专利名称：：一种耐低温大黄鱼选育的方法
技术领域：
：本发明属于海水水产养殖领域，尤其涉及一种耐低温大黄鱼选育及鉴定的方法。
背景技术：
：大黄鱼是中国近海主要经济鱼类，大黄鱼为暖温性近海集群洄游鱼类，主要栖息于80米以内的沿岸和近海水域的中下层。因为大黄鱼为暖温性近海集群洄游鱼类，海洋温度的变化限制了近海人工养殖。大黄鱼的培育、优选方法一直是本领域的主要研究方向，如一篇中国专利号为CN200510060346.1的发明公开了一种人工培育的大黄鱼及其培育方法，它包括以下步骤本发明公开了一种人工培育的大黄鱼及其培育方法，在养殖的过程中增加黄鱼亲本选育，采用群体选育并结合分子标记辅助选育的技术，快速选育出岱衢族大黄鱼优良品系，由此培育的大黄鱼具有体型较好，生长速度较快，品质较佳，成活率较高的特点，所培育的大黄鱼的体型参数为尾柄长/尾柄高为3.6，体长/体高为3.9，它的生化组份为蛋白质含量18.34%，肌肉中总氨基酸含量为152.0mg/g，含脂量为2.89%,血液DNA分子具有871bp的特异性标记，鳍条同工酶具有一个苹果酸酶(ME)特异性标记。但是，目前没有任何文献指出了关于大黄鱼在较冷的海水温度下养殖、选育和鉴定的方法。
发明内容本发明主要是解决目前多数大黄鱼不能适应低温养殖的现状，选取自然能耐受低温的大黄鱼个体，通过优选培育，得到耐低温大黄鱼选育方法，同时提供了耐低温大黄鱼的鉴定方法。本发明的上述技术问题主要是通过下述技术方案得以解决的耐低温大黄鱼选育的方法，其步骤包括(A)优选耐低温大黄鱼选取普通海域成长、体格健康的成年大黄鱼50尾以上，在4。C8。C的低温条件下进行养殖，养殖时间为5天以上，直到少部分存活；当只有雄性大黄鱼存活或只有雌性大黄鱼存活时，需重新进行本步骤，直到雄性大黄鱼与雌性大黄鱼均有存活；(B)培育耐低温大黄鱼选取能够耐受低温存活的大黄鱼进行人工繁育，采用保温催产的方法得到受精卵，然后对受精卵进行人工孵化，鱼种在固定场所人工养成，得到耐低温大黄鱼F1代；(C)将耐低温大黄鱼Fl代作为亲鱼再次进行步骤(A)和步骤(B)，得到耐低温大黄鱼F2代；将耐低温大黄鱼F2代作为亲鱼再次进行步骤(A)和步骤(B)，得到耐低温大黄鱼F3代；依此步骤重复得到耐低温大黄鱼Fn代，n》3，得到耐低温大黄鱼品种。上述耐低温大黄鱼选育的方法，作为优选，所述的步骤(A)可分为以下三步(1)先将选取的普通大黄鱼养殖在正常温度状态下，然后采用人工手段对养殖池水进行降温，降温幅度为0.5'C/天2'C/天，直至温度为4'C8。C时止；(2)将大黄鱼养殖在4'C8'C的水温状态下，并且维持水温在同一数值养殖大黄鱼8天12天；(3)采用人工手段对养殖池水进行升温，升温幅度为0.5TV天2'C/天，至正常养殖池水温度恢复为正常养殖状态时止，将存活的大黄鱼作为7步骤(B)对象。上述耐低温大黄鱼选育的方法，作为优选，所述的步骤(A)在选育耐低温大黄鱼时，需要及时去除死亡的大黄鱼，保持养殖水域的清洁。上述耐低温大黄鱼选育的方法，作为优选，所述的步骤(A)的降温方法为在养殖池中加入冰块或干冰。上述耐低温大黄鱼选育的方法，作为优选，所述的步骤(A)中选取的大黄鱼为普通海域人工养殖的大黄鱼，经过步骤(A)的优选，当存活的大黄鱼少于10条时，需重新进行步骤(A)，直到存活的大黄鱼数量大于30条。上述耐低温大黄鱼选育的方法，作为优选，所述的步骤(B)可分为以下四步(1)将步骤(A)结束后存活的大黄鱼作为亲鱼，控制亲鱼培育水温在2(TC-2rC;然后用促黄体素释放激素LRH-A3对亲鱼进行催产；(2)进行受精卵的人工孵化，收集的受精卵在孵化之前进行分离，即让其在塑料桶中静置十几分钟，上浮卵一般为好卵,沉底的都是次卵，，鱼卵放入孵化桶中孵化，水温控制20.521'C，连续充气，充气量盒大，以呈翻滚状为好，光照控制在5001x之内，要特别注意孵化桶的水质，一般经过2931h孵化，鱼卵破膜孵出仔鱼，一旦仔鱼孵出，应及时通过虹吸把仔鱼移送到育苗池进行培育；(3)仔鱼培育利用对虾育苗池育苗室进行大黄鱼育苗，单口水泥池规格为3040m2，水池深1.4m，长方形，经漂白粉消毒，加海水至L2m，育苗用水经砂滤池过滤，再经黑暗沉淀进人预热池，仔鱼培育密度控制在l万2万尾/m3，仔鱼进入培养阶段时，刚开始换水，每日换2次，一般为上午7:00和下午6:00，换水量根据分布密度等具体情况而定，一般前期换水量为1/102/5，后期加大换水量为1/24/5，根据需要测量盐度、氨氮，以换水调节水质，仔鱼培育期间，用1500W的电热棒调控水温，使水温保持在2224'C之间，每天定时测量水温，使水温保持在最佳适温范围内，在出苗前23d逐渐利用自然降温，将水温降至与自然水温相同；盐度为20%。25%。；散气石布设O.20.3个/m2，连续充气，仔鱼培育前期，充气量以水面呈微波为好，随仔鱼发育逐渐增大充气量；仔鱼5日龄开始第一次吸污，以后仔鱼期保持每3d吸污一次，稚鱼期每2d—次，幼鱼期每日一次，仔鱼期培育每隔15d左右翻池一次，饵料投喂仔鱼出膜2日龄时开始投喂轮虫，以后池内轮虫保持一定的密度27日龄，轮虫密度为l3个/mL;710日龄后，改投喂卤虫无节幼体为主，水体中卤虫密度保持在35个/mL，15日龄后，开始改投桡足类，投喂量为l个/mL,25日龄后加投少量鱼糜，用量根据鱼苗的摄食及残饵多少而定；(4)苗种养成采用深水网箱进行大黄鱼的苗种养成，选择水质肥沃，盐度范围为24.834.5;pH为7.858.35;D0在4mg/L以上的海区，选择尾重50g以上的大黄鱼进行网箱养殖，放养密度20尾/m3，每天上午7:00和下午6:00投喂2次，日投喂量占鱼体重的6%8%(以鲜嵙计算)，加强鱼病和网箱的管理，得到存活的健康的大黄鱼即为耐低温大黄鱼。上述耐低温大黄鱼选育的方法，作为优选，所述的步骤(C)中n的值为3，耐低温大黄鱼F3代在4'C8'C的低温条件下养殖的存活率为70%90%。以上方法得到的耐低温大黄鱼鉴定的方法，主要是进行RAPD研究和蛋白质分析，区分出耐低温大黄鱼新品系，其步骤可分为以下四步1)观察低温环境下正常存活的新特征，如活动、进食、生殖情况，以区别原种大黄鱼。2)分别提取耐低温大黄鱼和原种大黄鱼的总DNA，并以10碱基随机引物对这些总DNA进行随机扩增多态DNA研究比较；10碱基随机引物见表1。选取20条随机引物对耐低温大黄鱼进行RAPD分析，从中筛选出可得到稳定扩增产物的多态性引物。耐低温的大黄鱼RAPD分析结果显示特异性条带的产生，而普通大黄鱼则不具备相应条带，显示特异性的耐低温分子标记。3)提取耐低温大黄鱼和原种大黄鱼的总蛋白质进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后采用考马斯亮蓝染色法用考马斯亮蓝R250染色，扫描记录结果。比较两者的蛋白质电泳图谱，耐低温大黄鱼由于基因表达的差异，可表达出大量的耐低温蛋白，而普通大黄鱼则产生的耐低温蛋白数量少，电泳图谱的结果是耐低温的大黄鱼具备特异性的条带或某些条带颜色较普通大黄鱼深。4)根据低温环境下正常存活的新特征和RAPD研究及蛋白质分析结果，确认获得耐低温大黄鱼新品系。新的耐低温大黄鱼可找到特异性的耐低温分子标记，用RAPD技术可明显找到与普通大黄鱼的差异，蛋白质分析结果也能找到特异性表达的蛋白或表达量高的耐低温蛋白。结果显示可选育出耐低蕰的大黄鱼并可通过分子生物学和蛋白质分析羊段进行验证。表lIO碱基随机引物<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>10碱基随机引物为上海生工的s系列随机引物DNA研究比较结果是耐低温大黄鱼RAPD分析图谱显示特异性的条带，蛋白质电泳图也显示有特异性的蛋白表达。因此，本发明具有以下优点用本方法选育的大黄鱼能够较好的耐受低温环境，具有广阔的产业化前景。具体实施例方式下面通过实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。实施例1:耐低温大黄鱼选育的方法的主要步骤包括A、B、C三步(A)优选耐低温大黄鱼选取普通海域成长、体格健康的成年大黄鱼50尾以上，在4。C8。C的低温条件下进行养殖，养殖时间为5天以上，直到少部分存活；当只有雄性大黄鱼存活或只有雌性大黄鱼存活时，需重新进行本步骤，直到雄性大黄鱼与雌性大黄鱼均有存活；在选育耐低温大黄鱼时，需要及时去除死亡的大黄鱼，保持养殖水域的清洁。降温方法为在养殖池中加入冰块或干冰。选取的大黄鱼为普通海域人工养殖的大黄鱼，经过步骤(A)的优选，当存活的大黄鱼少于10条时，需重新进行步骤(A)，直到存活的大黄鱼数量大于30条。步骤(A)可分为以下三步(1)先将选取的普通大黄鱼养殖在正常温度状态下，然后采用人工手段对养殖池水进行降温，降温幅度为0.5。C/天2。C/天，直至温度为4°C8'C时止；(2)将大黄鱼养殖在4'C8'C的水温状态下，并且维持水温在同一数值养殖大黄鱼8天12天；(3)采用人工手段对养殖池水进行升温，升温幅度为0.5TV天2'C/天，至正常养殖池水温度恢复为正常养殖状态时止，将存活的大黄鱼作为步骤(B)对象。(B)培育耐低温大黄鱼选取能够耐受低温存活的大黄鱼进行人工繁育，采用保温催产的方法得到受精卵，然后对受精卵进行人工孵化，鱼种在固定场所人工养成，得到耐低温大黄鱼F1代；步骤(B)可分为以下四步(1)将步骤(A)结束后存活的大黄鱼作为亲鱼，控制亲鱼培育水温在20°C-21°C;然后用促黄体素释放激素LRH-A3对亲鱼进行催产；(2)进行受精卵的人工孵化，收集的受精卵在孵化之前进行分离，即让其在塑料桶中静置十几分钟，上浮卵一般为好卵,沉底的都是次卵，，鱼卵放入孵化桶中孵化，水温控制20.521t:,连续充气，充气量宜大，以呈翻滚状为好，光照控制在5001x之内，要特别注意孵化桶的水质，一般经过2931h孵化，鱼卵破膜孵出仔鱼，一旦仔鱼孵出，应及时通过虹吸把仔鱼移送到育苗池进行培育；(3)仔鱼培育利用对虾育苗池育苗室进行大黄鱼育苗，单口水泥池规格为3040m2，水池深1.4ra，长方形，经漂白粉消毒，加海水至l.2m，育苗用水经砂滤池过滤，再经黑暗沉淀进人预热池，仔鱼培育密度控制在l万2万尾/m3，仔鱼进入培养阶段时，刚开始换水，每日换2次，一般为上午7:00和下午6:00，换水量根据分布密度等具体情况而定，一般前期换水量为1/102/5，后期加大换水量为1/24/5，根据需要测量盐度、氨氮，以换水调节水质，仔鱼培育期间，用1500W的电热棒调控水温，使水温保持在2224'C之间，每天定时测量水温，使水温保持在最佳适温范围内，在出苗前23d逐渐利用自然降温，将水温降至与自然水温相同；盐度为20%。25%。；散气石布设O.20.3个/m2，连续充气，仔鱼培育前期，充气量以水面呈微波为好，随仔鱼发育逐渐增大充气量；仔鱼5日龄开始第一次吸污，以后仔鱼期保持每3d吸污一次，稚鱼期每2d—次，幼鱼期每日一次，仔鱼期培育每隔15d左右翻池一次，饵料投喂仔鱼出膜2日龄时开始投喂轮虫，以后池内轮虫保持一定的密度27日龄，轮虫密度为l3个/mL;710日龄后，改投喂卤虫无节幼体为主，水体中卤虫密度保持在35个/mL，15日龄后，开始改投桡足类，投喂量为l个/mL，25日龄后加投少量鱼糜，用量根据鱼苗的摄食及残饵多少而定；(4)苗种养成采用深水网箱进行大黄鱼的苗种养成，选择水质肥沃，盐度范围为24.834.5;pH为7.858.35;D0在4mg/L以上的海区，选择尾重50g以上的大黄鱼进行网箱养殖，放养密度20尾/m3，每天上午7:00和下午6:00投喂2次，日投喂量占鱼体重的6%8%(以鲜料计算)，加强鱼病和网箱的管理，得到存活的健康的大黄鱼即为耐低温大黄鱼。(C)将耐低温大黄鱼Fl代作为亲鱼再次进行步骤(A)和步骤(B)，得到耐低温大黄鱼F2代；将耐低温大黄鱼F2代作为亲鱼再次进行步骤(A)和步骤(B)，得到耐低温大黄鱼F3代。经过饲养观测，耐低温大黄鱼F3代在4'C8'C的低温条件下养殖的存活率为70%90%。本发明中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属
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的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。序列表<110>浙江海洋学院<120>—种耐低温大黄鱼选育的方法<130><140>CN200910095301.6<141>2009-01-05<160>20<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>10<212>DNA<213>S421<400>1CTCACGTTGG10<210>2<211>10<212>DNA<213>S422<400>2ACCAGGGGCA10<210>3<211>10<212>DNA<213>S423<權>3GGTACTCCCC10<210>4<211>10<212>DNA<213>S424<400>4GACCGACCCA10<210>5<211>10<212>DNA<213>S425<400>5ACTGAACGCC10<210>6<211>10<212>DNA<213>S426<400>6GAGACGCACA10<210>7<211>10<212>DNA<213>S427<400>7CAGCCCAGAG10<210>8<211>10<212>DNA<213>S428<400>8ACCTCAGCTC10<210>9<211>10<212>DNA<213>S429<400>9TGCCGGCTTG10<210>10<211>10<212>DNA<213>S430<400>10ACAACTGGGG10<210>11<211>10<212>DNA<213>S431<400>11TCGCCGCAAA10<210>12<211>10<212>DNA<213>S432<400>12CACAGACACC10<210>13<211>10<212>DNA<213>S433<400>13AGCGTCACTC10<210>14<211>10<212>DNA<213>S434<400>14TCGTGCGGGT10<210>15<211>10<212>DNA<213>S435<400>15CAGCGACTGT10<210>16<211>10<212>DNA<213>S436<400>16AAGCGACCTG10<210>17<211>10<212>DNA<213>S437<400>17CATTGGGGAG10<210>18<211>10<212>DNA<213>S438<400>18GGTGAGGTCA10<210>19<211>10<212>DNA<213>S439<秦>19GTCCGTACTG10<210>20<211>10<212>DNA<213>S440<400>20GGTGCTCCGT10权利要求1.一种耐低温大黄鱼选育的方法，其步骤包括(A)优选耐低温大黄鱼选取普通海域成长、体格健康的成年大黄鱼50尾以上，在4℃～8℃的低温条件下进行养殖，养殖时间为5天以上，直到少部分存活；当只有雄性大黄鱼存活或只有雌性大黄鱼存活时，需重新进行本步骤，直到雄性大黄鱼与雌性大黄鱼均有存活；(B)培育耐低温大黄鱼选取能够耐受低温存活的大黄鱼进行人工繁育，采用保温催产的方法得到受精卵，然后对受精卵进行人工孵化，鱼种在固定场所人工养成，得到耐低温大黄鱼F1代；(C)将耐低温大黄鱼F1代作为亲鱼再次进行步骤(A)和步骤(B)，得到耐低温大黄鱼F2代；将耐低温大黄鱼F2代作为亲鱼再次进行步骤(A)和步骤(B)，得到耐低温大黄鱼F3代；依此步骤重复得到耐低温大黄鱼Fn代，n≥3。2.根据权利要求1所述的耐低温大黄鱼选育的方法，其特征在于所述的步骤(A)可分为以下三步(1)先将选取的普通大黄鱼养殖在正常温度状态下，然后采用人工手段对养殖池水进行降温，降温幅度为0.5。C/天2'C/天，直至温度为4°C8'C时止；(2)将大黄鱼养殖在4t:8'C的水温状态下，并且维持水温在同一数值养殖大黄鱼8天12天；(3)采用人工手段对养殖池水进行升温，升温幅度为0.5'C/天2'C/天，至正常养殖池水温度恢复为正常养殖状态时止，将存活的大黄鱼作为步骤(B)对象。3.根据权利要求1或2所述的耐低温大黄鱼选育的方法，其特征在于所述的步骤(A)在选育耐低温大黄鱼时，需要及时去除死亡的大黄鱼，保持养殖水域的清洁。4.根据权利要求1或2所述的耐低温大黄鱼选育的方法，其特征在于所述的步骤(A)的降温方法为在养殖池中加入冰块或干冰。5.根据权利要求1或2所述的耐低温大黄鱼选育的方法，其特征在于所述的步骤(A)中选取的大黄鱼为普通海域人工养殖的大黄鱼，经过步骤(A)的优选，当存活的大黄鱼少于10条时，需重新进行步骤(A)，直到存活的大黄鱼数量大于30条。6.根据权利要求1所述的耐低温大黄鱼选育的方法，其特征在于所述的步骤(B)可分为以下四步(1)将步骤(A)结束后存活的大黄鱼作为亲鱼，控制亲鱼培育水温在2(TC-2rC;然后用促黄体素释放激素LRH-A3对亲鱼进行催产；(2)进行受精卵的人工孵化，收集的受精卵在孵化之前进行分离，即让其在塑料桶中静置十几分钟，上浮卵一般为好卵，沉底的都是次卵，，鱼卵放入孵化桶中孵化，水温控制20.521'C，连续充气，充气量宜大，以呈翻滚状为好，光照控制在5001x之内，要特别注意孵化桶的水质，一般经过2931h孵化，鱼卵破膜孵出仔鱼，一旦仔鱼孵出，应及时通过虹吸把仔鱼移送到育苗池进行培育；(3)仔鱼培育利用对虾育苗池育苗室进行大黄鱼育苗，单口水泥池规格为3040m2，水池深1.4m，长方形，经漂白粉消毒，加海水至l.2m,育苗用水经砂滤池过滤，再经黑暗沉淀进人预热池，仔鱼培育密度控制在l万2万尾/m3，仔鱼进入培养阶段时，刚开始换水，每日换2次，一般为上午7:00和下午6:00，换水量根据分布密度等具体情况而定，一般前期换水量为1/102/5，后期加大换水量为1/24/5，根据需要测量盐度、氨氮，以换水调节水质，仔鱼培育期间，用1500W的电热棒调控水温，使水温保持在2224'C之间，每天定时测量水温，使水温保持在最佳适温范围内，在出苗前23d逐渐利用自然降温，将水温降至与自然水温相同；盐度为20%。25%。；散气石布设O.20.3个/m2，连续充气，仔鱼培育前期，充气量以水面呈微波为好，随仔鱼发育逐渐增大充气量；仔鱼5日龄开始第一次吸污，以后仔鱼期保持每3d吸污一次，稚鱼期每2d—次，幼鱼期每日一次，仔鱼期培育每隔15d左右翻池一次，饵料投喂仔鱼出膜2日龄时开始投喂轮虫，以后池内轮虫保持一定的密度27日龄，轮虫密度为l3个/mL;710日龄后，改投喂卤虫无节幼体为主，水体中卤虫密度保持在35个/mL，15日龄后，开始改投挠足类，投喂量为l个/mL，25日龄后加投少量鱼糜，用量根据鱼苗的摄食及残饵多少而定；(4)苗种养成采用深水网箱进行大黄鱼的苗种养成，选择水质肥沃，盐度范围为24.834.5;pH为7.858.35;D0在4mg/L以上的海区，选择尾重50g以上的大黄鱼进行网箱养殖，放养密度20尾/m3，每天上午7:00和下午6:00投喂2次，日投喂量占鱼体重的6%8%(以鲜料计算)，加强鱼病和网箱的管理，得到存活的健康的大黄鱼即为耐低温大黄鱼。7.根据权利要求1或2或6所述的耐低温大黄鱼选育的方法，其特征在于:所述的步骤(C)中n的值为3，耐低温大黄鱼F3代在4'C8'C的低温条件下养殖的存活率为70%90%t全文摘要本发明属于海水水产养殖领域，尤其涉及一种耐低温大黄鱼选育及鉴定的方法。本发明主要是解决目前多数大黄鱼不能适应低温养殖的现状，选取自然能耐受低温的大黄鱼个体，通过优选培育，得到耐低温大黄鱼选育方法，同时提供了耐低温大黄鱼的鉴定方法。本发明采用多代选育和培养，并通过观察鉴别与DNA鉴别，得到了一种耐低温大黄鱼。文档编号A01K61/00GK101606502SQ20091009530公开日2009年12月23日申请日期2009年1月5日优先权日2009年1月5日发明者吴常文,常抗美,张建设,黄振远申请人:浙江海洋学院