专利名称：一种建立兰州百合高效基因枪转化体系的方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体涉及兰州百合基因枪高频转化方法。
技术背景兰州百合(Lilium davidii var. unicolor)是百合科百合属川百合的一个变种， 是一种多年生鳞茎类草本植物。兰州百合的栽种始于清代同治年间，距今约130多年，由于 独特的土壤条件和多年积累的栽培技术，其鳞茎硕大，颜色洁白，鳞片丰满白嫩，质地细腻， 营养丰富，口味甜美而幽香；其花单生，大而美丽，香味浓郁，有很高的食用、药用、保健和观 赏价值，它不仅是中国百合中的上品，而且是中国唯一的甜百合。我国著名的植物分类学家 孔宪武教授曾评价"兰州百合味极甜美，纤维很少，又毫无苦味，不但闻名全国，亦可称世 界第一。" 近年来对兰州百合的研究主要集中在种植栽培、贮存保鲜、化学成分、细胞学、分 子学、保健食品开发、杂交育种、组织培养、离体快繁等方面。百合已被国家卫生部确定为 "既是食品又是药品"的植物之一，兰州百合的营养成分丰富，包括各种蛋白质、脂肪和维生 素等。不仅在营养方面具有重要的价值，而且兰州百合还具有重要药用价值和观赏价值。
我国是百合属植物的故乡，观赏、食用或药用百合的栽培历史十分悠久，具备良好 的种质资源基础。但目前我国的百合育种工作十分落后，现有的百合种质资源不仅没有得 到充分利用，而且破坏、流失现象十分严重。百合通常采用分球、鳞茎等繁殖，易造成种性退 化，品质下降，甚至凝聚病毒。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题与缺陷，本发明的目的在于提供兰州百合高效率 基因枪转化方法，该转化方法具有高效表达、原核基因无需修饰改造、便于遗传操作，易保 持纯系，后代不分离，大大提高了兰州百合的转化效率。 实现上述发明目的技术方案是一种建立兰州百合高效基因枪转化体系的方法， 具体包括下列步骤 选择兰州百合组培苗的鳞片作为受体材料，用基因枪法将外源DNA导入该受体材 料，在该基因枪中，采用氯化钙和亚精胺包被质粒DNA，浓度为0. 4-1. 2mg/L，使用lum金粉 作为DNA质粒的载体，轰击高度为3-9cm，轰击次数为1-3次。 本发明的方法中，转化的外源基因是GLDH，转化表达载体为pCAMBIA1303。 本发明还有一个目的是提供一种制备转基因兰州百合的方法，该方法包括以下步
骤 1)将兰州百合组培苗的鳞片在含有O. 2-0. 6M山梨醇和0. 2-0. 6M甘露醇高渗培养 基上预培养4h; 2)以预培养后的鳞片作为转化受体进行基因枪转化，采用氯化钙和亚精胺包被质 粒DNA，浓度为0. 4-1. 2mg/L，直径为lum的金粉作为DNA质粒的载体，轰击高度为3-9cm，轰击次数为1-3次； 3)将轰击后鳞片在高渗培养基上培养16h，而后在分化培养基上恢复培养7d ;
4)经恢复培养后的鳞片，在筛选压力为2mg/L潮霉素分化培养基上筛选培养30d， 后转入5mg/的再生培养基上继续进行筛选培养直至再生成植株；所述的高渗培养基由MS+2. Omg/LBA+0. 2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂组成；
所述的分化培养基由MS+2. Omg/LBA+0. 2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂组成；
所述的潮霉素分化培养基由MS+2. Omg/LBA+0. 2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂 +2mg/L hyg组成;所述的再生培养基由MS+1. Omg/LBA+0. 2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂组成。在上述方法中转化的外源基因是GLDH，转化表达载体为pCAMBIA1303。 本发明的方法成功地将GLDH基因导入到兰州百合基因组中，从而获得了移栽成
活的潮霉素抗性株系。 与现有技术相比较，本发明的方法具有以下优点 1)通过本发明的方法获得转基因植株兰州百合可以明显提高Vc含量2-5倍，从而 增加兰州百合的实用价值。 2)本发明的方法转化效率高达15%，并且育种时间仅需半年，与传统育种相比大 大縮短了兰州百合的育种时间。
图1是获得的抗性芽在潮霉素浓度为5mg/L的培养基上进行筛选培养。 图2为转基因植株的GUS染色。 图3PCR检测的电泳图。 图4转基因植株的Southern杂交图片。 图5是转基因兰州百合在生根培养基上的生长情况。
具体实施例方式
下面结合发明人给的具体实施例和试验列对本发明的方法和使用效果做进一步 阐明。 实施例l兰州百合组培苗鳞片的获得方法 洗去百合鳞茎表面泥土，剥去外层有病斑或机械损伤的鳞片，取中外层无病斑健 壮的鳞片，浸泡清洗，然后在自来水下冲洗8 12h，再用蒸馏水清洗3次，在超净台上用 70%乙醇消毒408，投入0. 1%升汞溶液中消毒15min，无菌水冲洗5次。灭菌后的鳞片切成 1. 0-2. OcmX 1. 0-2. Ocm方块，倒置接种于分化培养基1/2MS+2. Omg/LBA+0. 2mg/LNAA+30g/ L蔗糖+6g/L琼脂上。l-2月后取组培苗鳞片作为受体待侵染。
实施例2建立兰州百合高效基因枪转化体系的方法 选择兰州百合组培苗的鳞片作为受体材料，用基因枪法将外源DNA导入该受体材 料，在该基因枪中，采用氯化钙和亚精胺包被质粒DNA，浓度为0. 4mg/L，使用lum金粉作为 DNA质粒的载体，轰击高度为3cm，轰击次数为3次。该方法中转化的外源基因是GLDH，转化 表达载体为pCAMBIA1303。
实施例3建立兰州百合高效基因枪转化体系的方法 选择兰州百合组培苗的鳞片作为受体材料，用基因枪法将外源DNA导入该受体材 料，在该基因枪中，采用氯化钙和亚精胺包被质粒DNA，浓度为0. 8mg/L，使用lum金粉作为 DNA质粒的载体，轰击高度为6cm，轰击次数为2次。该方法中转化的外源基因是GLDH，转化 表达载体为pCAMBIA1303。 实施例4建立兰州百合高效基因枪转化体系的方法 选择兰州百合组培苗的鳞片作为受体材料，用基因枪法将外源DNA导入该受体材 料，在该基因枪中，采用氯化钙和亚精胺包被质粒DNA，浓度为1.2mg/L，使用lum金粉作为 DNA质粒的载体，轰击高度为9cm，轰击次数为2次。该方法中转化的外源基因是GLDH，转化 表达载体为pCAMBIA1303。 实施例5制备转基因兰州百合的方法 1)将兰州百合组培苗的鳞片在含有0. 2-M山梨醇和0. 6M甘露醇高渗培养基上预 培养4h ; 2)以预培养后的鳞片作为转化受体进行基因枪转化，采用氯化钙和亚精胺包被质 粒DNA，浓度为0. 4mg/L，直径为lum的金粉作为DNA质粒的载体，轰击高度为3cm，轰击次数 为3次； 3)将轰击后鳞片在高渗培养基上培养16h，而后在分化培养基上恢复培养7d ;
4)经恢复培养后的鳞片，在筛选压力为2mg/L潮霉素分化培养基上筛选培养30d， 后转入5mg/L的再生培养基上继续进行筛选培养直至再生成植株；
所述的高渗培养基由MS+2. Omg/LBA+0. 2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂组成；
所述的分化培养基由MS+2. Omg/LBA+0. 2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂组成；
所述的潮霉素分化培养基由MS+2. Omg/LBA+0. 2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂 +2mg/L hyg组成;所述的再生培养基由MS+1. Omg/LBA+0. 2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂组成。
在上述方法中转化的外源基因是GLDH，转化表达载体为pCAMBIA1303。
以下实施例6-8中，所用的培养基、转化的外源基因及转化表达载体均相同。
实施例6制备转基因兰州百合的方法 1)将兰州百合组培苗的鳞片在含有O. 4M山梨醇和0. 6M甘露醇高渗培养基上预培 养4h ; 2)以预培养后的鳞片作为转化受体进行基因枪转化，采用氯化钙和亚精胺包被质 粒DNA，浓度为0. 6mg/L，直径为lum的金粉作为DNA质粒的载体，轰击高度为5cm，轰击次数 为l次； 3)将轰击后鳞片在高渗培养基上培养16h，而后在分化培养基上恢复培养7d ;
4)经恢复培养后的鳞片，在筛选压力为2mg/L潮霉素分化培养基上筛选培养30d， 后转入5mg/L的再生培养基上继续进行筛选培养直至再生成植株。
实施例7制备转基因兰州百合的方法 1)将兰州百合组培苗的鳞片在含有O. 6M山梨醇和0. 2M甘露醇高渗培养基上预培 养4h ; 2)以预培养后的鳞片作为转化受体进行基因枪转化，采用氯化钙和亚精胺包被质粒DNA，浓度为1. 2mg/L，直径为lum的金粉作为DNA质粒的载体，轰击高度为9cm，轰击次数 为l次； 3)将轰击后鳞片在高渗培养基上培养16h，而后在分化培养基上恢复培养7d ;
4)经恢复培养后的鳞片，在筛选压力为2mg/L潮霉素分化培养基上筛选培养30d， 后转入5mg/L的再生培养基上继续进行筛选培养直至再生成植株。
实施例8制备转基因兰州百合的方法 1)将兰州百合组培苗的鳞片在含有O. 4M山梨醇和0. 4M甘露醇高渗培养基上预培 养4h ; 2)以预培养后的鳞片作为转化受体进行基因枪转化，采用氯化钙和亚精胺包被质 粒DNA，浓度为1. Omg/L，直径为lum的金粉作为DNA质粒的载体，轰击高度为7cm，轰击次数 为3次； 3)将轰击后鳞片在高渗培养基上培养16h，而后在分化培养基上恢复培养7d ;
4)经恢复培养后的鳞片，在筛选压力为2mg/L潮霉素分化培养基上筛选培养30d， 后转入5mg/L的再生培养基上继续进行筛选培养直至再生成植株。
试验例1转基因植株兰州百合的抗性筛选 获得再生芽后，转移至含有hyg的分化培养基上，若是转基因植株在抗生素培养 基上生长良好，若为非转基因植株，在抗生素培养基上死亡，如图1所示。
试验例2转基因植株的GUS染色将材料浸泡于GUS染色液(50mmol/L磷酸缓冲液pH 7. 0， lmmol/LEDTA， 0. 05 % Triton-100，lmmol/L铁氰化钾，lmmol/L亚铁氰化钾，甲醇20%，0. 5mg/ml X-Gluc)，37。C 染色12-24h后，用70-95%乙醇脱色。每个样本重复3次，用Olympus optics显微镜观察， 结果如图2所示，图中左为非转基因植株，右为转基因植株。
试验例3转基因植株GLDH基因的PCR检测 用于兰州百合遗传转化的基因含有GLDH基因，采用CTAB法提取叶片的DNA进行 检测，扩增片断长度为850bp。如图3所示，图中l为Mark，2为阳性对照，3为阴性对照，4-8 为转基因植株。 25ii L的反应体系包括2. 5ii L 10XPCR Bufer，1.5iiL 25mmol/L MgCl2，2iiL 2.5mmol/L dN TPs, 1 ii L10mmol/L DHARs弓|物，1 ii L 10mmol/LDHARa引物，0. 25 ii L5U/ii L 的Taq DNA聚合酶，2 ii L模板DNA，用灭菌双蒸水补齐至25 ii L。PCR的反应条件为l)94t:预变性5分钟后，2)94。C变性45秒，3)6(TC退火45秒， 4)72t:延伸1分，步骤2至4循环38次。5)最后72。C延伸10分钟。
GLDH检测引物上游引物5' -AAAACGAACCATCCGCACAGAA-3'
下游引物5' -AATAAAGAACTAACCAACAGCA-3'
试验例4转基因植株的Southern杂交 用改良CTAB法提取兰州百合的DNA，用EcoRI进行单酶切，而后进行Southern杂 交，杂交结果如图4所示，图中1-5为转基因植株，6为非转基因植株，7为阳性对照，8为 Mark。 试验例5转基因植株生根 本兰州百合的生根所用基本培养基为1/2MS培养基，各培养基附加30g/L蔗糖，
66g/L琼脂，ph5. 8， IBA浓度为0. 5-1. 5mg/L，生根结果如图5所示'
权利要求
一种建立兰州百合高效基因枪转化体系的方法，其特征在于，包括下步步骤选择兰州百合组培苗的鳞片作为转化受体进行基因枪转化，采用氯化钙和亚精胺包被质粒DNA，浓度为0.4-1.2mg/L，使用1um金粉作为DNA质粒的载体，轰击高度为3-9cm，轰击次数为1-3次。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，转化的外源基因是GLDH，转化表达载体为 pCAMBIA1303。
3. —种制备转基因兰州百合的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤1) 将兰州百合组培苗的鳞片在含有O. 2-0. 6M山梨醇和0. 2-0. 6M甘露醇高渗培养基上 预培养4h ;2) 以预培养后的鳞片作为转化受体进行基因枪转化，采用氯化钙和亚精胺包被质粒 DNA，浓度为0. 4-1. 2mg/L，直径为lum的金粉作为DNA质粒的载体，轰击高度为3-9cm，轰击 次数为1-3次；3) 将轰击后鳞片在高渗培养基上培养16h，而后在分化培养基上恢复培养7d ;4) 经恢复培养后的鳞片，在筛选压力为2mg/L潮霉素分化培养基上筛选培养30d，后转 入5mg/L的再生培养基上继续进行筛选培养直至再生成植株；所述的高渗培养基由MS+2. Omg/LBA+0. 2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂组成； 所述的分化培养基由MS+2. Omg/LBA+0. 2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂组成； 所述的潮霉素分化培养基由MS+2. Omg/LBA+0. 2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂+2mg/ L hyg组成；所述的再生培养基由MS+1. Omg/LBA+0. 2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂组成。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，转化的外源基因是GLDH，转化表达载体为 pCAMBIA1303。
全文摘要
本发明是公开了一种建立兰州百合高效基因枪转化体系的方法，选择兰州百合组培苗的鳞片作为转化受体进行基因枪转化，采用氯化钙和亚精胺包被质粒DNA，浓度为0.4-1.2mg/L，使用金粉作为DNA质粒的载体，轰击高度为3-9cm，轰击次数为1-3次，获得了抗性株系，对抗性株系进行了PCR检测和southern检测，都检测到目的基因，证实获得了转基因兰州百合。
文档编号A01H4/00GK101748147SQ20091002336
公开日2010年6月23日 申请日期2009年7月17日 优先权日2009年7月17日
发明者师守国, 李善菊, 梁东, 王平平, 王顺才, 马锋旺 申请人:西北农林科技大学