株产量的新复极差测验(如表4)表明，喷NaCl溶液的四种处理中，以3%的NaCl溶液一天喷一次的单株产量为最高，对照的单株产量与其有极显著差异，其它三个处理的单株产量与其有显著差异。分析的结果表明，喷施NaCl溶液的频数与是否辅助授粉对甘蓝型油菜自交不亲和系的单株产量有一定影响。一天喷一次NaCl溶液和进行辅助授粉处理的单株角果数和籽粒数较多，易获得较高的单株产量。4、大株型甘蓝型油菜自交不亲和植株的培育2003年秋天采用早播的方式(比中国长江中下游地区冬油菜正常播种时间的9月下旬至10月上旬提前20天左右，)在隔离棚条件下播种甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300(见文献马朝芝等，甘蓝型油菜双低自交不亲和系的选育，华中农业大学学报，1998，17(3):211-213)，控制株距约2米，行距为l米，底肥为有机肥拌和化学肥料，施用量为常规栽培方法的3倍(常规栽培方法每公顷化学肥料施用量为碳酸氢铵300-375kg，过磷酸钙225-375kg，草木灰2250kg或硫酸钾75-150kg，硼砂7.5kg，参见杨文钰，屠乃美主编，作物栽培学各论，中国农业出版社，2003，212-213),培育多分枝的大株型甘蓝型油菜。2004-2005年重复进行大株型甘蓝型油菜自交不亲和植株的培育。5、繁殖甘蓝型油菜自交不亲和原原种在甘蓝型油菜蕾薹期(现蕾至初花)用60目的尼龙纱帐套住每一个甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300单株，使其单株之间、及与其它类型油菜隔离，尼龙纱帐内配置蜜蜂辅助传粉；对主花序进行套袋，使其自交，以鉴定植株的亲和性；油菜花期喷施3%的NaCl溶液、并在尼龙纱帐内配置蜜蜂以辅助授粉，同时，对主花序进行套袋处理，使其自交，以鉴定植株的亲和性。成熟期考察每一植株的亲和指数，淘汰亲和指数大于2的植株，分单株收获亲和指数小于2的植株种子。为了检验NaCl溶液是否对繁殖的甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300原原种的亲和性产生影响，2004年我们调查了NaCl溶液繁殖的S-1300后代的亲和性(表5)。NaCl溶液繁殖的甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300仍然保持了强而稳定的自交不亲和性，随意挑选的3个单株的亲和指数分别为0.36、0.23和0.38，说明用NaCl溶液繁殖甘蓝型油菜自交不亲和系对甘蓝型油菜自交不亲和系本身的不亲和性并不产生影响。_表5NaGI溶液繁殖S-1300后代的亲和指数(2003-2004年)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>6、原原种及其保存分析步骤(5)植株种子的品质(芥酸、硫苷)，每植株重复3次求平均值。选择芥酸含量小于1%、硫苷含量小于30umol/g的植株种子作为原原种，保存在-2(TC冰箱中备用。7、NaCl溶液繁殖甘蓝型油菜自交不亲和系原种取步骤(6)原原种的少量种子，播种在田间隔离大棚。在开花期，喷施3。/。NaCl溶、液和配置蜜蜂以辅助授粉来繁殖甘蓝型油菜自交不亲和系，使植株能正常结籽。收获该种子，作为甘蓝型油菜自交不亲和系原种种子用于自交不亲和杂种种子生产。0.5斤甘蓝型油菜自交不亲和原原种种子可种植1亩地，收获150-200斤自交不亲和原禾中种子，用于750-1000亩制种地，得到75，000-100，000斤自交不亲和杂交种，供20-30万亩大田种植。权利要求1、一种甘蓝型油菜自交不亲和系的快速繁殖方法，其步骤如下(1)在中国长江中下游的冬油菜地区于每年的8月下旬至9月上旬隔离条件下播种甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300，设株、行距分别为2米和1米，培育尽可能多分枝的大株型甘蓝型油菜自交不亲和系，于该自交不亲和系的蕾薹期用60目的尼龙纱帐套住每一个甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300单株，在尼龙纱帐内配置蜜蜂辅助授粉；对该自交不亲和系的主花序套袋，使其自交，鉴定该自交不亲和系植株的亲和性；(2)在甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300的开花期，对隔离条件下的甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300植株每天上午喷施3％NaCl溶液1次，累计喷20-30次；(3)在甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300的成熟期分单株收获所述自交不亲和系的种子，按亲和指数＝籽粒数/花朵数的公式计算亲和指数，淘汰亲和指数大于2的植株，分析每一单株种子的芥酸和硫苷含量，选芥酸含量小于1％、硫苷含量小于30umol/g植株的种子作为原原种，保存在-20℃冰箱中备用，得到甘蓝型油菜自交不亲和系原原种；(4)在下一个繁殖季节继续在隔离条件下播种步骤(3)的原原种，并在所述的自交不亲和系的开花期每天上午喷施3％的NaCl溶液1次，共喷20-30次，配置蜜蜂辅助授粉，收获得到作为生产上应用的甘蓝型油菜自交不亲和系原种。全文摘要本发明属于油菜育种领域，具体涉及一种繁殖甘蓝型油菜自交不亲和系的方法。本发明针对甘蓝型油菜自交不亲和系因大量繁殖困难而限制自交不亲和杂种大面积推广的问题，利用NaCl溶液+蜜蜂辅助授粉和系统选择方法克服甘蓝型油菜自交不亲和系的繁殖障碍，采用早播、稀植、高肥等措施培育多分枝的大株型甘蓝型油菜自交不亲和系，采用品质分析和亲和性鉴定等选择方法得到甘蓝型油菜自交不亲和系原原种，进一步得到甘蓝型油菜自交不亲和系原种。本发明为甘蓝型油菜自交不亲和系的大量繁殖提出了一种简单，有效的方法，促进了甘蓝型油菜自交不亲和性杂种优势的利用。文档编号A01G1/00GK101422115SQ200810236719公开日2009年5月6日申请日期2008年12月9日优先权日2008年12月9日发明者傅廷栋,沈金雄,涂金星,马朝芝,高长斌申请人:华中农业大学