专利名称：一种紫红色大白菜的选育方法
技术领域：
本发明涉及十字花科蔬菜育种技术领域，特别涉及一种紫红色大 白菜的选育方法。
背景技术：
大白菜(5raw/cfl ra/><a L. ssp. / eh'wem7'i")原产于中国,是十字花 科芸薹属一年生、二年生的草本植物，包括结球及不结球两大类群， 是芸薹属中最重要的蔬菜作物之一，至今仍是我国分布最广、栽培面 积最大、食用人群最多的大宗蔬菜。
随着人们生活水平的不断提高，大白菜品质育种曰益受到众多育 种者的重视。近年来，国内外相继育成的桔红心大白菜、黄心大白菜 倍受消费者的青睐。不同球色育种已经成为新、奇、特大白菜新品种 选育的新方向，是品质育种的研究内容之一。
目前芸薹属蔬菜中有紫甘蓝、紫菜薹、紫色芥菜等，却未见紫色 大白菜资源。如果能将紫色转入普通大白菜，获得紫色大白菜新品种， 不仅可以丰富大白菜品种，而且对于大白菜品质育种，生产高品质、 高营养价值的新材料具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种紫红色大白菜的选育方法。 本发明选择天然紫红色遗传特性稳定的芥菜材料为母本，综合性 状优良的大白菜为父本，通过远缘杂交、胚挽救和连续回交再自交， 得到紫红色大白菜材料，该方法可以获得遗传特性稳定的紫红色大白
其中，所述紫红色芥菜材料为PM058;所述大白菜是大白菜DH通过紫红色芥菜PM058为母本与大白菜DH系远缘杂交获得紫红 色F1植株，再以大白菜DH系为父本回交，结合田间鉴定选择紫红色 植株用大白菜DH系连续回交，获得紫红色的大白菜回交植株，再通 过自交获得遗传特性稳定的紫红色大白菜材料，具体包括-.
1) 选择获得遗传稳定的紫红色芥菜材料PM058;
2) 选择获得综合性状优良的大白菜DH系；
3) 用PM058为母本，性状优良的大白菜DH系为父本远缘杂交， 通过胚挽救技术获得F1植株；
4) 用紫红色F1植株作母本，与上述大白菜DH系父本回交获得 BCl禾中+ ;
5) 用BC1种子进行田间鉴定，选择紫红色植株作母本，与上述 大白菜DH系父本继续回交，反复通过田间选择和连续回交获得开花 正常、结籽正常的紫红色BCn植株；
6) 将紫红色BCn植株进行自交获得种子BCnSl; 本发明的方法还包括
7) 将BCnSl经田间鉴定并结合选择，获得遗传稳定、植株颜色 表现为与芥菜母本相同的紫红色的大白菜植株。
8) 将步骤7)获得的紫红色的大白菜植株继续自交扩繁获得大量 紫红色的大白菜种子。
其中，PM058是选择湖南黔阳的紫色芥菜地方品种红叶青菜(引 自中国农业科学院蔬菜花丼研究所国家品种资源中期保存库，引种 号II3A0138),通过优选株连续单株自交，获得的遗传稳定的紫红
大白菜DH系是将巿场釆购的常用大白菜种子通过游离小孢子技 术培养，获得的性状稳定的纯合系。
所述游离小孢子培养技术是近年新兴的培养技术，可参考文献Sato et al .， 1989 ， Plant regeneration from isolated microspore culture of Chinese cabbage (Brassica campestris spp. pekinensis). Plant Cell Reports, 8:486-488; Hang R L , Takahata y. , 2001, Inheritance of microspore embryogenic ability in Brassica crops" Theor. Appl. Genet., 103: 254 258，具体步骤包括
i) 选取长度为2 3mm，小孢子主要处于单核靠边期的大白菜花 蕾，用75。/o酒精浸泡30s， 7%次氯酸钠溶液洗漆15 min， 无菌蒸馏水 冲洗3遍；
ii) 用B5提取培养基提取小孢子，30)im无菌微孔纱布过滤后离心 3次，每次1000r ■ mirf1， 5 min,游离的小孢子用NLN-13 (蔗糖浓度 13%)培养基培养，血球记数板调整小孢子浓度为l 2x l05mL-'， 33 °C热激诱导2 4 h后，转入2 5 °C暗培养直至不定胚形成；
iii) 当胚胎发育为子叶期时，转入B5固体培养基继代培养，直至 获得自然加倍的DH正常植株；
iv) 将组培获得的小孢子DH植株出苗驯化，通过自交授粉获得 种子，于田间鉴定，选择综合性状优良的DH系备用。
由于用游离小孢子技术培养大白菜植株的自然加倍率很高，利用 该技术可容易得到大白菜纯合DH系。
所述B5提取培养基根据文献Gamborg， O丄.，et al., 1968, Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50， 151-158.中所述的B5培养基，添加蔗糖130.0g丄"，然后调整溶液 pH值为5.8-6.0制得。高压灭菌(12rC， 15min)后，冷却备用。
所述NLN - 13培养基根据文献J.B.M. Custers. 2003.Microspore culture in rapeseed (Brassica napus L.)〃M.Maluszynski et al.(eds.),Doubled Haploid Production in Crop Plants. Published by Kluwer Academic Publishers, Printed in the Netherlands: 185-193.中所述 成份，然后调整溶液pH值为6.0， 0.22lim针式过滤器过滤灭菌制得，4'C保存备用。
为获得开花正常、结籽正常的的紫红色植株，步骤5)需要反复 通过田间选择和与大白菜DH系为父本连续回交，反复次数 一般为3-6次。
所述胚挽救技术为为母本和父本进行人工蕾期授粉，将父本新 鲜花粉涂抹于母本(已去雄蕊)花蕾柱头，早、晚各一次，连续三天。
取授粉后7-12天，子房已隆起的角果，在超净工作台上用75% 酒精浸泡30s， 7。/。次氯酸钠溶液洗涤15min，无菌蒸馏水冲洗3遍。
用B5固体培养基进行子房培养。培养条件为25'C培养室，光照强 度1000 - 15001x，每天光照14h。
将培养IO- 15天的子房在超净工作台上用消毒的解剖针或镊子 剥离绿色种胚，继续放于B5固体培养基培养。培养条件同子房培养, 直至获得具根、茎、叶的正常F1组培苗植株。
所述B5固体培养基为在原B5固体培养基(Gamborg， O丄.，et al.,
1968, Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells.
Exp. Cell Res. 50, 151-158.)中加入以下物质，使其浓度为6-节氨基嘌 呤(6-BA) 1.5mg.L人a-萘乙酸(NAA ) 0,05 mg丄-',蔗糖30.0g丄-'， 琼脂7.0g.L—1,然后调整溶液pH值为5.8-6.0，分装于100ml三角瓶中。 高压灭菌(12rC， 15min)后，放于试验台冷却凝固备用。
根据所选择的大白菜回交父本的遗传型状，通过上述选育方法， 可得到不同抱合类型舒心、直简、叠抱、合抱等，以及不同生育期 的紫红色大白菜材料，大大丰富了大白菜的品种，为大白菜的品质育 种，生产高品质、高营养价值的新材料提供了方向。
图l为紫红色大白菜的选育系谱图。
图2为父本为中白78C1的舒心紫红色大白菜。图3为父本为桔红心C24的叠抱紫红色大白菜。
图4为父本为夏阳50C1的早熟紫红色大白菜。 图5为父本为中白78C16的晚熟紫红色大白菜。
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 实施例l
选择湖南黔阳的紫色芥菜地方品种红叶青菜(引自中国农业科学 院蔬菜花卉研究所国家品种资源中期保存库，引种号II3A0138), 通过优选株连续单株自交，自交3-5代，选择后代无性状分离的，茎 叶都为紫红色的芥菜自交种子，从而获得遗传稳定的纯合自交系 PM058。
配制B5提取培养基根据文献Gamborg, O丄.，et al., 1968， Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50， 151-158.中所述的B5培养基，先配制大量元素(浓缩20倍)、微量 元素(浓缩200倍)、铁盐(浓缩200倍)及除蔗糖之外的有机物质(浓 缩200倍)浓缩贮备液，然后取1L容量瓶，取大量元素浓縮贮备液50ml、 微量元素、铁盐及上述有机物质浓缩贮备液各5ml，添加蔗糖使其浓 度为130.0g丄人蒸馏水定容，然后，调整溶液pH值为5.8-6.0制得。 高压灭菌(121。C， 15min)后，冷却备用。
配制NLN-13培养基完全参照文献J.B.M. Custers. 2003.Microspore culture in rapeseed (Brassica napus L.)〃M.Maluszynski et al.(eds.),Doubled Haploid Production in Crop Plants. Published by Kluwer Academic Publishers, Printed in the Netherlands: 185-193.中所述 NLN-13培养基的配制方法，然后调整溶液pH值为6.0， 0.22pm针式 过滤器过滤灭菌制得，4"C保存备用。
选择大白菜品种"中白78"(购自中国农业科学院蔬菜花卉研究 所北京中蔬园艺良种研究开发中心)，通过游离小孢子技术培养纯合DH系，步骤如下
i) 选取长度为2 3mm，小孢子主要处于单核靠边期的大白菜花 蕾,用75%酒精浸泡30 s， 7%次氯酸钠溶液洗涤15 min, 无菌蒸馏水 冲洗3遍；
ii) 用B5提取培养基提取小孢子，3(Vm无菌微孔纱布过滤后离心 3次，每次IOOO r min"， 5 min, 游离的小孢子用NLN-13 (應糖浓度 13%)培养基培养，血球记数板调整小孢子浓度为l 2x 10S.mL—1， 33 °C热激诱导24 h后转入25°C暗培养，直至不定胚形成；
iii) 当胚胎发育为子叶期时转入B5固体培养基继代培养，获得自 然加倍的DH正常植株；
iv) 将组培获得的小孢子DH植株出苗驯化，通过自交授粉获得 种子于田间鉴定，选择舒心性状的"中白78C1"和晚熟"中白78C16"， 其他性状优良的DH系备用。
釆用上述游离小孢子培养技术，选择大白菜品种"北京桔红二号" (购自北京巿农林科学院蔬菜研究中心)和"夏阳50天"(巿购)，分 别培养，选择叠抱性状的"桔红心C24"和早熟大白菜"夏阳50C1"， 其他性状优良的DH系备用。
配置B5固体培养基根据文献Gamborg, O丄.，et al., 1968, Nutrient
requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res.
50, 151-158.中所述的B5培养基，先配制大量元素(浓缩20倍)、微量 元素(浓缩200倍)、铁盐(浓缩200倍)及除蔗糖之外的有机物质(浓 缩200倍)浓缩贮备液，然后取1L容量瓶，取大量元素浓缩贮备液50ml、 微量元素、铁盐及上述有机物质浓缩贮备液各5m1,此外加入以下物
质，使其浓度为6-苄氨基嘌呤(6-BA) Umgl/1, a-萘乙酸(NAA) 0.05 mg.L-1，蔗糖30.0g.L—1，琼脂7.0g'L"，蒸馏水定容，然后，调整 溶液pH值为5.8-6.0，分装于100ml三角瓶中。高压灭菌(121°C， 15min)
实施例2后，冷却凝固备用。
将紫红色芥菜PM058为母本，大白菜DH系中白78C1为父本远缘 杂交，为母本和父本进行人工蕾期授粉，将父本新鲜花粉涂抹于母本 (已去雄蕊)花蕾柱头，早、晚各一次，连续三天。
取授粉后10天，子房已隆起的角果，在超净工作台上用75%酒精 浸泡30 s， 7 %次氯酸钠溶液洗涤15 min， 无菌蒸馏水冲洗3遍。
用B5固体培养基进行子房培养。培养条件为25i:培养室，光照强 度1000- 15001x，每天光照14h。
将培养15天的子房在超净工作台上用消毒的解剖针或镊子剥离 绿色种胚，继续放于B5固体培养基培养。培养条件同子房培养，以获 得具根、茎、叶的正常F1组培苗植株。
以获得的紫红色F1植株作母本，大白菜DH系中白78Cl为父本回 交获得(中白78C1) BC1种子；
将得到的(中白78C1)BC1种子进行田间鉴定，选择紫红色植株 作母本，以大白菜DH系中白78C1为父本继续回交获得(中白78C1) BC2种子；
将得到的(中白78C1)BC2种子进行田间鉴定，选择紫红色植株 作母本，以大白菜DH系中白78C1为父本继续回交，通过田间选择和 连续回交获得开花正常，结籽正常的紫红色(中白78C1 ) BC5植株；
将得到的开花结籽正常的紫红色(中白78C1 )BC5植株进行自交 获得种子(中白78C1) BC5S1;
将得到的(中白78C1 ) BC5S1自交种子进行田间鉴定，选择得到 遗传特性稳定、植株颜色表现为与芥菜母本PM058相同，而其他性状 与大白菜DH系中白78C1接近的紫红色大白菜植株(见图2 )。
将鉴定得到的(中白78C1) BC5S1紫红色大白菜植株自交扩繁， 获得遗传特性稳定的紫红色大白菜(中白78C1) BC5S1的大量种子。
实施例3以紫红色芥菜PM058为母本，大白菜DH系桔红心C24为父本远缘 杂交，通过胚挽救技术获得F1植株；
以获得的紫红色F1植株作母本，大白菜DH系桔红心C24为父本回 交获得(桔红心C24) BC1种子；
将得到的(桔红心C24) BC1种子进行田间鉴定，选择紫红色植 株作母本，以大白菜DH系桔红心C24为父本继续回交获得(桔红心 C24) BC2种子；
将得到的(桔红心C24) BC2种子进行田间鉴定，选择紫红色植 株作母本，以大白菜DH系桔红心C24为父本继续回交，通过田间选择 和连续回交获得开花正常，结籽正常的紫红色(桔红心C24) BC6植
将得到的开花结籽正常的紫红色(桔红心C24) BC5植株进行自 交获得种子(桔红心C24) BC6S1;
将得到的(桔红心C24) BC6S1自交种子进行田间鉴定，选择得 到遗传特性稳定、植株颜色表现为与芥菜母本PM058相同，而其他性 状与大白菜DH系桔红心C24接近的紫红色大白菜植株(见图3 )。
将鉴定得到的(桔红心C24 ) BC6S1紫红色大白菜植株自交扩繁， 获得遗传特性稳定的紫红色大白菜(桔红心C24)BC6S1的大量种子。
实施例4
以紫红色芥菜PM058为母本，大白菜DH系夏阳50C1为父本远缘 杂交，通过胚挽救技术获得F1植株；
以获得的紫红色F1植株作母本，大白菜DH系夏阳50C1为父本回 交获得(夏阳50C1 ) BC1种子；
将得到的(夏阳50C1)BC1种子进行田间鉴定，选择紫红色植株 作母本，以大白菜DH系夏阳50C1为父本继续回交获得(夏阳50C1) BC2种子；
将得到的(夏阳50C1)BC2种子进行田间鉴定，选择紫红色植株作母本，以大白菜DH系夏阳50C1为父本继续回交，通过田间选择和 连续回交获得开花正常，结籽正常的紫红色(夏阳50C1) BC5植株；
将得到的开花结籽正常的紫红色(夏阳50C1 ) BC5植株进行自交 获得种子(夏阳50C1 ) BC5S1;
将得到的(夏阳50C1)BC5S1自交种子进行田间鉴定，选择得到 遗传特性稳定、植株颜色表现为与芥菜母本PM058相同，而其他性状 与大白菜DH系夏阳50C1接近的紫红色大白菜植株(见图4)。
将鉴定得到的(夏阳50C1) BC5S1紫红色大白菜植株自交扩繁， 获得遗传特性稳定的紫红色大白菜(夏阳50C1) BC5S1的大量种子。
实施例5
将紫红色芥菜PM058为母本，大白菜DH系中白78C16为父本远缘 杂交，为母本和父本进行人工蕾期授粉，将父本新鲜花粉涂抹于母本 (已去雄蕊)花蕾柱头，早、晚各一次，连续三天。
取授粉后10天，取子房已隆起的角果，在超净工作台上用75%酒 精浸泡30s， 7y。次氯酸钠溶液洗涤15min，无菌蒸馏水冲洗3遍。
用B5固体培养基进行子房培养。培养条件为25。C培养室，光照强 度IOOO- 15001x,每天光照14h。
将培养15天的子房在超净工作台上用消毒的解剖针或镊子剥离 绿色种胚，继续放于B5固体培养基培养。培养条件同子房培养，以获 得具根、茎、叶的正常F1组培苗植株。
以获得的紫红色F1植株作母本，大白菜DH系中白78C16为父本回 交获得(中白78C16) BC1种子；
将得到的(中白78C16) BC1种子进行田间鉴定，选择紫红色植 株作母本，以大白菜DH系中白78C16为父本继续回交获得(中白 78C16) BC2种子；
将得到的(中白78C16) BC2种子进行田间鉴定，选择紫红色植 株作母本，以大白菜DH系中白78C16为父本继续回交，通过田间选择和连续回交获得开花正常，结籽正常的紫红色(中白78C16) BC5植
株；
将得到的开花结籽正常的紫红色(中白78C16) BC5植株进行自 交获得种子(中白78C16) BC5S1;
将得到的(中白78C16) BC5S1自交种子进行田间鉴定，选择得 到遗传特性稳定、植株颜色表现为与芥菜母本PM058相同，而其他性 状与大白菜DH系中白78C16接近的紫红色大白菜植株(见图5)。
将鉴定得到的(中白78C16)BC5S1紫红色大白菜植株自交扩繁， 获得遗传特性稳定的紫红色大白菜(中白78C16)BC5S1的大量种子。
权利要求
1、一种紫红色大白菜的选育方法，其特征是将紫红色芥菜为母本，大白菜为父本远缘杂交获得紫红色F1植株，再以大白菜父本回交，结合田间鉴定选择紫红色植株用大白菜父本连续回交，获得紫红色的大白菜回交植株，再通过自交获得遗传特性稳定的紫红色大白菜材料。
2、 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述紫红色芥菜为 PM058。
3、 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述大白菜是大白 菜DH系。
4、 如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，包括1) 选择获得遗传稳定的紫红色芥菜材料PM058;2) 选择获得综合性状优良的大白菜DH系；3) 用PM058为母本，性状优良的大白菜DH系为父本远缘杂交， 通过胚挽救技术获得F1植株；4) 用紫红色F1植株作母本，与上述大白菜DH系父本回交获得 BC1种子；5) 用BC1种子进行田间鉴定，选择紫红色植株作母本，与上述 大白菜DH系父本继续回交，反复通过田间选择和连续回交获得开花 正常、结籽正常的紫红色BCn植株；6) 将紫红色BCn植株进行自交获得种子BCnSl。
5、 如权利要求4所述的方法，还包括1) 将步骤5)获得的BCnSl经田间鉴定并结合选择，获得遗传稳 定、植株颜色表现为与芥菜母本相同的紫红色的大白菜植株；2) 将上步获得的紫红色的大白菜植株继续自交扩繁获得紫红色 的大白菜种子。
6、 如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤5)的回交次数为3-6次。
7、如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)利用游离小孢子培养技术进行.
全文摘要
本发明涉及一种紫红色大白菜的选育方法。本发明以紫红色芥菜为母本，以大白菜为父本，通过远缘杂交获得表现为紫红色的F1代植株；以大白菜为回交父本对杂种植株进行回交；通过多代回交，选择综合性状接近大白菜，植株颜色为紫红色植株进行自交，获得遗传稳定的田间表现为紫红色的大白菜材料。通过上述选育方法，根据所选择的大白菜父本的遗传型状，可得到不同抱合类型舒心、直筒、叠抱、合抱等，以及不同生育期的紫红色大白菜材料，大大丰富了大白菜的品种，为大白菜的品质育种，生产高品质、高营养价值的新材料提供了方向。
文档编号A01H1/04GK101416607SQ200810239409
公开日2009年4月29日 申请日期2008年12月8日 优先权日2008年12月8日
发明者孙日飞, 张淑江, 菲 李, 章时蕃 申请人:中国农业科学院蔬菜花卉研究所