专利名称：：顺丁烯二酸酐类化合物在制备抗灰霉病的杀菌剂中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及顺丁烯二酸酐类化合物在制备抗灰霉病的杀菌剂中的应用(二)
背景技术：
：半知菌亚门葡萄孢属灰葡萄孢(Botrytiscinerea)分生孢子梗直或屈曲，无色，光滑，分枝，分枝末端常明显膨大，形成无色或淡色的瓶状产孢细胞。产孢细胞多芽生，分生孢子椭圆形，单孢，无色或灰色，聚集成堆成灰色，通常产生黑色不规则的微菌核。由灰葡萄孢引起的灰霉病是一种植物病害，灰葡萄孢能在生产期和收获后运输期侵染多种经济作物，包括鲜果类植物草莓、葡萄、苹果、柑橘等；蔬菜类番茄、黄瓜、甘蓝、莴苣等；观赏植物郁金香、秋海棠、天竺葵、菊花等。灰霉病的发生会引起大面积植物死亡，造成严重的经济损失。据现有资料报道，多种以顺丁烯二酸酐结构为核心结构的天然化合物在杀菌、除草方面表现出了很强的生物活性，其中Scytalidin、Heveadride禾口Dihydro印iheveadride具有良好的抗真菌谱，Cornexistin和Hydroxycornexistin已经被开发为高效除草剂。但是目前顺丁烯二酸酐类化合物抗灰霉病的例子很少，研究较多的只有日本开发的Zopfiellin。(三)
发明内容本发明目的是提供顺丁烯二酸酐类化合物在制备抗灰霉病的药物中的应用。本发明采用的技术方案是顺丁烯二酸酐类化合物在制备抗灰霉病的杀菌剂中的应用，所述顺丁烯二酸酐类化合物为下列之一(1)(2)2,3-Dimethylmaleicanhydride("Diphenylmaleicanhydride上述化合物均含有下述顺丁烯二酸酐活性结构3<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>化合物的抗菌活性受pH变化影响，在酸性环境中表现出较高的生物活性，其生物活性在PH4.55.0的条件下达到最高。具体的，所述顺丁烯二酸酐类化合物用于制备抗灰葡萄孢(Botrytiscinerea)引起的灰霉病的制剂。本发明采用菌丝生长速率法测定顺丁烯二酸酐类化合物对灰葡萄孢的半抑制浓度(EC5。)和最小抑制浓度(MIC)，结果显示变构霉素，二甲基马来酸酐和联苯基马来酸酐的生物活性较好。这三种化合物的EC5。分别为14.89iig/mL，23.15yg/mL，66.36yg/mL;MIC分别为125iig/mL，180yg/mL，160yg/mL，这些化合物的生物活性在pH4.5或pH5.0时达到最高。在抑制孢子萌发实验和离体叶片防效试验中，顺丁烯二酸酐类化合物也表现出了对灰霉病较好的防治效果，可以作为防治灰霉病的新型杀菌剂开发。图1为pH变化对变构霉素、二甲基马来酸酐、联苯基马来酸酐生物活性的影响实验结果。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1:顺丁烯二酸酐类化合物对灰霉病病原菌的抑制实验采用菌丝生长速率法测定顺丁烯二酸酐类化合物对灰霉病病原菌菌丝生长的抑制率。将顺丁烯二酸酐类化合物加入PDA培养基，制成不同浓度的含药培养基。将在PDA培养基上预培养的灰霉病菌落边缘打直径6mm的菌块，接于含顺丁烯二酸酐类化合物系列浓度的平板上，以无药平板为对照，每次处理重复3次。2rC恒温培养23d，待对照培养基中灰霉菌菌落长满，用十字交叉法测量各平板菌落生长直径。每次处理设三次重复。菌丝生长抑制率计算公式(长度单位mm)如下菌丝生长抑制率，自SSff—6)厕表1:顺丁烯二酸酐类化合物对灰霉病病原菌的抑制实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>020]<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>实施例2:pH变化对变构霉素、二甲基马来酸酐、联苯基马来酸酐生物活性的影响实验采用菌丝生长速率法测定pH的变化对变构霉素、二甲基马来酸酐、联苯基马来酸酐生物活性的影响。将样品加入PDA培养基，制成不同pH的含药培养基。将在PDA培养基上预培养的灰霉病菌落边缘打直径6mm的菌块，接于不同pH的含药平板上，以对应pH的无药平板为对照，每次处理重复3次。2rC恒温培养23d，待对照培养基中灰霉菌菌落长满，用十字交叉法测量各平板菌落生长直径。每次处理设三次重复。菌丝生长抑制率计算公式(长度单位mm)如下菌丝生长抑制率，自SSff—6)厕结果见图1，可见变构霉素、二甲基马来酸酐、联苯基马来酸酐生物活性在pH4.55.0时为最高。实施例3:变构霉素抑制灰霉病病原菌孢子萌发实验采用孢子萌发法测定变构霉素对灰霉病病原菌孢子萌发的抑制作用。将灰霉病菌接种于PDA培养基，用无菌水洗涤2rC培养14d后的灰霉病菌的孢子，制成孢子悬浮液(浓度控制在106个/mL左右)。用96孔微孔培养板代替凹槽载玻片，每孔吸取孢子悬液100iiL与100iiL供试药液混合使之达到规定浓度，以无菌水为空白对照，每个处理3次重复。2rC下培养12h后光学显微镜下放大IOXIO倍观察孢子萌发数。每个样品随机统计3个视野下萌发与未萌发的灰霉菌分生孢子数量，每次镜检200个孢子并计算分生孢子萌发率(以芽管长度超过饱子直径一半计为萌发)。孢子萌发抑制率计算公式如下孢子萌发抑制率(％)=对照萌发率-处理萌发率、<100%对照萌发率'变构霉素抑制灰葡萄孢孢子萌发实验结果发酵液浓度(吗/mL)萌发率(％)芽管长度空白(无菌水)100++++100100++++15092.38+++20070.04++3002.16+350<1-注+越多，表示芽管越长。实施例4:变构霉素和二甲基马来酸酐对灰霉病的离体叶片防效实验采集叶位一致、大小相近的番茄叶片，用自来水洗净，去离子水淋洗后放置于干净托盘上晾干。变构霉素和二甲基马来酸酐稀释成不同浓度，将晾干的叶片在不同浓度药液中浸泡5min后取出，平铺于培养皿内(内铺浸湿的滤纸片保湿)。将在PDA培养基上预培养的灰霉病菌落边缘打直径4mm的菌块，菌丝面朝下接种于叶片中央，以无药平板为对照，2rC恒温培养箱中培养每次处理重复10个叶片，4d后邻式(长度单位mm)如下对照病斑直径_处理病斑直径病斑直径。离体叶片防效计算公防治效果(％)-100%对照病斑直径表3:变构霉素和二甲基马来酸酐对灰霉病的离体叶片防效实验结果6<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>权利要求顺丁烯二酸酐类化合物在制备抗灰霉病的杀菌剂中的应用，所述顺丁烯二酸酐类化合物为下列之一FDA0000019921720000011.tif2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述杀菌剂适用于酸性环境。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述杀菌剂适用于pH4.55.0的酸性环境。全文摘要本发明提供了顺丁烯二酸酐类化合物在制备抗灰霉病的杀菌剂中的应用。其中变构霉素，二甲基马来酸酐和联苯基马来酸酐的生物活性最高，对灰霉病病原菌灰葡萄孢的EC50分别为14.89μg/mL，23.15μg/mL，66.36μg/mL；MIC分别为125μg/mL，180μg/mL，160μg/mL，这些化合物的生物活性在pH4.5或pH5.0时达到最高。在抑制孢子萌发实验和离体叶片防效试验中，顺丁烯二酸酐类化合物也表现出了对灰霉病较好的防治效果，因此可以作为防治灰霉病的新型杀菌剂开发。文档编号A01N43/90GK101790985SQ201010122309公开日2010年8月4日申请日期2010年3月11日优先权日2010年3月11日发明者刘莎莎,嘉晓勤,沈寅初,范永仙,陈小龙申请人:浙江工业大学