专利名称：：顺丁烯二酸酐化合物在制备油菜菌核病菌抑菌剂中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及顺丁烯二酸酐类化合物在制备油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotior咖)抑菌剂中的应用。(二)
背景技术：
：油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)是世界范围的主要病害，它可以侵染400多种双子叶植物，给许多国家造成严重的经济损失。国际上虽对油菜菌核病进行了广泛研究，但由于目前在十字花科植物中缺少抗菌核病的基因源，利用传统的育种方法对菌核病抗性的提高，是一个漫长的过程，进展相当缓慢，难以满足生产需求。此外，利用多菌灵等农药防治菌核病虽然取得一定的成效，但是也造成病原菌对药剂的抗性问题日益突出。寻求对环境相容性好，对病原菌具有持久效果的农药显得格外重要。据报道一些顺丁烯二酸酐类化合物具有较高的抗菌除草抗肿瘤等生物活性，但是对防治油菜菌核病的应用及抑制机理方面鲜有报道。因此，研究顺丁烯二酸酐类化合物对油菜菌核病菌的抑菌活性和抑制机理，将此类化合物应用到植物病害的防治上，对解决病原菌对药剂日益突出的抗性问题具有重要的意义。(三)
发明内容本发明目的是提供顺丁烯二酸酐类化合物在制备油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)抑菌剂中的应用。本发明采用的技术方案是顺丁烯二酸酐类化合物在制备油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)抑菌剂中的应用，所述顺丁烯二酸酐类化合物为下列之一2，3-DimethylmaleicanhydrideDiphenylmaleicanhydridebromomaleicanhydride2，3-二甲基马来酸酐联苯基马来酸酐溴代马来酸酐上述化合物均含有下述顺丁烯二酸酐活性结构所述的顺丁烯二酸酐类化合物的抑菌活性受pH影B向，在酸性条件下的抑菌活性比碱性条件下的抑菌活性高，故所述抑菌剂在酸性环境中使用为好。所述顺丁烯二酸酐类化合物的抑制作用机制为抑制油菜菌核病菌的菌丝生长，延迟或抑制菌核的萌发，降低菌核形成的数量。具体的，所述顺丁烯二酸酐类化合物可用于制备抑制油菜菌核病菌在油菜叶片上的侵染的制剂。本发明利用菌丝生长速率法，筛选抗菌核病菌活性较高的顺丁烯二酸酐类化合物。具体如下将顺丁烯二酸酐类化合物配制成一定浓度的药液，研究了活性药物的最佳抑菌PH，开展顺丁烯二酸酐类化合物对菌丝生长抑制实验，对菌核形成影响实验，对菌核萌发影响实验，离体叶片实验等室内毒力测定实验。其中2，3-二甲基马来酸酐用水溶解，并用lmol/L的氢氧化钠调pH至6左右使其完全溶解，其余药品则用丙酮溶解。本发明的有益效果主要体现在本发明从多个角度研究顺丁烯二酸酐类化合物对油菜菌核病菌的抑制机理，强有力的说明了顺丁烯二酸酐类化合物对油菜菌核病菌的抑制作用，对顺丁烯二酸酐类化合物的应用提出了新思路，为防治菌核病提供了新的开发资源，对解决病原菌对药剂日益突出的抗性问题具有重要意义。(四)图1为pH对顺丁烯二酸酐类化合物抑菌活性的影响；其中，(b)为二甲基马来酸酐，(C)为联苯基马来酸酐；图2为溴代马来酸酐抑制油菜菌核病菌侵染叶片；A为对照叶片发病情况，B为经溴代马来酸酐处理的叶片发病情况。(五)具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1:利用菌丝生长速率法，筛选抗菌核病菌活性较高的顺丁烯二酸酐类化合物采用菌丝生长速率法，将顺丁烯二酸酐类化合物配制成不同浓度梯度的供试药液，将5mL药液加到45mL融化的PDA培养基中混合均匀后倒入灭过菌的培养皿中(直径9cm)，每瓶均匀倒入3个培养皿中，配制成所需浓度的带毒培养基。以混入相同体积的无菌水或者丙酮溶剂做对照。用内径为0.6cm的打孔器，在培养3d的菌核病菌落边缘生长旺盛处打孔，取下直径为0.6cm的菌饼，分别接种于每个培养皿中央，有菌丝的一面朝下。每个培养皿接种一块菌饼，每个处理做3个重复，在25t:培养箱中培养2d后，采用十字交叉法测量菌落直径(cm)，按以下公式计算抑菌率，将平均抑制率值进行百分率_概率转换，以概率几率值为横坐标，处理浓度的对数值为纵坐标，求取回归方程，计算半抑制浓度(EC5。)，实验结果见表l。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>表1:顺丁烯二酸酐类化合物对菌丝生长的抑制作用化合物EC50(|ig/mL)MIC(|ig/mL)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注表中结果为三次重复的平均值数据表明，二甲基马来酸酐、联苯基马来酸酐、溴代马来酸酐可以有效地抑制菌丝的生长，半抑制浓度分别为0.25iig/mL，38.9yg/mL，37.65yg/mL，4.0yL/mL，最小抑制浓度分另U为0.5ug/mL，140ug/mL，140ug/mL，10.5uL/mL。实施例2:pH对顺丁烯二酸酐类化合物抑制油菜菌核病菌活性的影响分别在二甲基马来酸酐、联苯基马来酸酐半抑制浓度下(38.9iig/mL，37.65yg/mL)考察pH对其抑菌活性的影响。以不加药的培养基为空白对照，培养基的pH范围为4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0.。每个处理做3个重复，接种后在25"C培养箱中培养2d，采用十字交叉法测量菌落直径，计算抑制率。实验重复三次。实验结果如图l所示。实验结果表明变二甲基马来酸酐在酸性条件下的抑菌效果比较好，最佳pH为5.0。联苯基马来酸酐在酸性条件下pH为5.0时，抑制效果最佳，随着pH上升到7.5时，活性降到最低，但是pH继续上升至9.0时，活性达到最高，其机理有待进一度研究。实施例3:顺丁烯二酸酐类化合物对菌核形成的影响配制一系列含不同浓度顺丁烯二酸酐化合物的培养基2，3-二甲基马来酸酐的终浓度为10yg/mL，30iig/mL，60yg/mL，90yg/mL，120yg/mL。联苯基马来酸酐的终浓度为20iig/mL，40iig/mL，60iig/mL，80iig/mL，100iig/mL，120iig/mL，以不力口药的培养基为对照。接种后在25t:培养箱中培养10d，数每块平板上的菌核数。每个处理9块平板，实验重复3次，结果见表2。表2:含顺丁烯二酸酐化合物对菌核形成的影响化合物浓度和菌核形成数2,3-二甲基马来酸酐浓度(|ig/mL)010306090120<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>*菌核数为九块平板中形成菌核数的平均值实验结果表明顺丁烯二酸酐类化合物可以显著地抑制菌核的形成。2，3-二甲基马来酸酐和联苯基马来酸酐的浓度分别达到60g/mL和120g/mL时，能大大降低菌核形成数。实施例4:顺丁烯二酸酐类化合物对菌核萌发的影响在PDA培养基上接种菌核病菌丝块，在25t:培养箱中培养2周后，收集菌核。将20个菌核分别在25mL浓度为140yg/mL的2，3-二甲基马来酸酐和连苯基马来酸酐溶液中浸泡24h(以浸泡在蒸馏水中的处理为对照)。收集浸泡后的菌核，用灭菌的滤纸吸干表面的液体，然后用O.1%(w/v)的Hg2Cl2处理5min进行表面灭菌，用无菌水清洗3次，每次lmin，分别接种于PDA培养基上，每皿接种4个菌核。分别在25。C黑暗培养后的第2，3，4d记录菌核萌发的情况。实验重复3次。实验结果见表3。表3:顺丁烯二酸酐类化合物对菌核萌发的影响*培养不同时间后萌发的菌核数<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*菌核萌发数为三次重复实验的萌发菌核数的平均值实验结果表明，用140iig/mL的2，3-二甲基马来酸酐和连苯基马来酸酐处理后的菌核在培养96h后萌发率分别为70%和100%。实验结果也说明，顺丁烯二酸酐化合物能抑制或者延迟菌核的萌发。实施例5:溴代马来酸酐对离体叶片感染油菜菌核病的影响选取健康的油菜叶片置于铺有一层吸水纸的瓷盘中，其叶柄部用吸水纸覆盖。再用毛笔蘸取0.5L/mL的溴代马来酸酐药液均匀涂布于叶面，每个处理18片叶片(对照用无菌水涂布叶片)。待叶面自然风干后，在叶面中央接种活化好的新鲜核盘菌菌丝块(直径为6mm)，在瓷盘上盖塑料薄膜保湿。25t:光照处理，4天后开始观查油菜叶片发病情况，并测量病斑直径，实验结果见图2。离体油菜叶片接种实验表明对照的油菜叶片发病率为100%，整个叶片变黄，平均病斑直径为3.64±0.59cm，而经过0.5yL/mL的溴代马来酸酐药液处理的叶片几乎不发病，只有一片叶子发病，病斑直径为0.8cm。说明顺丁烯二酸酐类化合物——溴代马来酸酐可以在油菜叶片上抑制核盘菌菌丝的侵染和扩张。权利要求顺丁烯二酸酐类化合物在制备油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)抑菌剂中的应用，所述顺丁烯二酸酐类化合物为下列之一FDA0000019922110000011.tif2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述抑菌剂适用于酸性环境。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述顺丁烯二酸酐类化合物用于制备抑制油菜菌核病菌在油菜叶片上的侵染的制剂。全文摘要本发明提供了顺丁烯二酸酐类化合物在制备油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)抑菌剂中的应用。其中变构霉素，2，3-二甲基马来酸酐，联苯基马来酸酐和溴代马来酸酐的半抑制浓度分别为0.25μg/mL，38.90μg/mL，37.65μg/mL，4.00μL/mL；最小抑制浓度分别为0.5μg/mL，140.0μg/mL，140.0μg/mL，10.5μL/mL。本发明首次提出顺丁烯二酸酐类化合物对油菜菌核病的抑制作用及抑制机理，为人类研发新一代的抗菌核病药物提供了理论依据。文档编号A01N43/08GK101790981SQ20101012268公开日2010年8月4日申请日期2010年3月11日优先权日2010年3月11日发明者嘉晓勤,朱小惠,沈寅初,范永仙,陈小龙申请人:浙江工业大学