专利名称：：恒河猴自身免疫性1型糖尿病模型的建立的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种恒河猴自身免疫性1型糖尿病模型的制备方法。
背景技术：
：自身免疫型糖尿病1型糖尿病的发病病因不明，至今没有有效的预防办法。常用的胰岛素治疗尽管可以在一定程度上调节血糖水平，但长期使用并不能有效地控制糖尿病并发症的发生，而且部分患者还有可能发生低血糖休克。如何阻止自身免疫系统对胰岛β细胞的攻击和进行有效的β细胞移植治疗，成为糖尿病研究中的关键问题。目前糖尿病研究最常用模型动物是啮齿类。由于啮齿类在进化关系上与人类相距甚远，以其为研究对象所获得的实验数据对临床指导意义不大。恒河猴的解剖特点、各系统生理功能及对疾病和治疗药物的反应性与人类极为相近，是进行免疫学相关治疗和干细胞移植、异种移植临床前有效性和安全性评价的敏感动物。利用恒河猴糖尿病模型评价新型糖尿病治疗药物，研究胰岛干细胞和异种胰岛移植的免疫排斥机理和移植耐受诱导，是国际公认的临床前实验体系，对未来这些治疗方案的临床应用具有重要的指导意义。因此建立非人灵长类糖尿病模型成为糖尿病胰岛(干)细胞移植治疗研究和临床前药物评价的迫切需要。现在常用的糖尿病动物模型有实验性糖尿病动物模型和自发性糖尿病动物模型。自发性模型应用价值较高，但因发病率低，价格昂贵，饲养、繁殖条件要求严格，而不能得到广泛应用。实验性模型则应用比较广泛，常用的诱导方法有胰腺切除术、化学药物诱发、病毒感染、拮抗胰岛素因子、食物诱发及催肥等。其中化学药物诱导方法因为操作简单、可行性高，而得到众多研究人员的推崇；而在这些方法中链脲佐菌素对机体组织毒性相对较小，动物存活率高，是目前国内外使用较多的制备糖尿病动物模型的方法。链脲菌素(str印tozotocin，STZ)是制备糖尿病模型中比较常用的诱导试剂，对一定种属动物的胰岛β细胞有选择性破坏作用，而使许多动物产生糖尿病，最常用的是大鼠模型。一般常用的诱导方法如下将大鼠禁食12h，按60mg/Kg体重腹腔注射STZ，每日1次，连续2次，成功制备1型糖尿病大鼠模型，并且该模型具有高血糖、体重减轻、多饮多食多尿的特点，与临床1型糖尿病吻合；但在此实验中，若造模组只腹腔注射STZ—次，并给予高热量饲料饲养12周，则可制2型糖尿病动物模型，且按该法制备出的模型具有超重、糖耐量减低、血脂升高、血清胰岛素升高及胰岛素受体结合力降低伴胰岛素抵抗的特点，类似2型糖尿病病人的临床特征。1型糖尿病与2型糖尿病动物模型的制备可能与STZ注射的剂量有关系大剂量(常为120mg/Kg)注射时，由于直接引起胰岛β细胞的广泛破坏，可造成1型糖尿病模型；而注射较少量STZ时，由于只是破坏一部分胰岛β细胞的功能，造成外周组织对胰岛素不敏感，同时给予高热量饲料喂养，两者结合便诱导出病理、生理改变都接近于人类2型糖尿病的动物模型。因此，链脲菌素STZ的用量的多少，直接决定了制备的糖尿病动物模型的类型。STZ制备恒河猴糖尿病模型，也有相关文献报道，如匡德宣等，不同剂量链脲菌素对恒河猴某些常规生理指标的影响，中国实验动物学报，2003年3月第11卷第1期，报道了研究链脲菌素(STZ)对恒河猴摄食、饮水、排尿、体重、血糖及尿糖等生理指标的影响，为建立糖尿病动物模型积累资料。方法通过静脉给7只恒河猴注射不同剂量的STZ。STZ的使用剂量和方法为低剂量为30mg/Kg，中间间隔15天，重复注射1-2次；中剂量为45mg/Kg，注射STZl次；高剂量为60mg/Kg，注射1次。试验结果使用不同剂量STZ后，7只恒河猴均在不同时间、不同程度出现与人糖尿病相类似的“三多一少”症状，同时对糖尿病猴使用不同剂量胰岛素可使其症状减轻。尤其是中、高剂量组的动物症状较为明显，而低剂量组体重有一个短时间的增加后又迅速下降。实验组中血糖和尿糖均出现不同程度的升高，以中、高2个剂量组的动物变化较大。因此，采用中、高剂量组(45-60mg/Kg)的STZ可诱导类似人类糖尿病的急性动物模型，而使用胰岛素治疗或低剂量STZ可使该动物模型疾病病程延长，有禾丨J于进行其并发症的石幵究°Biochemicalchangesinrhesusmonkeyduringthefirstdaysafterstreptozotocinadministrationareindicativeofselectivebetacelldestruction/TakimotoG，JonesC,LandsW,BaumanA,JeffreyJ,JonassonO·//Metabolism.1988Apr；37(4):364_70·选用22只恒河猴，静脉注射STZ(45to55mg/Kg)，约半数的恒河猴在注射后的5天内诱生胰岛素依赖性糖尿病，剩余实验恒河猴中的4只在给药后6个月内未产生胰岛素依赖性糖尿病，被认为诱生了非胰岛素依赖型糖尿病，其余8只恒河猴未对外源性胰岛素产生需求。自身免疫性糖尿病可以分为青少年型(Diabetesinchildrenandadolescents)和成年隐匿性(latentautoimmunediabetesinadults，LADA)，属于1型糖尿病的亚型，其特点为1.青少年型起病年龄小于15岁，LADA可以在15岁以后的任何年龄段，发病半年内不依赖胰岛素，无酮症发生；2.发病时多为非肥胖；3.体内胰岛B细胞抗体(ICA、GAD和胰岛素自身抗体等)常持续阳性；4.具有1型糖尿病的易感基因(如HLA-DR3、HLA-DR4、BW54及DQ-131-57-Non-ASp等)；5.常伴有甲状腺和胃壁细胞等器官特异性抗体阳性。LADA—经诊断应早期采用胰岛素治疗以保护残存的β细胞。欧美人资料报告LADA约占2型糖尿病10%15%，在非肥胖的2型糖尿病患者中有报道高达50%；有文献报告-2型糖尿病患者GAD-Ab的阳性率达14.2%。这一类型的病因是由胰岛β细胞的自身免疫性破坏而引起的胰岛素缺乏。自身免疫过程的标记物包括胰岛的淋巴细胞浸润和胰岛细胞自身抗体、胰岛细胞抗原自身抗体以及胰岛素自身抗体的检测。目前文献报道的是中、高剂量组(45_60mg/Kg)STZ诱导胰岛素依赖性糖尿病的恒河猴动物模型，没有将低剂量STZ(小于30mg/Kg)用于制备自身免疫性1型糖尿病灵长类动物模型的相关报道。
发明内容本发明的技术方案是提供了低剂量的链脲菌素在制备用于筛选治疗自身免疫性1型糖尿病的动物模型中的用途。本发明的另一技术方案是提供了恒河猴自身免疫性1型糖尿病模型的建立。本发明提供了低剂量的链脲菌素在制备用于筛选治疗自身免疫性1型糖尿病的动物模型中的用途，其中链脲菌素的施用剂量为15-30mg/Kg/次。其中，链脲菌素的施用方法和剂量为连续5天静脉给予小剂量链脲菌素每次15-30mg/Kg;末次给药后第7和14天再次给药。进一步优选地，链脲菌素的施用剂量为20-25mg/Kgo本发明还提供了一种制备自身免疫性I型糖尿病的动物模型的方法，它是将链脲菌素施用于灵长类动物，链脲菌素的施用方法和剂量为静脉给予，15-30mg/Kg/次。其中，所述灵长类动物为恒河猴。其中，所述的链脲菌素的施用方法和剂量为连续5天静脉给予小剂量链脲菌素每次15-30mg/Kg；末次给药后第7和14天再次给药。进一步优选地，链脲菌素的施用剂量为20-25mg/Kg。本发明还提供了该方法制备得到的自身免疫性1型糖尿病动物模型。本发明还提供了该动物模型在筛选治疗自身免疫性1型糖尿病的药物中的应用。本发明还提供了一种筛选治疗自身免疫性1型糖尿病的药物的方法，包括如下步骤a、它是将链脲菌素施用于灵长类动物，链脲菌素的施用剂量为15-30mg/Kg/次；b、将候选物施用于a步骤所述的灵长类动物；C、用自身免疫性1型糖尿病动物模型评价潜在的治疗自身免疫性1型糖尿病的药物。其中，a步骤所述灵长类动物为恒河猴。链脲菌素的施用方法和剂量为连续5天静脉给予小剂量链脲菌素每次15-30mg/Kg；末次给药后第7和14天再次给药。其中，c步骤所述的评价指标主要有动物糖尿病的发病时间、发病率和β细胞的损伤的程度。本发明动物模型可以用于啮齿类动物模型无法完成的生物技术新药的评价和干细胞移植治疗技术的评价。以下通过具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。图1血清抗胰岛细胞抗体检测结果(其中，图IA为抗胰岛素抗体阳性对照、图IB为阴性对照、图IC为本发明动物模型(编号05539)血清抗胰岛细胞抗体检测结果；图ID为本发明动物模型(编号05572)血清抗胰岛细胞抗体检测结果)，标尺为50μm。图2猴胰腺组织切片HE染色(图2A为正常猴胰腺(标尺为50μm)；图2B为本发明动物模型组胰腺在胰岛周围观察到淋巴细胞浸润(标尺为50μπι))图3本发明动物模型胰腺组织切片的免疫组化结果(图3Α胰岛素表达细胞的分布；图3Β胰高血糖素表达细胞的分布(标尺均为100μm))具体实施例方式实施例1本发明动物模型的制备1、材料与方法1.1实验材料2-3岁雌性和雄性恒河猴6只，无B疱疹病毒、猴逆转录病毒、猴白血病病毒和免疫缺陷病毒感染；购自成都平安动物繁育基地。1.2主要试剂链脲菌素(STZ)购自成都宇洋高科技发展有限公司其他药品和耗材均购自华西医院利康药房1.3主要溶液的配制链脲菌素溶液的配制0.lmol/L枸橼酸钠缓冲液配制A液(0.lmol/L枸橼酸溶液)称取2.Ig枸橼酸(C6H8O7·H2OFff210.14)溶于IOOml双蒸水中。B液(0.IM枸橼酸钠溶液)称取2.94g枸橼酸钠(C6H5Na3O7·2H20Fff294.10)溶于IOOml双蒸水中。工作液用时取28mlA液加22mlB液(按照1.321的比例)，双蒸水稀释到100ml，调pH=4.5。链脲菌素溶液按动物重量比称取STZ，用上述A、B混合工作液以的浓度溶解STZ，随用随配，该液要求4°C配置、保存，尽量在30分钟内注射完毕。1.4主要仪器1)麻醉机=Excel210SE,Datex-Ohmeda2)呼吸机配心电监护仪M/206B，Philips公司3)高频电刀(H.F.ELECTR0T0ME)⑶_350_P型，上海沪通电子有限公司4)血糖检测仪罗康全活力型血糖检测仪，罗康全活力型血糖试纸5)全波长分光光度计1.5实验方法1.5.1恒河猴静脉葡萄糖耐受实验通过静脉葡萄糖耐受实验(Theintravenousglucosetolerancetest,IVGTT)测试动物胰腺功能，了解血糖波动范围，排除动物患有自发性糖尿病的可能。1)动物禁食10_12h，不禁水；2)根据动物购买时体重，按15mg/Kg肌肉注射氯氨酮(50mg/ml)；3)待动物麻醉后，准确称量体重，并记录；4)将恒河猴上下肢固定于手术台上，下肢小腿后侧备皮暴露大隐静脉，碘氟消毒；5)20G留滞针穿刺大隐静脉，5ml注射器抽血6ml(分别做生化、血常规、血糖和空腹胰岛素，并标记为0分钟数值)；6)立即用5ml注射器静脉推注50%葡萄糖高渗溶液0.5g/Kg(在30sec内推完)，并开始记时，再注射生理盐水5ml，向留滞针内推肝素(250U/ml)Iml；7)分别于记时后的第l，3，5，10，30min时采血1.5ml，放入红头采血管，测定胰岛素水平;同时分别于第0，1，3，5，10，30，60，120111士11时测定血糖；8)检测结束，将动物放回饲养笼中，观察动物状况至苏醒。1.5.2小剂量STZ诱导造糖尿病模型连续5天静脉给予小剂量STZ每次15-30mg/Kg；末次给药后第7和14天再次给药；每周观察空腹血糖一次，以连续2天空腹血糖高于11.lmmol/L,C-肽水平低于0.5nmol/L，抗胰岛细胞抗体和抗胰岛素抗体阳性为建模成功。以下为两组实验的动物给药方案<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>6只恒河猴按本发明方法造模，有4只造模成功。1.5.3恒河猴血清胰岛素测定(放射免疫分析法)使用北京北方生物技术研究所胰岛素检测试剂盒，按照操作说明书要求程序，分析动物血清中胰岛素含量。1.5.4恒河猴血清胰岛细胞抗体检测(免疫组织化学法)使用正常猴胰腺组织切片，分别与试验组猴血清、正常猴血清(阴性对照)和抗胰岛素抗体(阳性对照)反应后，再与HRP酶标二抗结合，加入底物显色后，显微镜下观察胰岛细胞着色情况，判断血清中有无抗胰岛细胞抗体存在。1.5.5恒河猴血清胰岛素抗体检测(酶联免疫分析法)使用北京北方生物技术研究所胰岛素抗体检测试剂盒，按照操作说明书要求程序，分析动物血清中有无胰岛素抗体。1.5.6胰腺、肝、肾活检手术1)动物麻醉15mg/Kg氯氨酮(50mg/ml)基础麻醉，麻醉后称动物体重；2)动物固定于手术台上，仰卧位，双下肢备皮，建立静脉通道；3)手术区域皮肤准备，备皮区域为双侧乳头连线以下、腹股沟以上、腋前线以前。4)通过静脉通道，进行静脉全麻，气管插管，使用呼吸机、麻醉机。贴电极片，进行心电监护。监测氧饱和度、呼吸及体温；建立股动脉通道，测动脉血压；5)手术人员洗手消毒，手术区域消毒艾力克纱布对以手术切口(上腹正中切口)为中心向周围至少15cm皮肤无遗漏地涂擦。待艾力克涂液自然干燥后，再用70%酒精棉球将艾力克擦去；6)铺无菌巾单和无菌大单和大洞单，无菌大单上端应盖过麻醉架，下端盖过动物足部。大洞单洞口要对准手术野皮肤；7)上腹正中切口，切口前用70%酒精再次消毒切口皮肤，依次切开皮肤、皮下脂肪、肌层、腹膜进入腹腔；8)胰腺探查，切开胃结肠韧带，进入小网膜腔；9)胰腺活检组织获取从胰体与十二指肠部分钝性剥离1cm，1号丝线结扎血管后切取胰腺组织(约0.5g)；10)肝脏活检组织获取1号丝线结扎肝叶边缘，做楔形切割获取组织约Ig；11)肾脏活检组织获取1号丝线结扎肾边缘，做楔形切割获取组织约0.3g；12)清洗腹腔，按层缝合腹壁切口；13)手术苏醒及术后护理动物术后禁食1天。手术苏醒后24h内肌肉注射曲马多镇痛治疗，头孢噻肟钠抗感染治疗5天；14)术后检测动物血糖，7天后拆线，生化血常规检查；2.实验结果恒河猴静脉注射STZ后空腹血糖在3.2-17.6mmol/L之间波动，动物的空腹血糖持续高于11.lmmol/L，血清C-肽检测低于0.5nmol/L，血清抗胰岛细胞抗体(见图1C，1D)和抗胰岛素抗体检测阳性；动物胰腺组织病理活检显示胰岛周围有淋巴细胞浸润(图2B)，胰岛组织中仅有极少量胰岛素表达阳性细胞残存(图3A)，90%以上为胰高血糖素表达阳性细胞(图3B)，判断为自身免疫性1型糖尿病模型建模成功。实施例2本发明动物模型的药物干预试验一、受试药物环孢霉素(免疫抑制药物，可降低小鼠自身免疫性糖尿病的发生率)；二、试验方法环孢霉素对自身免疫性糖尿病发病过程的干预作用实验分为生理盐水空白对照组和环孢霉素干预组在STZ诱导自身免疫性糖尿病的过程中，干预组同时每天给予环孢霉素(2.5mg/Kg)，比较空白对照组和干预组动物糖尿病的发病时间、发病率和β细胞的损伤的程度。通过免疫抑制药物干预自身免疫性糖尿病的发病过程，观察到动物模型中β细胞的损伤程度降低，进一步证明本发明动物模型为自身免疫性1型糖尿病模型，且采用本发明的造模方式可成功造模。实施例3用治疗自身免疫性1型糖尿病的药物验证自身免疫性1型糖尿病恒河猴动物模型并初步建立相关药物筛选平台目前自身免疫性1型糖尿病的治疗方法主要以注射胰岛素治疗，本实验将胰岛素用于恒河猴自身免疫性1型糖尿病模型，具体方式为1、根据恒河猴每天进食两餐的习惯，应用一天两次(9:30am&16:30pm)注射不同剂量不同种类胰岛素的方法，施用于实施例1制备的本发明自身免疫性1型糖尿病模型①长效胰岛素万邦(徐州)产猪胰岛素(精蛋白锌胰岛素)和②短效胰岛素万邦(徐州)产猪普通胰岛素的联合治疗；2、为了防止低血糖发生，从小剂量(0.4U/Kg)开始皮下注射胰岛素；3、监测空腹和餐后血糖水平，根据血糖水平调整给药剂量，最终可将动物的空腹和餐后血糖控制在低于10mmol/L水平，糖化血红蛋白低于6.5%。试验结果胰岛素对自身免疫性1型糖尿病具有较佳的治疗效果。该实验证明，本发明动物模型适用于身免疫性1型糖尿病的治疗研究和糖尿病并发症的发生和治疗研究，可用于筛选治疗自身免疫性1型糖尿病的药物及治疗方法。综上所述，本发明制备的自身免疫性1型糖尿病动物模型建模成功，可以用于啮齿类动物模型无法完成的生物技术新药的评价和干细胞移植治疗技术的评价。权利要求低剂量的链脲菌素在制备用于筛选治疗自身免疫性1型糖尿病药物的动物模型中的用途，其中链脲菌素的施用剂量为15-30mg/Kg/次。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于链脲菌素的施用方法和剂量为连续5天静脉给予小剂量链脲菌素每次15-30mg/Kg；末次给药后第7和14天再次给药。3.一种制备权利要求1或2所述的自身免疫性1型糖尿病动物模型的方法，其特征在于它是将链脲菌素施用于灵长类动物，链脲菌素的施用剂量为15-30mg/Kg/次。4.根据权利要求3所述的自身免疫性1型糖尿病动物模型的制备方法，其特征在于所述灵长类动物为恒河猴。5.根据权利要求3或4所述的自身免疫性1型糖尿病动物模型的制备方法，其特征在于所述的链脲菌素的施用方法和剂量为连续5天静脉给予小剂量链脲菌素每次15-30mg/Kg；末次给药后第7和14天再次给药。6.权利要求3-5任一一项所述的方法制备得到的自身免疫性1型糖尿病动物模型。7.权利要求6所述的动物模型在筛选治疗自身免疫性1型糖尿病的药物中的应用。8.一种筛选治疗自身免疫性1型糖尿病的药物的方法，包括如下步骤a、它是将链脲菌素施用于灵长类动物，链脲菌素的施用剂量为15-30mg/Kg/次；b、将候选物施用于a步骤所述的灵长类动物；c、用自身免疫性1型糖尿病动物模型评价潜在的治疗自身免疫性1型糖尿病的药物。9.根据权利要求8所述的筛选药物的方法，其特征在于a步骤所述灵长类动物为恒河猴。10.根据权利要求8或9所述的筛选药物的方法，其特征在于a步骤所述的链脲菌素的施用方法和剂量为连续5天静脉给予小剂量链脲菌素每次15-30mg/Kg；末次给药后第7和14天再次给药。全文摘要本发明提供了低剂量的链脲菌素在制备用于筛选治疗自身免疫性1型糖尿病药物的动物模型中的用途，其中链脲菌素的施用方法和剂量为静脉给予，15-30mg/Kg/次。本发明还提供了一种制备恒河猴自身免疫性1型糖尿病模型的方法，及该方法制备的自身免疫性1型糖尿病动物模型。本发明动物模型可以用于啮齿类动物模型无法完成的生物技术新药的评价和干细胞移植治疗技术的评价。文档编号A01K67/027GK101804211SQ200910058330公开日2010年8月18日申请日期2009年2月13日优先权日2009年2月13日发明者乔超锋,任艳,何斯荣,张文胜,曾力,李宏霞,王莉,田伯乐,程惊秋,邓绍平,金熙,陆燕蓉,陈又南,魏玲玲,麦刚申请人:四川大学华西医院;成都华西海圻医药科技有限公司