专利名称：一种保持甘蓝rgms雄性不育系的繁殖方法
技术领域：
本发明属于植物杂种优势利用技术领域，涉及一种利用二年生植物茎生 叶组织的培养实现一种甘蓝隐性核雄性不育型(Recessive genetic male sterility 简称RGMS)中雄性不育系的保持繁殖方法。
背景技术：
蔬菜作物雄性不育系的发现和利用，在杂种优势利用方面具有重要意义， 从而扩大了农作物杂种优势应用范围和实现了杂种100%的杂交率，对提高种 子质量和增加作物种植产量，获得更大的经济效益起到了重要作用。甘蓝是 重要的蔬菜作物之一，全国各地普遍种植，营养价值高，多茬栽培，周年供 应，生产中栽培品种全部选用杂种一代种子。甘蓝杂种一代种子的获得主要 采用自交不亲和系制种和利用雄性不育系制种两种途径。但利用自交不亲和 系制种存在生产的种子具有杂交率低、亲本容易流失等缺陷，而利用雄性不 育系作母本系生产一代杂种正好克服了自交不亲和系的诸多缺点，对杂种优
势发展利用起到极大的促进作用，也成为当今杂种一代种子制种的重点。 甘蓝为十字花科蔬菜作物，它的花朵为两性花，即雌蕊雄蕊同居于一朵花中。 甘蓝的有些基因型材料植株花朵雄性器官发育不良、表现退化畸形或丧失功 能，但雌性器官发育正常，能接受外来花粉而结实的现象，称为"雄性不育"。 雄性不育性是可以遗传的，通过选育可以育成不育性稳定的系统，称为雄性 不育系。利用雄性不育系配制一代杂种，只要将不育系和可育系的父本系种 植在统一隔离区内，从不育系上采收的种子就全部是杂交种。蔬菜作物的雄性不育性按其遗传方式分为核雄性不育型(Genetic male sterility简称GMS) 和胞质雄性不育型(简称CMS)两种类型。二十世纪八十年代核雄性不育型
(GMS)雄性不育系已在大白菜、萝卜、辣椒、番茄等蔬菜作物中育成，并 应用于杂种一代种子的制种；而甘蓝核雄性不育型(GMS)雄性不育系育成 和用于制种相对较晚，据报道它具有两种核基因遗传类型， 一种由一对核显 性基因决定的核雄性不育型(DGMS)雄性不育系，由中国农业科学院蔬菜花卉 研究所育成； 一种由一对核隐性基因决定的核雄性不育型(RGMS)雄性不育 系，由西北农林科技大学育成。甘蓝核雄性不育型(RGMS)雄性不育性受 核内一对质量性状隐性基因控制(基因型msms)，雄性可育性则受核内一对 质量性状显性基因控制决定(基因型MsMs);两者遗传以RGMS雄性不育系 基因型(msms)作母本与同质结合基因型(MsMs)能育父本交配，其子一代 是能育的，自交后其子二代分离比例是3 (能育)1 (不育)；若与异质结合 基因型(Msms)能育父本交配，则子一代不育类型和能育类型的比例是l : 1， 其子一代属于不育类型者是不能繁殖后代的，能育类型自交产生的子代仍按3
(能育)1 (不育)的比例分离。按照细胞核不育类型的遗传方式，不能得 到固定的不育类型。在田间不育株与能育株混在一起，生长前期不能鉴别， 要到开花后才能分清能育与不育株。
甘蓝利用核雄性不育型(RGMS)的雄性不育系制种被称为利用两用系制 种法，"两用系"就是同一系统既作不育系，又作保持系用。由一对核基因控 制的不育性，用不育株作母本，杂合能育株作父本，从不育株上收获的种子 播种后，群体内能育株和不育株约成l : l分离。利用两用系制种杂种一代种 子时按照一定的行比栽植两用系(母本系)和父本系，但两用系的株距应縮小，使栽植的株数约增加一倍，在初花期拔除两用系的能育株，以后从剩下 的不育株上收获的种子就是一代杂种。这种两用系制种是生产甘蓝杂种一代 种子的有效途径之一，但其主要存在三方面问题， 一是大面积制种拔除能育
株将投入大量人力和财力会提高种子成本；二是如果拔除能育株不彻底或初 花期拔除不及时将降低杂交率会影响种子质量；三是如果利用花期雄性不育 植株腋芽扦插繁殖，其繁殖系数低(一般10 15倍)、并成本高、植株成活 率低。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题与缺陷，本发明的目的在于提供一种保 持甘蓝RGMS雄性不育系的繁殖方法。该方法不仅有效的解决了大面积制种 时拔除能育株投入的大量人力和财力，降低了制种成本；同时，排除了拔除， 能育株不彻底或初花期拔除不及时降低杂交率的问题，提高了杂交种子的质
实现上述发明目的的技术解决方案是 一种保持甘蓝RGMS雄性不育系 的繁殖方法，包括下列步骤
1) 外植体选择
以甘蓝RGMS雄性不育系的不育株msms授可育株Msms花粉后收获的 种子，适宜时期播种育苗定植，秋季培养为成株或半成株，翌年植株生殖生 长抽薹进入初花期，根据花朵雄蕊退化的指示性状，选择雄性不育植株花茎 上着生的茎生叶片，切成边长为0.8 1.0厘米的小片作为离体培养的外植体;
2) 茎生叶片的分化诱导
把外植体接种到MS培养基上，在温度25土rC，每天光照14 16h，光照强度2000 2500Lx条件下培养40 50天诱导出丛生芽；
丛生芽的继代增殖将诱导产生的丛生芽切割成单芽转入MS培养基中
培养25 30天诱导出丛生芽，再将丛生芽切割成单芽在MS培养基上继代2
3代，芽的数量得到100倍以上增殖；
上述的MS培养基中含质量百分比为3。/。蔗糖、0.8%琼脂，1.0 2.0mg/L
的6-苄基腺嘌呤及0.1 0.2 mg/L的2,4-二氯化苯氧基乙酸；
3) 分化芽的生根诱导
待丛生芽生长至2.0 4.0cm高，自单芽基部切下将其转接至1/2MS培养 基上，在温度25土rC,每天光照10h 12h,光照强度2000 2500Lx的条 件下培养15 20天诱导生根，获得生根苗；
上述的1/2MS培养基中含质量百分比为3。/。蔗糖、0.8。/。琼脂，0.1 0.3mg/L 的a-萘乙酸、0.1 0.2mg/L刚哚乙酸；
4) 生根苗的移栽与定植
将生根苗锻炼3 5天，移植到装有土壤的塑料钵中促使其缓苗生长，在 甘蓝RGMS雄性不育系的适宜制种期将长有6 8片真叶的再生苗定植。
与现有技术相比较，本发明的保持甘蓝RGMS雄性不育系的繁殖方法具 有以下优点-
1 )首次选用甘蓝RGMS雄性不育系生殖生长期的开花植株的花茎叶片作 为外植体，接种到适宜的激素配比组织培养的培养基上进行诱导培养，获得 了具有高诱导率的再生苗，并保持了原RGMS雄性不育系遗传特性，为实现 100%杂交率种子制种探索出新途径。
2)采用本发明的繁殖方法提高了甘蓝的育种效果，保证并扩大了甘蓝雄性不育性的正常繁育。
3)克服了甘蓝雄性不育性田间正常繁育的繁琐，不但保持了不育系，并 且大幅度提高了其繁殖系数，为大量制种提供了保证。
图1是植株生殖生长抽薹进入初花期取外植体时的性状； 图2是在MS培养基上经40 50天诱导出的丛生芽； 图3是在MS培养基中培养25 30天诱导出丛生芽； 图4是将丛生芽切割成单芽在MS培养基上继代； 图5不定芽在1/2MS培养基上诱导生根； 图6生根苗移植到装有土壤的塑料钵中培养。
具体实施例方式
以下结合发明人给出的具体实施例，进一步对本发明的技术方案做一个 详细说明。 实施例l:
本实施例选用甘蓝雄性不育两用系的成株(大株)中，依据开花花朵雄蕊 退化的指示性状，选择雄性不育株的花薹茎生叶片，即甘蓝杂种一代新组合 "夏抗69"的母本——核雄性不育型RGMS雄性不育系RGMS05-632M5168的成株 (大株)抽薹植株花薹茎生叶片为材料。
1) RGMS雄性不育系成株(大株)抽薹植株的培养
将从RGMS05-632M5168系中不育植株上收获的种子，于7月上旬露地播种育 苗，当苗龄有6 7片真叶时，定植大田，正常栽培管理。到冬季上冻前(11 月上中旬)将结球紧实的RGMS05-632M5168系连根挖起，假植在提前准备好的 土窖中，冬季覆盖草帘防冻和覆盖塑料薄膜防雨雪。翌年3月上旬从窖中取出结球紧实的RGMS05-632M5168系植株定植防虫纱网棚中正常管理。
2) 外植体选择
于4月中旬结球紧实的RGMS05-632M5168系的植株抽薹初期(图l)，根据开 花花朵雄蕊退化的指示性状，观察植株花朵的育性，选择生长健壮优良的雄 性不育植株的主花茎上着生的茎生叶片作为植株再生离体培养的外植体。
3) RGMS05-632M5168系再生植株诱导培养 不定芽的诱导
选用RGMS05-632M5168系成株(大株)雄性不育株主花薹的花茎叶片，将 叶片切成lcn/左右的小方片，用75%酒精(40 50秒)、0. 1%升汞(8 10分) 消毒；接种于MS培养基中，其中含3%蔗糖(质量比)、0.8%琼脂(质量比)、 2. 0mg/L的6-苄基腺嘌呤(6-BA)及O. lmg/L的2， 4-二氯化苯氧基乙酸(2， 4-D)。在温度25。C，每天光照14h，光照强度2500Lx条件下培养，经40天诱 导出不定芽(图2)。根据秋季田间(露地)适宜定植时间(陕西定植时间为8 月下旬)，可继代1 3代(图3，图4)，延长培养时间。甘蓝雄性不育系的茎 生叶诱芽率91. 5%，分化率135%。
上述诱芽率(％)=诱导出芽的外植体数/总外植体数乂100%;
分化率(％)=分化的总芽数/总外植体数乂100%。
② 不定根的诱导
待RGMS05-632M5168茎生叶片的不定芽生长至2. 5cm高时，自不定芽基 部切下将其转入培养瓶内的生根培养基上，生根培养基为MS培养基，其中含 3%蔗糖(质量比)、0. 80/。琼脂(质量比)和0. 3mg/L的a -萘乙酸(NAA), O.lmg/L 口引哚乙酸(IAA)。在温度25°C，每天光照12h，光照强度2500Lx的条件下 培养，经20天诱导生根，培养出生根苗，生根率100%。
③ 再生苗移栽将有再生苗的培养瓶口打开锻炼3天，从培养瓶中取出再生苗，洗去根 部的培养基，移植到装有营养土的塑料钵中促使其缓苗生长。在8月下旬， 当再生苗有5 7片真叶时，适应性炼苗7天后定植于田间(露地)。秧苗成 活率95%,以后管理同于常规田间(露地)管理。 实施例2:
本实施例选用雄性不育系的半成株不育株的花薹茎生叶片，即甘蓝杂种一
代新组合"越夏王"的母本一核雄性不育型RGMS雄性不育系RGMS05-632M5168 的半成株抽薹植株花薹茎生叶片为材料。
1) RGMS雄性不育系半成株抽薹植株的培养
将从RGMS05-632M5168系中不育植株上收获的种子，于8月中旬露地播种育 苗，当苗龄有6 7片真叶时，9月中下旬定植大田，正常栽培管理；冬前对半 包球RGMS05-632M5168系的植株培土保温、冬灌，植株露地越冬。翌年开春温 度升高后，田间除草，植株上搭建防虫纱网棚，追肥浇水，促其抽薹。
2) 外植体选择
于4月上旬半包球的RGMS05-632M5168系的植株抽薹初期，观察植株花朵的 育性，选择生长健壮优良的雄性不育植株的主花茎上着生的茎生叶片作为植 株再生离体培养的外植体。
3) 再生植株诱导培养 ①不定芽的诱导
采集RGMS05-632M5168系半成株雄性不育株花薹茎生叶片后带回实验室， 先用流水冲洗3次，再在超净工作上用75%酒精浸泡50秒，0. 1%升汞消毒10分、 无菌水冲洗3遍，然后将叶片切成边长为lcm的正方形方块后，叶背朝下，接 种于MS培养基中，其中含3%蔗糖(质量比)、0.8%琼脂(质量比)、3.0mg/L的 6-苄基腺嘌呤(6-BA)及0.2 mg/L的2，4-二氯化苯氧基乙酸(2， 4_D)。在温 度25X:，每天光照12h，光照强度2000Lx条件下培养，经50天诱导出不定芽。根据秋季田间(露地)适宜定植时间(陕西定植时间为8月下旬)，可继代1 3代，延长培养时间。甘蓝雄性不育系的茎生叶的诱芽率90.5%，分化率130%。
② 不定根的诱导
待RGMS05-632M5168茎生叶片的不定芽生长至3. Ocm高时，自不定芽基 部切下将其转入培养瓶内的生根培养基上，生根培养基为MS培养基，其中含 3%蔗糖(质量比)、0. 8%琼脂(质量比)和0. 5 mg/L的a -萘乙酸(NAA)， 0.2mg/L 吲哚乙酸(IAA)。在温度25°C，每天光照10h，光照强度2000Lx的条件下 培养，经15天诱导生根，培养出生根苗，生根率100%。
③ 生根苗移栽
将生根苗的培养瓶口打开锻炼5天，从培养瓶中取出生根苗，移植到装 有营养土的塑料钵中促使其缓苗生长。在8月下旬，当生根苗有5 7片真叶 时，适应性炼苗7天后定植于田间(露地)。秧苗成活率97%，以后管理同于 常规田间(露地)管理。
ii
权利要求
1.一种保持甘蓝RGMS雄性不育系的繁殖方法，其特征在于，包括下列步骤1)外植体选择以甘蓝RGMS雄性不育系的不育株msms授可育株Msms花粉后收获的种子，适宜时期播种育苗定植，秋季培养为成株或半成株，翌年植株生殖生长抽薹进入初花期，根据花朵雄蕊退化的指示性状，选择雄性不育植株花茎上着生的茎生叶片，切成边长为0.8～1.0厘米的小片作为离体培养的外植体；2)茎生叶片的分化诱导把外植体接种到MS培养基上，在温度25±1℃，每天光照14～16h，光照强度2000～2500Lx条件下培养40～50天诱导出丛生芽；丛生芽的继代增殖将诱导产生的丛生芽切割成单芽转入MS培养基中培养25～30天诱导出丛生芽，再将丛生芽切割成单芽在MS培养基上继代2～3代，芽的数量得到100倍以上增殖；上述的MS培养基中含质量百分比为3％蔗糖、0.8％琼脂，1.0～2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤及0.1～0.2mg/L的2，4-二氯化苯氧基乙酸；3)分化芽的生根诱导待丛生芽生长至2.0～4.0cm高，自单芽基部切下将其转接至1/2MS培养基上，在温度25±1℃，每天光照10h～12h，光照强度2000～2500Lx的条件下培养15～20天诱导生根，获得生根苗；上述的1/2MS培养基中含质量百分比为3％蔗糖、0.8％琼脂，0.1～0.3mg/L的α-萘乙酸、0.1～0.2mg/L吲哚乙酸；4)生根苗的移栽与定植将生根苗锻炼3～5天，移植到装有土壤的塑料钵中促使其缓苗生长，在甘蓝RGMS雄性不育系的适宜制种期将长有6～8片真叶的再生苗定植。
全文摘要
本发明公开了一种保持甘蓝RGMS雄性不育系的繁殖方法，选取甘蓝雄性不育系花茎叶片，按照一定大小接种在不定芽分化诱导培养基上培养，当不定芽生长至2.0～4.0cm高时，转接到不定根分化诱导培养基中培养获得完整再生苗。随后将再生苗移至培养土中进行培养，当幼苗生长有6～8片真叶时，适应性炼苗3～5天后定植于田间(露地)，秧苗成活率达95％以上。采用本发明方法能够提高甘蓝育种效果，保证并扩大了甘蓝雄性不育性的正常繁育。克服了甘蓝雄性不育性田间正常繁育的繁琐，不但保持了不育系，并且大幅度提高了其繁殖系数，为大量制种提供了保证。
文档编号A01H4/00GK101564009SQ20091002281
公开日2009年10月28日 申请日期2009年6月3日 优先权日2009年6月3日
发明者辉 刘, 张恩慧, 张高翔, 杨安平, 王小艳, 程永安, 许忠民, 许念芳, 马青山 申请人:西北农林科技大学