专利名称：一种木霉孢子粉剂及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物活性农药粉剂，具体涉及一种木霉孢子粉剂及其制备方法和应用。
背景技术：
木霉菌隶属于半知菌亚门，丛梗目，从梗孢科，是一类具有重要经济意义的生防益 菌。木霉菌对环境的适应性强、生长速度远比病原真菌快、是土壤中植物病原真菌生存空间 和营养源的有力竞争者。木霉菌能有效地利用植物表面或植物病原真菌侵入点附近低浓度 营养物质迅速占领空间吸收营养使植物病原真菌无法入侵。近年来人为向土壤中引入木霉 菌防治植物病害的研究较为活跃，例如用哈茨木霉、哈氏木霉和绿色木霉防治洋葱白腐病、 棉花和黄瓜黄萎病、人参根腐病、茉莉白绢病、西洋参立枯病及多种作物的猝倒病和疫病， 均取得较为理想的防治效果。不同种类木霉菌有不同的植物病害防治功效，但目前尚未有 将木霉菌用于防治香蕉枯萎病的技术记载。木霉菌经固体发酵后可产生大量的孢子，人们通常将大量的木霉菌孢子制成木霉 孢子粉剂以便于对其进行贮藏、运输和施用。目前常用的木霉孢子粉剂制备方法是用水将 木霉孢子从固体培养基上洗脱下来制成孢子悬浮液，在孢子悬浮液中加入适量吸水剂后将 其在室内晾干或用低于50°C的温度风干制成木霉孢子粉剂。但这种制备方法加工时间长、 效率低、体积大且晾干或风干后的木霉孢子粉剂中木霉孢子的密度较低，不便于贮藏、运输 和施用。喷雾干燥技术是指采用雾化法将原料液分散为雾滴并用热气体干燥雾滴而获得干 粉产品的一种干燥方法。由于成本低、易于推广、采用的设备简单且有利于干粉产品的大 规模连续生产，喷雾干燥技术在食品、化工、医药、环保等领域的运用颇为广泛。鉴于喷雾干 燥技术的诸多优点，人们曾试图将喷雾干燥技术应用到微生物活性农药制备领域，借以解 决微生物粉剂难以在保持高活性的前提下快速制备的难题。但喷雾干燥技术的温度参数通 常在140°C以上，在此高温条件下微生物容易失去活性。如木霉孢子在超过45°C的温度条 件下容易失活，孢子悬浮液中的木霉孢子通过高温高压喷嘴喷出后基本丧失萌发能力。因 为人们尚未找到如何在干燥喷雾技术的高温条件下保持微生物活性的解决方案，到目前为 止喷雾干燥技术在微生物活性农药制备领域尚未被合理应用。
发明内容
本发明目的在于根据现有木霉孢子及其制备方法中存在的不足，将喷雾干燥技术 合理用于微生物活性农药制备，提供一种粉剂密度大，萌发率高，干燥效率高的木霉孢子粉 剂。本发明另一目的在于提供上述木霉孢子粉剂的制备方法。本发明还有一个目的在于提供上述木霉孢子粉剂的应用。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现一种木霉孢子粉剂，包含木霉孢子粉和助干剂，其中，木霉孢子粉是棘孢木霉菌株
3T1 (Trichoderma asperellum T1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为CGMCCNO :3531，保藏日期为2009年12月17日)的孢子粉，其rDNA ITS区片段 序列如SEQ ID NO 1所示。本发明木霉孢子粉是具有萌发活性的孢子粉，其rDNA ITS区片段序列可以通过 PCR扩增得到，扩增引物序列如SEQ ID NO :2 3所示，PCR反应体系为ddH20 14. 8 μ L， 10XPCR buffer (with Mg2+) 2.5 μ L，dNTPs(10mM each) 0. 5 μ L 上游引物(5 μ Μ) 3.0 μ L，下 游引物(5 μ Μ) 3. 0 μ L，模板 DNA 1. 0μ L, Taq 酶 0.2 μ L。PCR 反应条件为(1) 94°C，5min， 热变性；(2)94°C，4k，热变性；(3)55°C，妨s，退火；(4)72°C，4k，延伸；(5) 72°C，lOmin，延 伸；其中(2)、⑶、⑷是循环。扩增出的序列如SEQ ID NO 1所示。上述木霉孢子粉剂中，所述助干剂为β-环糊精、马铃薯淀粉、可溶性淀粉中的一 种或几种的混合物。本发明木霉孢子粉剂的制备方法包括如下步骤(1)将棘孢木霉菌株T1植于PDA培养基上使其复苏，再采用酵母膏蔗糖培养基进 行菌种继代培养，待长出直径为5 7mm的深绿色菌落后，将菌落接种，在酵母膏蔗糖培养 基和麸皮木屑培养物中进行扩大培养，直至长出白色菌丝或绿色孢子；(2)将白色菌丝或绿色孢子制成孢子悬浮液，过滤沉淀为浓缩孢子液；(3)向浓缩孢子液中添加助干剂，每升孢子液中加入助干剂的质量为50g，一边搅 拌一边喷雾干燥，即得木霉孢子粉剂。上述制备方法中，所述酵母膏蔗糖培养基的最佳配方为酵母膏15g，蔗糖20g， KH2PO4Ig,麦芽膏15g，硫酸钠2g，氯化钾0. 5g，维生素BO. 5mg,维生素CO. 5mg,七水合硫酸 镁0. 05g，硫酸铁0. Olg,琼脂20g,水IL0上述酵母膏蔗糖培养基优选高温灭菌过的培养基，灭菌温度为121°C，灭菌时间为 30mino所述菌种继代培养的温度优选为30°C，湿度为70 85%，培养时间为48 72h。所述扩大培养的温度优选为30°C，湿度为70 85%，培养时间为5 7d。所述麸皮木屑培养物是麸皮、木屑、蔗糖、维生素B和水的混合物，其中，麸皮、木 屑、蔗糖三者的质量与水的体积比为2 1 0.02，维生素B用量为每千克麸皮木屑培养物 中加入0. 5mg。步骤C3)所述喷雾干燥是将浓缩孢子液添加助干剂后在磁力搅拌器上一边搅拌 一边进行喷雾干燥，在90 130°C范围内设定进风温度、出风温度在41 55°C，控制进料 量为1 20wt %。作为一种优选方案，喷雾干燥过程中进风温度为110°C，出风温度为53°C， 进料量为IOwt %。由于木霉菌对环境的适应性强且生长速度远比病原真菌快，能对病原真菌产生营 养或空间的竞争，能有效利用植物表面的病原真菌侵入点附近的低浓度营养物质迅速生长 占领空间消耗掉营养物质，从而抑制了病原真菌的生长和对寄主植物的入侵，达到对植物 病害的防治效果。本发明木霉孢子粉剂作为微生物活性农药，不仅能有效防治香蕉枯萎病， 还因为棘孢木霉菌株T1具有广谱性拮抗能力，能拮抗多种病原真菌，防治其他多种植物病 害。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果(1)本发明采用棘孢木霉菌株T1作为生产菌株，其孢子粉生存能力强，适应性广， 具有广谱性拮抗能力，除了能对香蕉枯萎病起到有效防治，还能够拮抗多种病原真菌，尤其 对土传真菌有显著的拮抗效果；(2)本发明将喷雾干燥技术合理用于微生物活性农药木霉孢子粉剂的制备中，解 决了干燥喷雾技术的高温条件下难以保持微生物活性的技术难题，使得微生物粉剂可以在 保持高活性的前提下快速制备，制备工艺简单易行，采用的设备简单，有助于降低干粉产 品的制备成本，易于推广，有利于干粉产品的大规模连续生产，节省了孢子粉剂的制备时 间；(3)本发明木霉孢子粉剂木霉孢子密度大，萌发率高，干燥效率高，贮藏空间小，方 便人们对其进行贮藏、运输和使用。
具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例11.菌株的复苏和扩大培养(1)将冷藏的棘孢木霉菌株Tl (Trichoderma asperellum T1)植于PDA培养基上 使其复苏； (2)采用酵母膏蔗糖培养基，并设定培养温度为30°C、湿度为70 85%，对经过步 骤(1)复苏后的菌株采用平板进行菌种继代培养48 72h，直至长出直径约为5 7mm的 深绿色菌落；(3)将由步骤( 平板继代培养成的菌落用无菌水洗下，接种于装有经高温灭菌 的由麸皮、木屑、蔗糖、维生素B和水组成的培养料的茄形瓶中进行孢子扩大培养，设定培 养温度为30°C、湿度为70 85%，培养时间为5 7d,每天翻动拍打茄形瓶，至培养物上长 出白色菌丝并在其上长出绿色孢子。2.分离洗涤用无菌水将茄形瓶中的菌丝和孢子洗下制成孢子悬浮液，再将孢子悬浮液经过滤 处理后沉淀为浓缩孢子液，然后将浓缩孢子液装瓶在4 10°C的温度条件下贮藏。3.喷雾干燥向浓缩孢子液中添加助干剂后在磁力搅拌器上一边搅拌一边进行喷雾干燥，设定 干燥器进风温度为110°c、出风温度为53°C，进料量为IOwt%。其中酵母膏蔗糖培养基的主要配方酵母膏15g，蔗糖20g，KH2PO4 lg，麦芽膏 15g，硫酸钠2g，氯化钾0. 5g，维生素BO. 5mg,维生素CO. 5mg,七水合硫酸镁0. 05g,硫酸铁 0. Olg，琼脂20g，水1000ml。麸皮木屑培养料的每瓶装瓶量为15g，每瓶加水量5ml，其中麸 皮、木屑、蔗糖干重比为2 1 0.02，维生素B用量为每千克麸皮木屑培养物中含0.5mg。 助干剂为环糊精，含量50g/L孢子悬浮液。用于酵母膏蔗糖培养基和麸皮木屑培养物 灭菌的温度为121°C，灭菌时间为30min。实施例2
以下进一步说明进风温度、进料量、助干剂类型、助干剂含量等参数的变化对木霉 孢子粉剂制备的影响。以萌发率为指标对喷雾干燥的进风温度和进料量做单因素分析，制备过程中变化 进风温度、进料量测得不同进风温度、进料量对所制备孢子粉的影响，从而对比并选择利 于保证孢子高萌发率、干燥效果好的进风温度和进料量范围。在进料量为5wt%时，设定 9(rc，ioo°c，ii(rc、i2(rc和i3o°c等五个进风温度，测定各温度所制备的孢子粉的萌发率 并记录干燥效果；在进风温度为120°c时，设定1衬％、5衬％、10衬％、15衬％和20wt%等五 个进料量，测定各进料量所制备的孢子粉的萌发率并记录干燥效果；测得结果如表1、2 表1进风温度对萌发率和干燥效果的影响
权利要求
1.一种木霉孢子粉剂，其特征在于包含木霉孢子粉和助干剂，其中，木霉孢子粉是棘孢 木霉菌株T1 (Trichoderma asperellum T1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心，保藏号为CGMCC NO 3531)的孢子粉，其rDNA ITS区片段序列如SEQ ID N0:1所示。
2.根据权利要求1所述的木霉孢子粉剂，其特征在于所述助干剂为环糊精、马铃薯 淀粉、可溶性淀粉中的一种或几种的混合物。
3.权利要求1或2所述木霉孢子粉剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)将棘孢木霉菌株T1植于PDA培养基上使其复苏，再采用酵母膏蔗糖培养基进行菌 种继代培养，待长出直径为5 7mm的深绿色菌落后，将菌落接种，在酵母膏蔗糖培养基和 麸皮木屑培养物中进行扩大培养，直至长出白色菌丝或绿色孢子；(2)将白色菌丝或绿色孢子制成孢子悬浮液，过滤沉淀为浓缩孢子液；(3)向浓缩孢子液中添加助干剂，每升孢子液中加入助干剂的质量为50g，一边搅拌一 边喷雾干燥，即得木霉孢子粉剂。
4.根据权利要求3所述木霉孢子粉剂的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述酵母膏 蔗糖培养基的配方为酵母膏15g，蔗糖20g，KH2PO4Ig,麦芽膏15g，硫酸钠2g，氯化钾0. 5g， 维生素BO. 5mg，维生素CO. 5mg，七水合硫酸镁0. 05g，硫酸铁0. Olg，琼脂20g，水IL0
5.根据权利要求4所述木霉孢子粉剂的制备方法，其特征在于所述酵母膏蔗糖培养基 为高温灭菌过的培养基，灭菌温度为121°C，灭菌时间为30min。
6.根据权利要求3所述木霉孢子粉剂的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述菌种 继代培养的温度为30°C，湿度为70 85%，培养时间为48 72h ；所述扩大培养的温度为 30°C，湿度为70 85%，培养时间为5 7d。
7.根据权利要求3所述木霉孢子粉剂的制备方法，其特征在于所述麸皮木屑培养物是 麸皮、木屑、蔗糖、维生素B和水的混合物，其中，麸皮、木屑、蔗糖三者的质量与水的体积比 为2 1 0.02，维生素B用量为每千克麸皮木屑培养物中加入0.5mg。
8.根据权利要求3所述木霉孢子粉剂的制备方法，其特征在于步骤C3)所述喷雾干燥 的进风温度为110°C，出风温度为53°C，进料量为IOwt%。
9.权利要求1或2所述木霉孢子粉剂的应用，其特征在于所述木霉孢子粉剂用于拮抗 病原真菌。
10.根据权利要求1或2所述木霉孢子粉剂的应用，其特征在于所述木霉孢子粉剂用于 防治香蕉枯萎病。
全文摘要
本发明公开了一种木霉孢子粉剂及其制备方法和应用。本发明木霉孢子粉剂包含木霉孢子粉和助干剂，其中，木霉孢子粉是棘孢木霉菌株T1(Trichodermaasperellum T1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO3531)的孢子粉，其rDNA ITS区片段序列如SEQ ID NO1所示，所述助干剂为β-环糊精、马铃薯淀粉、可溶性淀粉中的一种或几种的混合物。本发明木霉孢子粉剂可以对香蕉枯萎病起到有效防治的效果，还可以拮抗多种病原真菌，尤其对土传真菌有显著的拮抗效果。本发明制备方法节省了木霉孢子粉剂的制备时间，得到的木霉孢子粉剂密度大、萌发率高，干燥效率高，便于贮藏、运输和使用。
文档编号A01N25/12GK102067885SQ20101013904
公开日2011年5月25日 申请日期2010年3月31日 优先权日2010年3月31日
发明者周俐, 张颂声, 方羽生, 李小妮, 蒋刚彪, 詹玉海, 赵瑾, 钟平生, 高永峰 申请人:华南农业大学, 广东省植物保护总站, 惠州市南天生物科技有限公司