专利名称：肉孢子虫孢子囊和卵囊分子的诊断方法
技术领域：
本发明属于寄生虫病的诊断，特别涉及运用基因诊断畜禽和人体的球虫与球虫病方法。
背景技术：
以下内容中术语定义卵囊肉孢子虫从粪便中检出的阶段。一个卵囊含有俩孢子囊。
孢子囊成熟的孢子囊内含有4个子孢子。
包囊肉孢子虫寄生于肌肉中，呈梭状，发育成熟的包囊内含有缓殖子。
肉孢子虫属的寄生虫是专性细胞内寄生原虫，其生活史为顶复门虫体典型的生活史，包括裂体生殖、配子生殖和孢子生殖。肉孢子虫是专性异宿主性寄生虫，即要分别在中间和终末宿主中发育，才得以完成其生活史，肉孢子虫广泛寄生于鱼类、爬行类、鸟类和哺乳类。由于许多种肉孢子虫寄生在猫、犬、家畜家禽和人体，引起肉孢子虫病。家畜及草食性动物一般做为肉孢子虫的中间宿主，中间宿主吞食了被孢子囊污染的食物或水而受到感染。无性生殖通常在草食性动物或杂食性动物中间宿主体内完成。无性生殖在动物毛细血管内皮和上皮细胞内进行一代至三代的裂体增殖。最后的一代裂殖体在横纹肌、中枢神经系统以及心脏的浦肯氏纤维和肌束中形成包囊。肉孢子虫包囊的大小和形态各异，取决于虫种。而有性生殖只在肉食性动物，通常为猫、犬和灵长类动物，也包括人体内完成。作为终末宿主的肉食动物捕食或吞食到含有肉孢子虫包囊的肌肉组织和神经组织而被感染，包囊在胃和小肠被消化，释出缓殖子，缓殖子积极活动，侵入小肠粘膜，发育为大雌、小雄配子母细胞，进而发育为大、小配子。受精后产生壁包裹合子形成卵囊，卵囊在小肠固有层进行孢子生殖，孢子生殖完成的孢子化卵囊内含有两个孢子囊，每个孢子囊内又含有4个子孢子。孢子化卵囊壁小于1微米，常易破裂，于是单个游离的孢子囊释放入肠腔，随终末宿主粪便排到外界。从终末宿主吞食包囊后到卵囊和孢子囊首次出现在粪便中的时间一般需7-14天。
肉孢子虫的分类根据主要包括包囊，特别是包囊壁上突起的光镜和电镜结构；同工酶；终末宿主和中间宿主的特异性，特别是后者，一般认为肉孢子虫的中间宿主有很严格的特异性，而从终末宿主排出的孢子囊和卵囊形态在虫种鉴别上没有意义，因为包囊采集方便，可以直接用于虫种鉴定，因此，用分子手段研究肉孢子虫，均以包囊为材料，而卵囊和孢子囊的收集困难，难于鉴定虫种，所以卵囊和孢子囊的分子标记研究一直滞后于包囊，目前几乎所有的研究手段都不能够从卵囊和孢子囊形态鉴别虫种，尤其比较难于直接从粪便中检出卵囊和孢子囊并鉴别虫种。但是，在流行病学调查中需要判断何种肉孢子虫感染了终末宿主，而2004年，在Elsheikha HM，Murphy AJ，Mansfield LS.2004.Prevalence of Sarcocystisspecies sporocysts in Northern Virginia opossums(Didelphis virginiana).Parasitol.Res.93(5)427-431.报导了取自剖杀负鼠的小肠上皮粘膜的刮拭物的孢子囊和卵囊，其孢子囊和卵囊的数量大，易于研究。十分明显的是，该方法不能运用于人体感染性疾病的临床诊断。2006年，Elsheikha HM，Murphy AJ，Trembley SJ，Mansfield LS，Ghanam MS，el-GarhyMF.2006 Molecular and microscopic techniques for detection of Sarcocystis neuronasporocysts in fecal samples.J Egypt Soc Parasitol.Aug；36(2)713-25.该研究集中于一个虫种，从实验感染的动物粪便里收集到的卵囊和孢子囊，并进行PCR扩增，实验感染动物往往感染量大，可以获得大量的材料，然而，人体或者动物自然感染后在粪便中的样本数量极为稀少，且该报导未涉及虫种鉴定。
发明内容
本发明目的是改变在分子手段研究肉孢子虫中均以包囊为材料的一般方法，针对内孢子虫卵囊和孢子囊阶段在形态上相似，体积微小，从粪便排出的数量极为稀少，虫种鉴别十分困难，而此阶段的鉴定又极具重要价值和急需的现状，提供灵敏度和特异性高、临床检测方便、从分子形态鉴别肉孢子虫孢子囊和卵囊虫种的基因诊断方法。
本发明通过以下步骤和内容实现1)取少量的粪便加入适量37％ZnSO4硫酸锌漂浮液离心管中，离心后静置；2)用吸管吸取或用接种环沾取离心管中最上层的浮液数滴移在载玻片上，以)100倍的显微镜检查，用清洁纸片从玻片或者离心管中粘起孢子囊和卵囊放入另一只离心管低温保存；3)包含具有表1为引物，PCR扩增所覆盖的肉孢子虫孢子囊和卵囊的18SrRNA基因区段1500-2000bp核苷酸或其任何一部份核苷酸片段，或作为引物用于PCR扩增，或作为探针用于杂交反应，或制备基因芯片或微阵列，或者用于酶切分析；表1用于肉孢子虫18S rRNA基因的PCR和测序引物
*根据Holmdahl(1994)的梭状肉孢子虫系列位置定位4)对各虫种的特异性的扩增片段，用选自表2中限制性内切酶和反应条件进行酶切反应，酶切反应的体积为10-20ul，结果用凝胶检测，表2.用于肉孢子虫18S rRNA基因酶切分析的酶及其酶切条件
或者用表1的引物作为测序引物检测核苷酸序列。
所述的引物选自表3，通过PCR扩增引物所覆盖的肉孢子虫卵囊不同专一靶区域DNA片段，表3用于肉孢子虫18S rRNA基因的PCR和测序引物
*根据Holmdahl(1994)的梭状肉孢子虫系列位置定位。
所述的引物在PCR扩增优化反应条件中，扩增肉孢子虫基因的引物的组合及条件如表4表4.用于肉孢子虫18S rRNA基因的PCR和测序引物的组合及条件
注长时间预变性，即预变性97℃，5分钟后置于冰上，才加1.25U的DNA聚合酶。所述的引物用于肉孢子虫18S rRNA基因的PCR和测序引物进一步为表5所列引物表5用于肉孢子虫18S rRNA基因的PCR和测序引物
在巢式PCR反应中，第一次PCR引物组合为18S 2L、18S 2H，第二次PCR引物组合为18S2L、18S 3H。
所述的酶切反应的限制性内切酶进一步为表6之一种或几种组合表6.用于肉孢子虫18S rRNA基因酶切分析的酶及其酶切条件
本发明具有的效果是人肉样肉孢子虫(S.hominis-like)，梭状肉孢子虫(S.fusiformis)肉孢子虫可以获得7个卵囊的肉孢子虫，对于卵囊的总DNA 18SrRNA基因的PCR-RFLP或18SrRNA基因的PCR-测序分析，能够鉴别出虫种。其它如猪人肉孢子虫(S.suihominis)、米氏肉孢子虫(S.miescheriana)、人肉孢子虫(S.hominis)、毛状肉孢子虫(S.hirsuta)、黄牛枯氏肉孢子虫(S.cruzi)、莱氏内孢子虫(S.levinei)、毛状样肉孢子虫(S.hirsuta-like)、人肉样肉孢子虫(S.hominis-like)、水牛枯氏肉孢子虫(S.cruzi-like)、梭状肉孢子虫(S.fusiformis)及其本属的其他肉孢子虫，根据前期工作的积累应该具有同样效果。
本发明应用浓集法检查肉孢子虫孢子囊，能够收集粪便中数量极为稀少、容易漏检的卵囊和孢子囊；PCR扩增引物与目前报导不同而能够覆盖肉孢子虫卵囊所有基因片断，并将鉴定各虫种的特异性的限制性内切酶用于肉孢子虫卵囊的诊断及其虫种鉴定，从而，提供了卵囊和孢子囊收集、鉴定的全新方法，取得了实质性突破，在细胞分子生物学水平上达到了从孢子囊和卵囊阶段鉴别虫种的目的，具有重要的公共卫生学意义和经济价值。
图1为以18S2L3H为引物几种肉孢子虫卵囊酶酶切反应的胶图。
具体实施例方式
(一)肉孢子虫孢子囊和卵囊分子的诊断方法实施例一酶切分析1(PCR-RFLP)1.1.粪便检查和收集孢子囊和卵囊，包括制备37％ZnSO4硫酸锌漂浮液(ZuSO4·7Rz03319加蒸馏水1000ml)，取粪1g加入37％ZnSO4硫酸锌漂浮液100ml，加入15ml离心管中。置离心管下离。用吸管吸取离心管中最上层的浮液数滴移在载玻片上，以150倍的显微镜检查。用清洁纸片粘起见到的孢子囊和卵囊。将纸片放入1.5ml离心管，-20℃保存。
1.2.通过PCR扩增获得目的DNA片段1.2.1PCR扩增条件1.2.1.1每50ul反应体积，具有10×Buffer 5ul，dNTPs 2ul，BSA 2ul，引物12ul、引物22ul，Taq酶1.25U，总DNA 2ul，余量为去离子水。
1.2.1.2在PCR反应条件中，有的引物需要长时间预变性，即预变性97度，5分钟后置于冰上，加1.25U的DNA聚合酶，有的引物则不需要此步骤，如下表2。
表2.扩增肉孢子虫基因的引物的组合及其扩增条件
用于酶切的反应产物来源于巢式PCR反应产物，第一次PCR18s 2L、18s 2H，第二次PCR 18s 2L、18s 3H为引物组合为下表。
表.扩增肉孢子虫基因的引物的组合及其扩增条件
1.3.PCR反应的目的片段用于限制性内切酶消化反应。
酶切反应原料的体积为10-20ul，其中含有2ul的酶反应10×Buffer，适量DNA和5U酶，余量用双蒸水补足。将上述反应原料混匀，根据不同酶的最适反应温度条件，放入相应温箱，放置一定的时间。如下表3表3.用于肉孢子虫18S rRNA基因酶切分析的酶及其酶切条件
1.4.PCR扩增获得目的DNA片段用于酶切限制性内切酶消化反应结果由不同种获得的分子量不同大小的DNA片段，如下表划分成不同的型
以18S2L3H为引物几种肉孢子虫卵囊酶酶切反应的胶图为附图1。
实施例二酶切分析2(PCR-RFLP)2.1粪便检查和收集孢子囊和卵囊，包括制备37％ZnSO4硫酸锌漂浮液(ZuSO4·7Hz03319加蒸馏水1000ml)，取粪1g加入37％ZnSO4硫酸锌漂浮液100ml，加入15ml离心管中。置离心管下离。用吸管吸取离心管中最上层的浮液数滴移在载玻片上，以130倍的显微镜检查。用清洁纸片粘起见到的孢子囊和卵囊。将纸片放入1.5ml离心管，-20℃保存。
2.2通过PCR扩增获得目的DNA片段2.2.1PCR扩增条件2.2.1.1每50ul反应体积，具有10×Buffer 5ul，dNTPs 2ul，BSA 2ul，引物12ul、引物22ul，Taq酶1.25U，总DNA 2ul，余量为去离子水。
用于酶切的反应产物来源于巢式PCR反应产物，第一次PCR18s 2L、18s 2H，第二次PCR 18s 3L、18s 3H为引物组合为表//。其中，长时间预变性，即预变性97度，5分钟后置于冰上，加1.25U的DNA聚合酶。用发明内容表5的引物组合，按下表的条件扩增。
表//.扩增肉孢子虫基因的引物的组合及其扩增条件
2.3限制性内切酶消化反应，PCR反应的目的片段用于酶切。
酶切反应原料的体积为10-20ul，其中含有2ul的酶反应10×Buffer，适量DNA和5U酶，余量用双蒸水补足。将上述反应原料混匀，根据不同酶的最适反应温度条件，放入相应温箱，放置一定的时间。如下表6表6.用于肉孢子虫18S rRNA基因酶切分析的酶及其酶切条件
实施例三用表1用于肉孢子虫18S rRNA基因研究的PCR和测序的引物，进行测序。
3.1粪便检查和收集孢子囊和卵囊，包括制备37％ZnSO4硫酸锌漂浮液(ZuSO4·7Hz03319加蒸馏水1000ml)，取粪1g加入37％ZnSO4硫酸锌漂浮液100ml，加入15ml离心管中。置离心管下离。用吸管吸取离心管中最上层的浮液数滴移在载玻片上，以200倍的显微镜检查。用清洁纸片粘起见到的孢子囊和卵囊。将纸片放入1.5ml离心管，-20度保存。
3.2通过PCR扩增获得目的DNA片段3.2.1PCR扩增条件3.2.1.1每50ul反应体积，具有10×Buffer 5ul，dNTPs 2ul，BSA 2ul，引物12ul、引物22ul，Taq酶1.25U，总DNA 2ul，余量为去离子水。
3.2.1.2在PCR反应条件中，长时间预变性同1.2.1.2，并与上述发明内容中表2相同。
表2.几种扩增肉孢子虫基因的引物的组合及其扩增条件
3.3PCR反应的结果，目的片段纯化后，测序。
PCR扩增的目的片段-人肉孢子虫28h7ho株18SrRNA基因部分序列核苷酸测序结果人肉孢子虫28h7ho株18SrRNA基因部分序列1 tggataaccg tggtaattct atggctaata catgcgcaaa tactatatct ttacgatata61 gtagtgttta ttagatacag aaccaacacg ctcctttttg ggggtgtcaa aattaggtga
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权利要求
1.肉孢子虫孢子囊和卵囊分子诊断方法，包括以下步骤和内容1)取1-2g的粪便加入适量37％ZnSO4硫酸锌漂浮液离心管中，离心后静置；2)用吸管吸取或用接种环沾取离心管中最上层的浮液数滴移在载玻片上，以大于100倍的显微镜检查，用清洁纸片从玻片或者离心管中粘起孢子囊和卵囊放入另一只离心管低温保存；3)包含其有表1为引物，PCR扩增所覆盖的肉孢子虫孢子囊和卵囊的18SrRNA基因区段1500-2000bp核苷酸或其任何一部份核苷酸片段，或作为引物用于PCR扩增，或作为探针用于杂交反应，或制备基因芯片或微阵列；表1用于肉孢子虫18SrRNA基因的PCR和测序引物
*根据Holmdahl(1994)的梭状肉孢子虫系列位置定位4)对各虫种的特异性的扩增片段，或做酶切分析，或用表1的引物作为测序引物检测核苷酸序列，进行酶切分析时，用选自表2中限制性内切酶和反应条件进行酶切反应，酶切反应的体积为10-20ul，结果用凝胶检测，表2.用于肉孢子虫18SrRNA基因酶切分析的酶及其酶切条件
2.根据权利要求1所述的肉孢子虫孢子囊和卵囊分子诊断方法，其特征在于用选自表3的引物，道过PCR扩增引物所覆盖的肉孢子虫卵囊不同专一靶区域DNA片段，表3用于肉孢子虫18S rRNA基因的PCR和测序引物
*根据Holmdahl(1994)的梭状肉孢子虫系列位置定位。
3.根据权利要求1所述的肉孢子虫孢子囊和卵囊分子诊断方法，其特征在于PCR扩增优化反应条件中，扩增肉孢子虫基因的引物的组合及条件如表4表4.用于肉孢子虫18S rRNA基因的PCR和测序引物的组合及条件
注长时间预变性，即预变性97℃，5分钟后置于冰上，才加1.25U的DNA聚合酶。
4.根据权利要求1所述的肉孢子虫孢子囊和卵囊分子诊断方法，其特征在于用于肉孢子虫18S rRNA基因的PCR和测序引物进一步为表5所列引物的组合表5用于肉孢子虫18S rRNA基因的PCR和测序引物
。
5.根据权利要求4所述的内孢子虫孢子囊和卵囊分子诊断方法，其特征在于在巢式PCR反应中，第一次PCR引物组合为18S 2L、18S 2H，第二次PCR引物组合为18S 2L、18S 3H。
6.根据权利要求1、2、3、4或5所述的肉孢子虫孢子囊和卵囊分子诊断方法，其特征在于酶切反应的限制性内切酶进一步为表6之一种或几种组合表6.用于肉孢子虫18S rRNA基因酶切分析的酶及其酶切条件
。
全文摘要
肉孢子虫孢子囊和卵囊分子的诊断方法，属于寄生虫病的诊断，涉及基因诊断畜禽和人体的球虫与球虫病。本发明目的是改变以包囊检测肉孢子虫的一般方法，提供基因诊断方法。包括取少量粪便加入37％ZnSO
文档编号G01N33/50GK101092646SQ20071006568
公开日2007年12月26日 申请日期2007年2月15日 优先权日2007年2月15日
发明者杨照青, 向征, 左仰贤, 张亚平, 陈新文, 周本江, 雷霖 申请人:昆明医学院