专利名称：一种高纯度孢子粉生产工艺及所用的立式多层产孢箱的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基于立式多层产孢箱的高纯度孢子粉生产工艺。
背景技术：
研究开发以有效侵染体为活性成份的微生物制剂来控制作物害虫，昆虫病原真菌是可利用的重要生防真菌(fungal biocontrol agents)，因为只有真菌能够在自然条件下通过体壁接触感染并杀死害虫，可对付不同类型的农林害虫。国内外目前重点研究和开发应用的丝孢类杀虫菌种主要集中在白僵菌、绿僵菌及拟青霉等少数种类。根据现有研究报道，杀虫真菌的分生孢子(有效侵染体)可附着到虫体表面，在适宜条件下萌发并产生芽管，穿透寄主体壁进入血腔，继而利用寄主的营养在血腔中繁殖，当血腔中充满菌丝体时寄主死亡变僵，若遇适合的环境条件菌丝便从体壁长出并形成产孢结构和产生分生孢子，开始新的侵染。以此种方式产生的分生孢子是气生分生孢子，是对昆虫寄主最有效的自然侵染体。在真菌杀虫剂的研究开发中，气生分生孢子粉(以下简称孢子粉)是配制孢子油剂、孢子悬乳剂及孢子可湿性粉剂等各类孢子制剂的有效成份，其纯度和质量直接关系到孢子制剂的质量、货架寿命及田间应用效果。
孢子粉生产一般采用两相发酵工艺，即液相发酵生产的菌丝液作为接种体，再转入固体基质上发酵产孢(即固相发酵)，最后将孢子与固体基质分离并以适当方式收集起来，便获得孢子粉。基于两相发酵法的孢子粉生产过程包含液相发酵、固相发酵和收孢三个主要技术环节。液相发酵是十分成熟的非专利技术，相对简单。固相发酵产孢则是整个生产过程最为重要的环节，也是一种生防真菌制剂能否产业化的关键。国内外的技术研发现状表明，丝孢类生防真菌孢子粉的两相发酵法生产工艺在原理上是很成熟的。对于特定的菌种菌株，主要技术关键在于因地制宜地筛选采用廉价易得的农副产品作为两相发酵的营养基质，把生产成本降下来，由此形成了国内外现有的固相发酵产孢方法，一般采用室内开放式简易支架结构的分层培养，生产线占地面积大，规模化生产中易发生杂菌污染，生产过程中的湿度控制较为困难，导致生产周期较长且难以控制。因此，缺乏固相发酵产孢的技术装备是生防真菌孢子粉生产效率低、成本高的主要原因，也是制约生防真菌制剂产业化的关键因素。而现有的固相发酵罐或相关设备一般是为酵母及曲种生产而设计的全封闭金属结构，不透光，不能用于以生产气生分生孢子粉为目的的生防真菌固相产孢发酵。
发明内容
针对现有技术中存在的不足之处，本发明提供一种工艺流程简单、能杜绝杂菌污染、不污染环境、效益高的高纯度孢子粉生产工艺及所使用的立式多层产孢箱。
本发明为达到以上目的，是通过这样的技术方案来实现的提供一种立式多层产孢箱，包括透明的箱体，箱体设有可开启的箱门；在箱体的内腔设有至少二个物料盘，箱体上还分别设有贯通箱体的至少一个进湿孔和至少一个散湿孔。
作为本发明的立式多层产孢箱的一种改进在箱体内腔设置支撑架，物料盘与支撑架相连。
作为本发明的立式多层产孢箱的进一步改进物料盘与支撑架活动相连。
作为本发明的立式多层产孢箱的进一步改进物料盘为底部是金属筛网、顶部无盖的物料盘。
作为本发明的立式多层产孢箱的进一步改进在箱体的底部四角均设置可承重的万向轮。
作为本发明的立式多层产孢箱的进一步改进物料盘之间间距相等。
本发明还提供了一种使用上述立式多层产孢箱的高纯度孢子粉生产工艺，包括液相发酵步骤，还包括以下步骤1)选用稻米浸泡后经蒸汽灭菌、并熟化至5～6成熟，冷却后作为发酵基质；2)在上述发酵基质中按8～15％的比例(v/w)混入上述液相发酵步骤所得的菌丝液，拌匀即成接种物料；3)将上述接种物料装入物料盘，使接种物料在箱体的内腔进行封闭式发酵产孢；由净水雾化装置通过进湿孔向箱体的内腔连续缓慢加湿，保持箱体内相对湿度≥95％、温度为15～30℃，进行发酵反应72～96小时；4)停止加湿，使箱体保持密封状态，控制箱体内的温度为15～30℃，继续发酵反应72～120小时，得发酵物料；5)将上述发酵物料进行风干处理，即可收获孢子粉。
作为本发明的高纯度孢子粉生产工艺的一种改进步骤3)将接种物料均匀平摊在物料盘上，使得接种物料的厚度为1.5～2.5cm。
作为本发明的高纯度孢子粉生产工艺的进一步改进步骤5)的风干处理为打开箱门，使发酵物料在25～30℃的温度下自然散湿24～48小时；或将发酵物料转入专用风干设备，在30～35℃下风干12～24小时。
采用本发明的立式多层产孢箱所进行的高纯度孢子粉生产工艺，具有如下优点1.本发明的立式多层产孢箱，是为生防真菌高纯度孢子粉的固相发酵生产而专门设计的，箱体透光的设计可使箱内发酵物料有效利用自然光而产孢，并方便生产检查及监控，各层物料盘的设计既提供发酵物料的支撑，又使箱体内成为一个连续整体，可保证箱内湿度尽可能均匀。根据“固体颗粒越小表面积越大”的物理学原理和菌体产孢对氧气及湿度的要求，采用熟化度恰到好处的稻米作为固相发酵物料，既可保证发酵过程中适度的通透性，又保证了足够大的固相产孢面积，辅以净水雾化供湿，即可维持固相产孢发酵所需的高湿条件。这是采用容积有限的多层产孢箱能够最大限度生产气生分生孢子粉的基本生物学和物理学原理，也是本发明最重要的技术特色，因而适用于丝孢类生防真菌孢子粉的规模化生产。
2.本发明的高纯度孢子粉生产工艺，实现了固相发酵产孢装备化、工艺流程简化、生产周期可控及杂菌污染杜绝固相产孢发酵采用立式多层产孢箱，实现了这一种重要生产环节的装备化，大大简化了工艺流程，生产周期可控制在7天左右，箱体全封闭的产孢发酵可杜绝杂菌污染。
3.本发明的高纯度孢子粉生产工艺，生产过程无废水废气产生在整个生产过程中，液相发相的菌液全部按比例拌入适度熟化的米粒中，无任何废液产生，更无废气产生，更加环保。
4.本发明的立式多层产孢箱，生产线占地面积小、投资省、管理方便立式多层产孢箱是有效利用空间的固相发酵装置，日处理一吨稻米物料的生产线所需车间面积不超过200平方米，可年产保证用菌100万亩次的高纯度孢子粉10吨，具有投资省、用人少、效率高、管理方便等特点。
5.原料易得、成本低、能耗少，效益高基于立式多层产孢箱，采用稻米作为主要原料生产生防真菌孢子粉，原料来源广，生产成本低，并为低值稻米的合理利用开辟了一条新途径。采用常规空调器控制发酵环境温度，空调耗电是产孢发酵期间的唯一能耗，车间内安放推荐尺寸的产孢箱(0.6m×0.6m×2.0m，25层/箱)，每只占地面积仅0.36m2，加上必要的操作空间，每只产孢箱平均不超过1m2，日处理1吨大米的连续产孢发酵生产车间总面积不超过200平方米，总能耗就等于空调用电。每公斤大米生产的球孢白僵菌孢子粉可满足0.235公顷或3.52亩作物用菌一次，日处理1吨大米的生产线每天生产的孢子粉可满足235公顷作物用菌一次。
图1是本发明的立式多层产孢箱的立体结构示意图。
具体实施例方式
参照上述附图，对本发明的具体实施方式
进行详细说明。图1给出了一种立式多层产孢箱，由防锈金属管搭建而成一个长方体形的外壁支架，钢化玻璃面板设置在外壁支架的顶部及四壁，外壁支架的底部设置普通的金属板，从而构成一个密封的透明的箱体1。在箱体1的正前方的侧面上设有可开启的箱门7。在箱体1的左、右侧面的上端部各挖有一个贯通箱体1的进湿孔2，即进湿孔2的一端连通箱体1的内腔、另一端连通外界环境。在箱体1的左、右侧面的下端部各挖有两个贯通箱体1的散湿孔5，即散湿孔5的一端连通箱体1的内腔、另一端连通外界环境，用来散湿。在箱体1的内腔设置防锈金属管制成的长方体形的支撑架3，在箱体1的内腔设有至少二个物料盘4，这些物料盘4从下到上相互平行设置、且物料盘4相互之间间距相等。为了使箱体1内湿度控制尽可能均匀，物料盘4是底部采用金属筛网、顶部无盖的一种物料盘，这样可使箱体1的内腔上下贯通为一个体系。为了方便装料，这些物料盘4均与支撑架3可相互滑动的连接。为了方便整个箱体1的移动，在箱体1底部四角各设置1个可承重的万向轮6。
依靠上述立式多层产孢箱，可生产一种高纯度孢子粉，孢子粉的生产工艺步骤如下1)将菌种进行液相发酵(此步骤为现有技术)，获得菌丝液。
2)选用低值稻米浸泡后经蒸汽灭菌并熟化至5～6成熟，冷却后作为发酵基质。
3)在上述发酵基质中按8～15％的比例(v/w)混入所述液相发酵步骤所得的菌丝液，拌匀即成接种物料。
4)打开箱门7，将接种物料均匀平滩在物料盘4上，使得接种物料在物料盘4上的厚度为1.5～2.5cm。然后关闭箱门7，使得接种物料在箱体1内进行封闭式发酵产孢。此时，由外接的净水雾化装置通过加湿孔2向箱体1的内腔连续缓慢加湿，保持箱体1内相对湿度≥95％，环境温度控制在15～30℃(通过外界的空调来控制)，接种物料在箱体1内发酵反应72～96小时。
5)然后停止加湿，使箱体1保持密封状态，控制箱体1内的温度为15～30℃，继续发酵反应72～120小时，得发酵物料；6)将上述发酵物料进行风干处理，即可收获孢子粉。风干处理可采用以下两种方法①打开箱门7使发酵物料在25～30℃下自然散湿24～48小时；②将发酵物料转入专用风干设备，在30～35℃下风干12～24小时。
本发明的立式多层产孢箱内设25个物料盘4，生产球孢白僵菌SG8702的高纯度孢子粉的中试生产分别在杭州冬季(2005年1月中旬，中试I)、春季(2005年2月下旬，中试II)和初夏(2005年5月上中旬，中试III)共进行三箱次，每箱次装米料50公斤。以萨氏培养液生产的菌丝种子液按10％的比例(v/w)与熟化至5～6成熟的稻米混合后制成接种物料装箱，每盘装接种物料2公斤(按干米计)，环境温度通过室内空调控制在25℃左右，产孢发酵的前3～4天通过净水雾化装置向箱体1内连续缓慢供湿，后3天停止供湿但始终维持箱门7闭合保湿，直至第6或7天产孢结束时才开门散湿。每次中试期间，在箱体1内上、中、下三个部位各安置温湿度自动记录仪一只，每小时记录箱内不同部位的温湿度，三次中试的产孢发酵期间温湿度控制均达到设计要求(表一)，尤其通常较难控制的发酵湿度得到很好的控制，一般发酵开始后2～3小时内即可通过水雾供湿使箱体1内相对湿度达到或接近饱和水平，并维持稳定至供湿停止。
表一立式多层产孢箱三次中试生产的温湿度控制结果
由于不同季节中试的温湿度控制均达到设计要求，三次中试的实际产孢发酵时间均为6～7天。发酵好的物料经1～2天风干后，用MH-1型收孢机(英国ACIS公司生产)收获孢子粉，主要产量及质量指标列于表二。三次中试生产的孢子粉含孢量都很高，平均达1710亿/克(1390～1870亿/克)，平均活孢率达93.4％(92.1％～94.1％)，绝对产孢量为2.36万亿/公斤米(1.81～2.73万亿/公斤米)。收孢机收获的孢子粉平均含水量为11.1％(9.9％～12.0％)，再经数小时常温真空抽干，即可使孢子粉的含水量降至5％左右，便可直接用于配制高质量孢子制剂(油剂、悬乳剂、可湿剂、饵剂等)并有利于延长贮存期。
表二 立式多层产孢箱三次中试生产的孢子粉产量及质量指标
三次中试的副产品包括较粗的菌丝粉和残余米。菌丝粉不能用于孢子制剂的配制(会堵喷雾器喷头)，但可制作为非喷施的菌剂用于土壤中防治地下害虫。收孢机收粉后的残余米仍保持米粒的基本形状。在连续生产过程中，每次收粉后的残余米可与新鲜米搭配作为下一次发酵的物料，如此循环利用，可进一步降低生产成本。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.一种立式多层产孢箱，其特征是包括透明的箱体(1)，所述箱体(1)设有可开启的箱门(7)；在所述箱体(1)的内腔设有至少二个物料盘(4)，所述箱体(1)上还分别设有贯通箱体(1)的至少一个进湿孔(2)和至少一个散湿孔(5)。
2.根据权利要求1所述的立式多层产孢箱，其特征是在所述箱体(1)内腔设置支撑架(3)，所述物料盘(4)与支撑架(3)相连。
3.根据权利要求2所述的立式多层产孢箱，其特征是所述物料盘(4)与支撑架(3)活动相连。
4.根据权利要求2或3所述的立式多层产孢箱，其特征是所述物料盘(4)为底部是金属筛网、顶部无盖的物料盘。
5.根据权利要求4所述的立式多层产孢箱，其特征是在所述箱体(1)的底部四角均设置可承重的万向轮(6)。
6.根据权利要求5所述的立式多层产孢箱，其特征是所述物料盘(4)之间间距相等。
7.一种使用权利要求1～6的立式多层产孢箱的高纯度孢子粉生产工艺，包括液相发酵步骤，其特征是还包括以下步骤1)选用稻米浸泡后经蒸汽灭菌、并熟化至5～6成熟，冷却后作为发酵基质；2)在上述发酵基质中按8～15％的比例(v/w)混入所述液相发酵步骤所得的菌丝液，拌匀即成接种物料；3)将上述接种物料装入物料盘(4)，使接种物料在箱体(1)的内腔进行封闭式发酵产孢；由净水雾化装置通过进湿孔(2)向箱体(1)的内腔连续缓慢加湿，保持箱体(1)内相对湿度≥95％、温度为15～30℃，进行发酵反应72～96小时；4)停止加湿，使箱体(1)保持密封状态，控制箱体(1)内的温度为15～30℃，继续发酵反应72～120小时，得发酵物料；5)将上述发酵物料进行风干处理，即可收获孢子粉。
8.根据权利要求7所述的高纯度孢子粉生产工艺，其特征是所述步骤3)将接种物料均匀平摊在物料盘(4)上，使得接种物料的厚度为1.5～2.5cm。
9.根据权利要求7或8所述的高纯度孢子粉生产工艺，其特征是所述步骤5)的风干处理为打开箱门(7)，使发酵物料在25～30℃的温度下自然散湿24～48小时；或将发酵物料转入专用风干设备，在30～35℃下风干12～24小时。
全文摘要
本发明公开了一种立式多层产孢箱，包括透明的箱体(1)，箱体(1)设有可开启的箱门(7)；在箱体(1)的内腔设有至少二个物料盘(4)，箱体(1)上还分别设有贯通箱体(1)的至少一个进湿孔(2)和至少一个散湿孔(5)。本发明还公开了使用上述立式多层产孢箱的一种高纯度孢子粉生产工艺，包括液相发酵、制作发酵基质、制作接种物料、二阶段式发酵产孢、风干处理步骤。本发明的立式多层产孢箱，结构简单；本发明的高纯度孢子粉生产工艺，工艺流程简单、能杜绝杂菌污染、不污染环境、能高效益生产高纯度的孢子粉。
文档编号C12M3/00GK1710059SQ200510050499
公开日2005年12月21日 申请日期2005年6月28日 优先权日2005年6月28日
发明者冯明光, 叶素丹, 应盛华, 陈春 申请人:浙江大学